DNA Ricombinante - Simone Damiano Ph.D.

Unità 3
La tecnologia del DNA
ricombinante e la genomica
Qual è la vera portata dei
recenti successi della ricerca in
ambito genetico e dove ci può
portare il progresso nelle
tecniche di analisi e studio del
nostro genoma?
Lezione 1
LA CLONAZIONE GENICA
2
3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene
inserendolo all’interno di un batterio
Le biotecnologie permettono di manipolare gli
organismi o i loro costituenti molecolari per ottenere
prodotti utili
– In particolare, la tecnologia del DNA ricombinante
permette di manipolare il DNA
– I plasmidi sono molecole di DNA circolare che si
riproducono autonomamente nei batteri
– Sono strumenti fondamentali per l’ingegneria genetica e la
clonazione genica in particolare
3
3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene
inserendolo all’interno di un batterio
▪ Come si clona un gene
1. Si isola un DNA plasmidico, che farà da vettore
2. Si isola il DNA donatore da cui si vuole estrarre il gene
3. Si taglia il DNA plasmidico con un enzima di restrizione
4. Si taglia il DNA donatore con lo stesso enzima, ottenendo molti
frammenti
5. Si mescolano DNA plasmidico e DNA donatore
6. Si aggiunge DNA ligasi, che catalizza la formazione di legami
covalenti tra il DNA plasmidico e i frammenti di DNA donatore. Si
ottengono così plasmidi ricombinanti che contengono frammenti del
DNA donatore
7. Si inserisce il DNA plasmidico in una colonia di batteri, ottenendo
batteri ricombinanti
8. Riproducendosi le cellule batteriche daranno origine a cloni di cellule
identiche, ognuno contenente un frammento del DNA donatore
4
BatterioE.coli
Plasmide
Cromosoma
batterico
1
Cellulacontenente
Ilgenechesivuoleclonare
Isolamento
delplasmide
Isolamento
delDNA
2
3
Tagliodelplasmide
conl’enzima
DNA
Genechesivuoleclonare
4
TagliodelDNAcellulare
conlostessoenzima
Gene
chesivuoleclonare
5
6
Plasmide
conDNA
ricombinante
Integrazionedelframmento
diDNAdeldonatorenelplasmide
AggiuntadellaDNAligasi,
chechiudel’anello
formando
legamicovalenti
Igenipossonoessere
inseritiinaltriorganismi
Gene
chesivuoleclonare
7
Inserzionedel
plasmidenelbatterio
(trasformazione)
Batterio
ricombinante
8
Cloni
dicellule
Esempi
diusodeigeni
Duplicazione
delbatterio
incoltura
9
Isolamentodeigeni
odelleproteinedalbatterioclonato
Leproteine
ricavatepossono
essereusate
direttamente
Esempidiuso
delleproteine
BatterioE.coli
Cromosoma
batterico
Plasmide
1
Isolamento
delplasmide
Cellulacontenente
ilgenechesivuoleclonare
2
Isolamento
delDNA
Gene
chesivuoleclonare
6
DNA
BatterioE.coli
Cromosoma
batterico
Plasmide
1
Cellulacontenente
ilgenechesivuoleclonare
Isolamento
delplasmide
3
2
Tagliodelplasmide
conl’enzima
Isolamento
delDNA
Gene
chesivuoleclonare
4
TagliodelDNAcellulare
conlostessoenzima
Gene
chesivuoleclonare
7
DNA
BatterioE.coli
Cromosoma
batterico
Plasmide
1
Cellulacontenente
ilgenechesivuoleclonare
Isolamento
delplasmide
3
2
Tagliodelplasmide
conl’enzima
4
Isolamento
delDNA
Gene
chesivuoleclonare
TagliodelDNAcellulare
conlostessoenzima
Gene
chesivuoleclonare
5
Integrazionedelframmento
diDNAdeldonatorenelplasmide
8
DNA
BatterioE.coli
Cromosoma
batterico
Plasmide
1
Cellulacontenente
ilgenechesivuoleclonare
Isolamento
delplasmide
3
2
Tagliodelplasmide
conl’enzima
4
Isolamento
delDNA
Gene
chesivuoleclonare
TagliodelDNAcellulare
conlostessoenzima
Gene
chesivuoleclonare
Plasmide
conDNA
ricombinante
5
Integrazionedelframmento
diDNAdeldonatorenelplasmide
6
AggiuntadellaDNAligasi,
chechiudel’anello
formando
legamicovalenti
Gene
chesivuoleclonare
9
DNA
Plasmide
conDNA
ricombinante
Gene
chesivuoleclonare
7
Inserzionedel
plasmidenelbatterio
(trasformazione)
Batterio
ricombinante
10
Plasmide
conDNA
ricombinante
Gene
chesivuoleclonare
7
Inserzionedel
plasmidenelbatterio
(trasformazione)
Batterio
ricombinante
8
Duplicazione
delbatterio
incoltura
Cloni
dicellule
11
Esempi
diusodeigeni
Igenipossonoessere
inseritiinaltriorganismi
Plasmide
conDNA
ricombinante
Gene
chesivuoleclonare
7
Inserzionedel
plasmidenelbatterio
(trasformazione)
Batterio
ricombinante
8
Duplicazione
delbatterio
incoltura
9
Isolamentodeigeni
odelleproteinedalbatterioclonato
Leproteine
ricavatepossono
essereusate
direttamente
Cloni
dicellule
Esempidiuso
delleproteine
12
3.2 Il DNA viene “tagliato e incollato” utilizzando
enzimi specifici
▪ Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in
corrispondenza di sequenze specifiche
– Ognuno di questi enzimi lega il DNA in corrispondenza
di una specifica sequenza, il sito di restrizione
– Molti enzimi di restrizione producono frammenti di
restrizione dotati di estremità coesive, cioè a
filamento singolo
– Frammenti dotati di estremità coesive complementari
possono legarsi tra loro
– La DNA ligasi permette di formare legami permanenti
tra i frammenti formando una molecola di DNA
ricombinante
13
Sequenzadiriconoscimento
dell’enzimadirestrizione
1
DNA
L’enzimadirestrizione
tagliailDNAinframmenti
2
Estremitàcoesiva
14
Sequenzadiriconoscimento
dell’enzimadirestrizione
1
DNA
L’enzimadirestrizione
tagliailDNAinframmenti
2
Estremitàcoesiva
Aggiuntadiun
frammentodiDNA
provenienteda
un’altrafonte
3
15
Sequenzadiriconoscimento
dell’enzimadirestrizione
1
DNA
L’enzimadirestrizione
tagliailDNAinframmenti
2
Estremitàcoesiva
Aggiuntadiun
frammentodiDNA
provenienteda
un’altrafonte
3
Due(opiù)frammenti
sileganomediante
appaiamentodellebasi
complementari
4
16
Sequenzadiriconoscimento
dell’enzimadirestrizione
1
DNA
L’enzimadirestrizione
tagliailDNAinframmenti
2
Estremitàcoesiva
Aggiuntadiun
frammentodiDNA
provenienteda
un’altrafonte
3
Due(opiù)frammenti
sileganomediante
appaiamentodellebasi
complementari
4
LaDNAligasi
incollaifilamenti
5
Molecola
diDNAricombinante
17
3.3 I geni clonati possono essere archiviati in
“librerie” genomiche
▪ Una libreria genomica raccoglie tutti i
frammenti di DNA clonati provenienti da un
genoma
▪ I frammenti sono inseriti in vettori necessari alla
loro conservazione e duplicazione
– Plasmidi batterici
– DNA fagico
– BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
18
Genoma
tagliato
Plasmide
DNA
oppur
Clone
Libreria
Clone
Libreria
19
3.4 La trascrittasi inversa può essere utilizzata per
produrre geni da clonare
▪ È possibile creare una libreria che contiene tutti i
geni espressi da un organismo partendo dal suo
mRNA
– Una volta isolato l’mRNA si utilizza l’enzima
trascrittasi inversa per sintetizzare i filamenti di
DNA complementari a quelli di mRNA
– Si elimina l’RNA con un enzima che lo degrada
– Si sintetizzano filamenti di DNA complementari a
quelli già ottenuti
– Il risultato sono dei frammenti di DNA a doppio
filamento detti cDNA (DNA complementare)
20
3.4 La trascrittasi inversa può essere utilizzata per
produrre geni da clonare
▪ Una libreria di cDNA è utile per studiare i
geni responsabili delle funzioni specializzate
di un particolare tipo di cellule
▪ Essendo prive di introni, le molecole di
cDNA sono più corte e “maneggevoli”
rispetto alle versioni complete dei geni
21
Nucleodellacellula
Esone Introne
DNA
diungene
eucariote
Esone
Introne Esone
1 Trascrizione
Trascritto
diRNA
2 Splicingdell’RNA
mRNA
3 Isolamentodell’mRNAdalla
Provetta
cellulaeaggiuntaditrascrittasi
inversa;sintesidelfilamento
diDNAcomplementare
Trascrittasiinversa
Sintesidel
filamentodicDNA
4 Demolizionedell’RNA
5 Sintesidelsecondo
filamentodiDNA
cDNAdelgene
(senzaintroni)
3.5 Le sonde nucleotidiche riconoscono cloni
contenenti geni specifici
▪ Per individuare un determinato gene all’interno di
una libreria genetica possiamo usare una sonda
nucleotidica
– Costituita da DNA o RNA fluorescente o marcato
radioattivamente
– Contiene una breve sequenza nucleotidica
complementare a una porzione del gene di interesse
23
3.5 Le sonde nucleotidiche riconoscono cloni
contenenti geni specifici
▪ Come si può usare una sonda nucleotidica
– Si trasferiscono alcune cellule dalle colonie di batteri di
una libreria genica su un disco di carta da filtro
– Si tratta il disco in modo da lisare le cellule e separare
i filamenti di DNA
– Si aggiunge una soluzione contenente la sonda
– La colonia contenente il gene di interesse risulterà
marcata
– Si prelevano cellule della colonia di partenza e si coltivano
in modo da ottenere grandi quantità del gene di interesse
24
Sonda
radioattiva
DNA
asingolofilamento
AggiuntadiDNA
asingolofilamento
provenientedauna
libreriagenomica
L’appaiamento
complementare
marcailgene
desiderato
25
Lezione 2
GLI ORGANISMI
GENETICAMENTE MODIFICATI
26
3.6 Cellule e organismi ricombinanti sono usati per
produrre grandi quantità di prodotti genici specifici
- Le cellule e gli organismi ricombinanti ottenuti con
la tecnologia del DNA sono usati per sintetizzare
proteine e altre molecole utili
- È possibile utilizzare diversi tipi di organismi
ricombinanti a seconda delle caratteristiche
della molecola che si desidera produrre
– Procarioti: per esempio Escherichia coli
– Facilmente manipolabili geneticamente ed economici
– Possono secernere le sostanze prodotte nel terreno di
coltura
27
3.6 Cellule e organismi ricombinanti sono usati per
produrre grandi quantità di prodotti genici specifici
– Eucarioti
– Saccharomyces cerevisiae
– Può produrre e secernere complesse proteine eucariotiche
– Colture di cellule di mammiferi
– Sono indispensabili per produrre glicoproteine
– Mammiferi ricombinanti
– Possono produrre molecole utili e secernerle nel propprio
latte
28
29
30
La tecnologia del DNA ha trasformato l’industria
farmaceutica e la ricerca biomedica
COLLEGAMENTOsalute
▪ La tecnologia del DNA ricombinante è molto
utilizzata per la produzione di medicinali e la
diagnosi di malattie
- Terapie ormonali
– Ormoni identici a quelli umani sicuri, puri ed economici
– Per esempio: insulina, HGH, TPA
- Diagnosi
– Diagnosi precoce di malattie ereditarie
– Diagnosi di infezioni da virus difficilmente identificabili
(HIV)
31
La tecnologia del DNA ha trasformato l’industria
farmaceutica e la ricerca biomedica
COLLEGAMENTOsalute
- Vaccini
– La tecnologia del DNA ricombinante è utile sia
per ottenere i vaccini che per produrli su larga
scala
32
33
3.7 Gli organismi geneticamente modificati stanno
trasformando l’agricoltura e l’allevamento
▪ OGM (Organismi Geneticamente Modificati)
hanno un patrimonio genetico modificato
▪ Organismi transgenici contengono materiale
genetico derivante da altre specie
34
3.7 Gli organismi geneticamente modificati stanno
trasformando l’agricoltura e l’allevamento
▪ Piante GM modificate per
– Resistere a erbicidi, parassiti
– Maggiore produttività
– Migliori valori nutritivi
▪ Animali GM
– Attualmente sono utilizzati solo nella ricerca biologica
o per produrre molecole utili in campo farmaceutico
35
Agrobacteriumtumefaciens
DNAcontenente
ilgeneutile
Plasmide
Ti
Sito
direstrizione
1
Inserimentodel
genenelplasmide
mediantel’enzima
direstrizione
elaDNAligasi
Plasmide
Ti
ricombinante
36
Agrobacteriumtumefaciens
Cellulavegetalemodificata
DNAcontaining
genefordesiredtrait
Plasmide
Ti
Sito
direstrizione
1
Inserimentodel
genenelplasmide
mediantel’enzima
direstrizione
elaDNAligasi
Plasmide
Ti
ricombinante
2
Introduzione
delplasmide
incellule
Vegetali
DNAcontenenteilnuovo
Coltivate
geneinuncromosoma
invitro
dellapianta
37
Agrobacteriumtumefaciens
Cellulavegetalemodificata
DNAcontaining
genefordesiredtrait
Plasmide
Ti
Sito
direstrizione
1
Inserimentodel
genenelplasmide
mediantel’enzima
direstrizione
elaDNAligasi
Plasmide
Ti
ricombinante
2
3
Introduzione
Sviluppo
delplasmide
dellapianta
incellule
Vegetali
DNAcontenenteilnuovo
Coltivate
geneinuncromosoma
invitro
dellapianta
38
Piantaconil
nuovocarattere
Chi ha paura degli OGM
COLLEGAMENTOambiente
- Esistono diverse norme e procedure indispensabili
per limitare i pericoli legati all’utilizzo di OGM
- Timori comuni
– Piante GM possono introdurre allergeni negli alimenti
– Le proteine transgeniche possono essere testate
– Prodotti contenenti OGM devono indicarne la presenza in
etichetta
- Rischi per le specie naturali
– Trasmissione dei geni modificati a specie selvatiche
– Riduzione della biodiversità
39
40
Geni di ricambio
COLLEGAMENTOsalute
▪ Terapia genica: curare malattie genetiche
modificando i geni degli individui malati
▪ Una possibile procedura
– Si clona il gene normale e si inserisce in un vettore
retrovirale
– Si prelevano cellule del paziente interessate dalla
malattia e si infettano con il vettore
– Il retrovirus inserisce nel genoma delle cellule il
proprio DNA insieme al gene clonato
– Le cellule vengono reinserite nel paziente
41
Geni di ricambio
COLLEGAMENTOsalute
▪ Sperimentazione clinica
– Nel 2000 è stata avviata una sperimentazione clinica
di terapia genica su 10 bambini malati di SCID
– 9 hanno avuto miglioramenti significativi, 3 si sono
ammalati di leucemia (1 è morto), in 2 casi si è visto
che il sito di integrazione del gene era la causa della
leucemia
▪ Problemi tecnici e dubbi etici
– Come integrare i meccanismi di controllo genico
– Come evitare il rischio di danneggiare altre funzioni
– Eugenetica e altri dubbi etici
42
Geneclonato
(allelenormale)
1
Inserimentodelgenenormale
inunretrovirusvettore
Acidonucleicovirale
Retrovirus
2
Unacelluladelmidolloosseo
vieneinfettataconilvirus
3
IlDNAviralesiintegra
nelcromosomadellacellula
Celluladimidolloosseodelpaziente
Midollo
osseo
4
Iniezione
dellecellulenelpaziente
43
44
Lezione 3
I METODI DI ANALISI DEL DNA
45
3.8 Ogni individuo è caratterizzato
da un diverso profilo del DNA
▪ Il DNA profiling è una procedura che prevede
l’analisi di frammenti di DNA per stabilire se essi
derivino da un particolare individuo
– Vengono confrontati marcatori genetici che variano
da persona a persona
– I marcatori contenuti nei campioni biologici vengono
amplificati
– L’amplificazione permette di avere a disposizione
quantità sufficienti per il confronto
46
1 Isolamento
Scenadeldelitto
Sospettato1
Sospettato2
delDNA
2 Amplificazione
delDNA
dimarcatori
selezionati
3 Confronto
deiDNA
amplificati
47
3.8
Ogni individuo è caratterizzato
da un diverso profilo del DNA
STEP BY STEP
Perché il profilo genetico viene ottenuto
confrontando specifici marcatori genetici e non interi
genomi?
48
3.9 Per amplificare le sequenze di DNA si usa la
reazione a catena della polimerasi (PCR)
▪ La PCR permette di amplificare specifiche sequenze
di DNA
▪ Si basa sull’utilizzo di una coppia di primer
– Brevi sequenze nucleotidiche complementari alle due
estremità della sequenza da amplificare
– Funzionano da punto di partenza per la sintesi delle
nuove molecole di DNA
▪ Fasi della PCR
– Il campione viene riscaldato per aprire le doppie eliche
– Il campione viene raffreddato facendo appaiare i primer
con le sequenze bersaglio
– Una DNA polimerasi sintetizza nuovi filamenti di DNA
allungando i primer
49
3.9 Per amplificare le sequenze di DNA si usa la
reazione a catena della polimerasi (PCR)
- Applicazioni della PCR
– Amplificare DNA preistorico
– Indagini scientifiche sulla scena di crimini
– Diagnosi prenatale di malattie genetiche
– Diagnosi di infezioni di virus difficilmente identificabili
50
Ciclo1
produce2molecole
DNAestratto
dalgenoma
3ʹ
3ʹ
5ʹ
5ʹ
3ʹ
Sequenza
bersaglio
1 Conilcalore
siseparano
ifilamenti
diDNA
5ʹ
3ʹ
5ʹ
5ʹ
3ʹ
2
5ʹ
3ʹ
5ʹ
LaDNA
Nellamiscela
3 polimerasi
raffreddataiprimer
aggiunge
formanolegami
nucleotidi
idrogenoconle
all’estremità3
estremitàdelle
diogniprimer
sequenzebersaglio
5ʹ
3ʹ
5ʹ
Primer
5ʹ
3ʹ
NuovoDNA
51
Ciclo2
produce4molecole
Ciclo3
produce8molecole
52
3.9 Per amplificare le sequenze di DNA si usa
la reazione a catena della polimerasi (PCR)
STEP BY STEP
Perché la PCR è adatta all’analisi di DNA molto
antichi?
53
3.10 L’elettroforesi su gel separa le molecole di DNA
in base alle loro dimensioni
▪ L’elettroforesi su gel del DNA
– Campioni di DNA vengono posti a un capo di una lastra
di gel
– Un elettrodo negativo e posto dal lato del DNA, uno
positivo dall’altro
– Le molecole di DNA migrano verso il polo positivo
– Più sono grandi più si muovono lentamente nel gel
– Quando la corrente viene staccata, sul gel si osserva una
serie di bande ognuna corrispondente a frammenti di
DNA della stessa lunghezza
54
Misceladiframmenti
diDNAdidiversedimensioni
Molecole
piùlunghe
(piùlente)
Generatore
elettrico
Molecole
piùcorte
(piùveloci)
Gel
Elettroforesicompletata
55
3.10 L’elettroforesi su gel separa le molecole di DNA
in base alle loro dimensioni
STEP BY STEP
Perché durante l’elettroforesi le molecole di DNA
migrano verso il polo positivo?
Perché le grandi molecole si spostano più lentamente
di quelle piccole?
56
3.11 Il DNA ripetitivo è utile per ottenere
i profili genetici
- DNA ripetitivo: sequenze nucleotidiche presenti nel
genoma in moltissime copie
– Le STR sono brevi sequenze ripetute molte volte di
seguito presenti nel genoma umano
- Analisi delle STR
– Il numero di ripetizioni delle STR in un particolere sito
del genoma varia da persona a persona
– Per ottenere il profilo genico di una persona, si
analizzano 13 siti specifici
57
3.11 Il DNA ripetitivo è utile per ottenere
i profili genetici
- Analisi delle STR
– Il numero di ripetizioni delle STR in un particolare sito
del genoma varia da persona a persona
– Per ottenere il profilo genico di una persona, si
analizzano 13 siti specifici
– Attraverso appositi primer si amplificano le sequenze di
DNA contenute in questi siti con una PCR
– I prodotti della PCR vengono sottoposti a elettroforesi
– La lunghezza dei frammenti ottenuti permette di
determinare il numero di STR presenti in ogni sito e
confrontarli nei diversi campioni
58
SitodiSTR1
DNAprelevato
sullascena
deldelitto
IlnumerodiSTR
corrisponde
SitodiSTR2
IlnumerodiSTR
noncorrisponde
DNAdell’individuo
sospettato
59
DNA
prelevatosullascena
deldelitto
DNA
dell’individuo
sospetto
60
La parola ai geni
COLLEGAMENTOsocietà
▪ Alcune applicazioni del profilo genetico
– Indagini di polizia
– Determinare la paternità o i legami parentali
– Identificazione di resti umani
– Identificazione di specie animali e vegetali
▪ Attendibilità del test del DNA
– Salvo errori procedurali, la probabilità che due individui
a caso abbiano lo stesso profilo genetico è di 1 su 10
miliardi
61
62
3.12 Per individuare le differenze nelle sequenze di
DNA si possono usare i RFLP
▪ SNP: sono variazioni presenti nel genoma umano
che interessano singole coppie di basi
▪ RFLP: sono particolari SNP presenti su siti di
restrizione che alterano la lunghezza dei
frammenti di DNA ottenibili con il taglio da parte
dell’enzima di restrizione
– L’analisi dei RFLP viene effettuata separando
mediante elettroforesi su gel i frammenti di restrizione
ottenuti dai campioni che si vogliono confrontare
63
Aggiunta
deglienzimi
direstrizione
Campione 1
Campione 2
w
Taglio
z
x
Taglio
Taglio
y
y
Frammenti
piùlunghi
z
x
Frammenti
piùcorti
w
y
y
64
3.13 Tramite il metodo Sanger è possibile determinare
la sequenza di un frammento di DNA
- Il sequenziamento con il metodo di Sanger si basa
sulla possibilità di interrompere la duplicazione di
un filamento di DNA e individuare l’ultimo
nucleotide inserito
65
1. ilframmentodiDNAdicuisidesideradeterminarelasequenzaviene
separatoneiduefilamentichelocompongonoaumentandolatemperatura
evienepoimescolatoinunaprovettaaireagentinecessariperlasintesidel
DNA
66
2. lasintesideinuovifilamentidiDNAiniziaall’estremità3delfilamento
stampoeprocedefinchénonvienecasualmenteincorporatoun
didesossiribonucleotide,chenebloccal’allungamento;allafinesiotterrà
unamisceladiframmentidivarielunghezzecheterminanoconun
nucleotidemarcato
67
3. iframmentivengonoseparatiper
mezzodiun’elettroforesi,cheavviene
all’internodiuncapillarepienodigel
inquestomodoifilamentimigranolungoilcapillareversoilpolonegativodisponendosi
secondolalorolunghezzaeunlettorefluorescentepuòidentificarealloropassaggio
iltipodinucleotidechecorrispondeall’ultimaposizionediciascunframmento
68
4. idatipossonoesserelettisottoformadiunospettrogrammache
indicalasequenzacomplementarealfilamentostampo
69
Lezione 4
LA GENOMICA
70
3.14 La genomica è lo studio scientifico di interi
genomi
▪ Un genoma è l’intero corredo di geni di un
organismo
– I primi studi genomica si sono focalizzati su organismi
semplici come i procarioti
– Gli studi recenti hanno permesso il sequenziamento del
genoma di molti eucarioti, compreso quello umano
▪ La comparazione di genomi di diversi organismi
– Permette di individuare le relazioni evolutive
– Aiuta a individuare le funzioni dei geni
71
72
3.15 Si possono ottenere molte informazioni diverse
dallo studio dei genomi
▪ Una volta sequenziato il genoma di un organismo
– Si individuano gli Open Reading Frames
– In caso di geni codificanti si può dedurra le sequenza
amminoacidica
– Si identificano le sequenze regolatrici
▪ Queste informazioni possono essere analizzate con
due approcci
– Funzionale: approfondendo il ruolo di ciascun gene
– Comparativo: confrontando i genomi di diversi organismi
73
74
3.15 Si possono ottenere molte informazioni diverse
dallo studio dei genomi
- Oltre al genoma di un organismo è possibile studiare
– Il suo trascrittoma: l’insieme di molecole di RNA
effettivamente trascritte
– Il suo proteoma: l’insieme di tutte le proteine espresse
- L’analisi di informazioni così ricche e complesse è
resa possibile dagli strumenti forniti dalla
bioinformatica
75
Cacciatori di geni
COLLEGAMENTOsocietà
- Il Progetto Genoma Umano è un progetto
pubblico di ricerca che ha lo scopo di determinare
l’intera sequenza nucleotidica del genoma umano
– Il DNA è stato prelevato da 5 donatori statisticamente
rilevanti
– Lo scopo era quello di identificare la sequenza e la
posizione di ogni gene presente nel nostro genoma
– Nel 2000 ha raggiunto il suo scopo
76
Cacciatori di geni
COLLEGAMENTOsocietà
- Celera Genomics è una società privata che ha
lavorato allo stesso scopo, in parallelo con un
sistema diverso
– Con questo metodo ha sostenuto costi più di 10 volte
inferiori rispetto al Progetto Genoma Umano
– Pur iniziando in un secondo momento è arrivata ad
ottenere il sequenziamento completo in
contemporanea
77
78
Cacciatori di geni
COLLEGAMENTOsocietà
- Risultati e applicazioni
– Gli esseri umani hanno circa 2100 geni che
rappresentano solo l’1,5 % del DNA
– Il resto è composto da introni, sequenze regolatrici, e
in gran parte da sequenze ripetute ed elementi
trasponibili
– La mappatura del genoma umano ha permesso di
individuare centinaia di geni associati a malattie
79
Esoni(regionideigenicodificantiper
unaproteinaotrascritteinrRNAotRNA)
(1,5%)
DNAripetitivo
comprendente
elementi
trasponibili
esequenze
affini(44%)
Introni
esequenze
regolatrici(24%)
DNA
noncodificante
(15%)
DNA
ripetitivo
privodi
elementi
trasponibili
(15%)
80
3.16 Il metodo di sequenziamento shotgun applicato a interi
genomi può fornire rapidamente una grande quantità di dati
▪ Il Progetto Genoma Umano ha applicato una
procedura in tre stadi
– Mappa genetica a bassa risoluzione creata
analizzando 5000 RFLP
– Mappa fisica indicante il numero di basi compreso
tra un marcatore e l’altro
– Sequenziamento dell’insieme di frammenti di DNA
precedentemente mappati
81
Cromosoma
Frammentazionemediante
enzimadirestrizione
FrammentidiDNA
Sequenziamento
deiframmenti
Allineamento
deiframmenti
Riassemblaggiodella
sequenzacompleta
82
3.16 Il metodo di sequenziamento shotgun applicato a interi
genomi può fornire rapidamente una grande quantità di dati
STEP BY STEP
Qual è il vantaggio principale del metodo shotgun?
83
3.17 I genomi contengono indizi sulla divergenza
evolutiva tra esseri umani e scimpanzé
allalucedell’evoluzione
- Il confronto tra genomi di specie affini permette di
fare luce su eventi evolutivi recenti
- Confronti tra specie più lontane permettono di
indagare la storia evolutiva più remota
84
3.17 I genomi contengono indizi sulla divergenza
evolutiva tra esseri umani e scimpanzé
allalucedell’evoluzione
- Confronto tra genoma umano e di scimpanzé
– Differenza dell’1,2% per sostituzioni di singole basi
– Differenza del 2,7% per inserzioni o delezioni di
porzioni più estese
– Una importante differenza riguarda il gene FOXP2
– Sembra abbia subito un veloce cambiamento nella specie
umana
– Mutazioni associate a problemi nel linguaggio
– Le differenze individuate potrebbero essere importanti per
spiegare l’evoluzione del linguaggio esclusiva della nostra
specie
85