Lez_11_12_M._seq._instabili, M._difetto_ripar._15_10_2015

Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare
GENETICA
a.a.2015-2016
Pier Franco Pignatti
15.10.2015
Lezioni N. 11-12
Malattie da mutazioni dinamiche e malattie da difetto di riparazione del DNA
(Neri-Genuardi cap. 11, 17)
Espansione di triplette, premutazioni, anticipazione.
Xeroderma Pigmentoso, Atassia Teleangiectasia, Anemia di Fanconi, S. Bloom, S.
Lynch
MALATTIE DA ESPANSIONE DI
SEQUENZE INSTABILI
Espansione di ripetizioni instabili
Es: FRAXA
NEJM 332:1499, 1995
Instabilità delle ripetizioni
In blu: interruzioni che
rendono gli alleli stabili
Mancano interruzioni e gli alleli
si espandono: alleli instabili
Es: SCA
Nota una eccezione alla regola: una grossa espansione di un
allele paterno interrotto in una grave forma di SCA-2 con
esordio infantile ( Kobayshi H et al, 2011)
Strachan e Read, Genetica Molecolare Umana UTET 2000
Meccanismo di espansione
CAG:Gln
Malattie da mutazioni dinamiche
DM2
XL
AR
AD
AD
>40 m. neurologiche, neurodegenerative, neuromuscolari
Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999; JRGatchel & H Zoghbi 2005
Sindrome dell’X fragile (FXS)
S. di Martin-Bell (1943). La forma più comune di disabilità
intellettiva ereditaria. Una delle più frequenti cause note di disabilità
intellettiva e autismo. Affetti 1:4.000 maschi, 1:6.000 femmine.
Sito fragile Xq27.3 (FRAXA) in terreno
privo di folato (Lubs 1969). Alterazione
della replicazione del DNA
Disabilità intellettiva (XLID) sindromica
102 geni associati con XLID
Lubs HA et al. 2012
Espansione di FMR1
1991: identificazione del gene FMR1 e della
prima mutazione dinamica (cioè che si modifica
nel passaggio da una generazione all’altra)
Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999
Il paradosso di Sherman
Si notino un trasmettitore sano e diverse femmine affette per inattivazione
sbilanciata della X. Stephanie Sherman descrisse il fenomeno dell’
aumento del N casi col passare delle generazioni (aumento della
penetranza), facendo notare che nelle famiglie affette da FXS i fratelli
delle donne portatrici sono sani in proporzione superiore a atteso mentre i
figli delle portatrici sono affetti nella proporzione attesa (paradosso di
Sherman). Espansione preferenziale nella linea femminile.
Fu YH et al. 1991 «Variation of the CGG repeat at the fragile X site
results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox»
Funzione del gene FMR1
FMRP è una proteina che lega l’RNA e regola la
traduzione di un gruppo di mRNA dei dendriti
neuronali inibendo l’attività di altri geni
Topi con gene Fmr1 inattivato hanno perdita della
proteina FMRP e alterata maturazione della
trasmissione glutamatergica durante il periodo
critico perinatale
FMRP è necessaria per il normale procedere della
maturazione sinaptica durante lo sviluppo. La sua
assenza causa una eccessiva sintesi proteica nei
dendriti postsinaptici e una alterazione della
funzionalità sinaptica
Espansione di triplette gene FMR1
Santoro MR et al, Ann Rev Pathol Mech Dis 2012
Premutazioni FMR1
La premutazione (55-200 CGG) causa aumento di trascritti e
diminuzione di FMRP probabilmente a causa di un sequestro da
parte dell’espansione CGG di proteine che legano l’mRNA.
Può dare :
Sindrome con Tremore e Atassia associata a X fragile (FXTAS)
Malattia neurodegenerativa a inizio tardivo. La penetranza nei
maschi di più di 70 anni è >50%, mentre nelle donne è minore
Insufficenza ovarica primaria associata a X fragile (FXPOI)
in circa il 20% delle donne portatrici della premutazione.
Menopausa precoce
Atassia di Friedreich (FRDA)
La sindrome atassica ereditaria più frequente nelle
popolazioni caucasoidi (3-4:100.000, AR).
Insorgenza pubertà, perdita progressiva coordinazione
muovimenti ed equilibrio
Deficit di energia: anche cardiomiopatia ipertrofica che
può condurre a morte precoce
Gene frataxina (FXN) mappato cr. 9q13
Triplette GAA nel primo introne: da 35-40 normale a
70-1000 espansioni causano silenziamento genico
con grave deficit di frataxina
Espansioni meno grandi sono correlate con un esordio
più tardivo
Frataxina
Proteina mitocondriale che mantiene omeostasi Fe
mitocondriale ed ha ruolo protettivo dal danno nucleare
FRDA: il deficit di frataxina altera la funzione
mitocondriale determinando sovraccarico di Fe,
diminuita produzione di ATP, difetto di funzionamento
di neuroni e cardiomiociti; instabilità cromosomica,
aumento della sensibilità a mutageni chimici e specie
reattive dell’ossigeno (ROS)
Tentativi terapeutici: rimozione Fe mitocondri mediante
sostanze chelanti come il deferiprone, contrasto allo
stress ossidativo con antiossidanti, aumento
dell’espressione genica con eritropoietina e inibitori
della deacetilasi istonica
Poliglutaminopatie (polyQ)
Un gruppo di patologie comprendente 9 malattie
neurodegenerative da espansione
Il tratto poliglutaminico conferisce alle proteine
un guadagno di funzione tossico che porta a
inizio tardivo della malattia e perdita
progressiva di neuroni in regioni specifiche
del SNC
Possibile contributo di modificazioni posttraduzionali della proteina
Alcune Poliglutaminopatie
NEJM 340:1974, 1999
Malattia di Huntington (HD)
George Huntington (1872) descrive la malattia AD ad
insorgenza tardiva caratterizzata da disabilità motoria
progressiva e deterioramento mentale. Prevalenza 3-7:10.000
Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007
La localizzazione del gene di HD
La figura mostra parte di una grande famiglia venezuelana che ha
permesso di localizzare il gene sul cromosoma 4 nel 1983. Analisi di
linkage con RFLP e il marcatore G8, situato a 3cM dal gene
Gusella et al Science 225:1320,1984
La identificazione del gene IT15
N: 11-36 triplette
HD: 40-121 triplette
Gene IT15 (Important Transcript 15, in seguito chiamato Huntingtina,
HTT) identificato nel 1993. Nel 1994 “Uno studio mondiale della
mutazione HD. La sensibilità e la specificità di misurare le ripetizioni
CAG” conclude che la lunghezza delle ripetizioni è un marcatore
sensibile e specifico della ereditarietà della mutazione
Kremer B et al, NEJM 1994
Amplificazione somatica del gene HTT
50 copie
20 copie
S: DNA da sperma. L: DNA da linfociti. Si nota una particolare
instabilità delle triplette ripetute nella meiosi maschile. Infatti si può
avere insorgenza precoce della malattia trasmessa dal padre. L’età di
esordio è inversamente correlata alla lunghezza della espansione,
anche nel tessuto cerebrale
Nature Genet 387,1993
Possibile meccanismo patogenetico poliQ
Formazione di inclusioni nucleari neuronali di aggregati proteici
non specifici tossici per i neuroni. La morte cellulare progressiva
porta alla malattia a insorgenza tardiva.
Distrofia miotonica (DM)
La figura mostra amimia e aspetto scavato del volto, ptosi,
iposviluppo muscolo mandibola e sternomastoideo. DM o Malattia di
Steinert (1909): ipotonia muscolare con miotonia (debolezza della
contrazione muscolare e difficoltà rilassamento dopo contrazione),
deperimento, anomalie della conduzione cardiaca ecc. La più
frequente fra le distrofie muscolari a ereditarietà autosomica
(1:8.000). Gene DMPK, distrofia miotonica protein chinasi.
Espansione (CTG)n al 3’UTR
Numero di triplette DMPK ed età di esordio
Triplette nella porzione 3’non tradotta del gene. Forme
cliniche: C: congenita; G: giovanile; A: adulta; SC: subclinica
(nessun segno clinico tranne elettromiogramma anomalo o
altro). Genitore che trasmette: madre; padre; ignoto. La
forma congenita è trasmessa solo per via materna. Vi è
correlazione fra numero di triplette e gravità della malattia
Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999
Anticipazione in DM
In nero allele N (5-37 triplette); in rosso allele espanso (50-1.000
triplette). Anticipazione: l’età di esordio diminuisce con il passare delle
generazioni mentre aumenta la gravità delle manifestazioni cliniche
Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999
Guadagno di funzione dell’RNA in DM
Espansione di sequenze non tradotte: CTG (DM1) o CCTG (DM2)
AJHG 74:793, 2004
Patogenesi di malattie da espansione
A: Inibizione trascrizionale (FXS), B: RNA tossico (DM),
C: Proteina tossica (Poli-Gln)
Strachan e Read, Genetica Molecolare Umana, Zanichelli 2012
MALATTIE DA DIFETTO DI
RIPARAZIONE DEL DNA
Conseguenze dei danni del DNA
ROS: specie reattive dell’ossigeno; IR: radiazioni ionizzanti; ICL:
legami crociati interfilamenti; DSB: rotture dei doppi filamenti;
CPD: dimeri pirimidinici ciclobutanici; 6,4,-PP: 6,4 fotoprodotti
Wolters S e Schumacher B 2013
Risposta al danno del DNA (DDR)
: danno; a: tolleranza; b: riparazione
Friedberg E, Nature 2003
Alcune malattie AR da difetto di riparazione del DNA
Gruppi di
complementazione
8*
1
17
1
*XP: 7 proteine NER (Es. gruppo D: DNA elicasi; gruppo E: DNA BP), più la
DNA polimerasi eta per TLS
Test di complementazione
Cellule di un paziente sono trasformate con DNA estratto da
un altro paziente. Si esegue un test per determinare il deficit
di riparazione del DNA. Si osserva un fenotipo mutato se le
mutazioni sono nello stesso gene, oppure il ripristino del
fenotipo normale se le mutazioni sono in un altro gene
Strachan e Read, Genetica umana molecolare, UTET 2001
Xeroderma Pigmentosum (XP)
RR Ca cute: 10.000 x in pazienti XP sotto a 20 anni di età!
Friedberg E, DNA Repair, Freeman 1985
Difetto di riparazione in cellule XP
c.normali irradiate
c.XP irradiate
Test UDS (sintesi non programmata di DNA): dopo irradiazione UV si nota
che in cellule XP non c’è sintesi riparativa. Difetto NER in XP. Difetto TLS in
XPV, la forma variante di XP (mutazioni di Pol eta, responsabile della
sintesi translesione di dimeri pirimidinici ciclobutanici)
Malattie del complesso dello XP-CS-TTD
hanno difetto di riparazione e trascrizione
7 malattie del complesso
XP-CS-TTD (rettangoli),
tutte con ipersensibilità
agli UV.
Difetti in 11 geni (ovali)
Complesso di trascrizione
TFIIH che interagisce con
componenti del sistema NER
Kraemer KH, Nature Genetics 2004
Atassia Teleangiectasia (AT)
Neurodegenerazione progressiva con estrema radiosensibilità
e predisposizione al linfoma. La dilatazione anomala dei piccoli
vasi sanguigni si osserva facilmente nella congiuntiva.
Friedberg, DNA Repair, Freeman 1985
Difetto di riparazione in cellule AT
Test crescita cellulare
Test incorporazione H3T
Gene ATM (AT-Mutated), sensore del danno al DNA. La inattivazione di questa
proteina chinasi produce un difetto nella risposta alle rotture del DNA (DSBs)
Friedberg E, DNA Repair, Freeman 1985
Anemia di Fanconi
Pancitopenia, difetti scheletrici (aplasia radiale),
iperpigmentazione, bassa statura, microftalmia e altri dismorfismi
Difetto di riparazione in cellule FA
Test del diepossibutano (DEB): si nota instabilità genomica
dovuta a un difetto di riparazione dei legami crociati
Sindrome di Bloom (BS)
Bassa statura, sensibilità alla luce solare, immunodeficenza,
instabilità cromosomica, predisposizione ai tumori. Gene
BLM: DNA elicasi. Instabilità genomica con aumento della
frequenza degli scambi fra cromatidi fratelli
Scambio di cromatidi fratelli (SCE) in cellule BS
“cromosomi arlecchino” >5-10x in BS
Friedberg E et al DNA repair and mutagenesis, ASM Press 2006
Difetti di riparazione in tumori e nell’invecchiamento
Hoeijmakers JHJ, DNA Damage, Aging and Cancer, NEJM 2009
Difetto di riparazione nella S. di Lynch (LS) o tumore
ereditario del colon non poliposico (HNPCC)
LS/HNPCC è la causa più comune di Ca ereditario del colon (CRC)
Difetto MMR
Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007
Instabilità dei microsatelliti (MSI,MIN) in LS
Il tumore ha 1 nuovo allele per il marcatore BAT26 (doppie
frecce), e 2 nuovi alleli per il marcatore D2S123 (triple frecce)
Lynch HT e A de la Chapelle NEJM 2003
Riparazione del DNA e durata della vita
Kornberg A, DNA Replication, Freeman 1980
Sindromi progeroidi e difetto di riparazione
DNA elicasi
La durata della vita è diminuita nelle sindromi progeroidi che si manifestano
con invecchiamento precoce e insorgenza prematura di malattie solitamente
associate con individui molto più anziani: S.Werner (osteoporosi,
aterosclerosi, diabete, capelli bianchi), S.Cockayne (cataratta), Trico Tio
Distrofia (osteoporosi, cataratta, capelli fragili), AT (immunodeficenza,
capelli grigi). Durata media della vita: WS 50 anni, CS 12 anni, TTD 10
anni, AT 20 anni. Tutte malattie con difetto di riparazione