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The handle http://hdl.handle.net/1887/20020 holds various files of this Leiden University
dissertation.
Author: Andreoni, Alessio
Title: Shedding light on biological redox processes - Single molecule studies of Cucontaining oxidoreductases
Issue Date: 2012-10-24
Chapter 8. Summary
Riassunto
Lo studio di processi di trasferimento elettronico e reazioni di ossidoriduzione
è importante al fine di comprendere una vasta gamma di processi biochimici.
Ad oggi le tecniche di ricerca in grado di studiare singolarmente, una per
una, le molecole (single-molecule techniques) costituiscono uno strumento
prezioso ed elegante per indagare reazioni chimiche di rilevanza biologica,
e ciò è reso possibile dalla loro vasta diffusione e dai progressi tecnologici
che le hanno rese fruibili ad un ampio pubblico di ricercatori nel campo scientifico. In questa tesi viene presentata una ricerca effettuata su reazioni
di trasferimento di elettroni e di ossidoriduzione per mezzo di tecniche a
singola molecola. I principali protagonisti sono due proteine: l’azzurrina,
estratta da Pseudomonas aeruginosa, e la blu nitrito reduttasi, estratta
da Alcaligenes xylosoxidans. Entrambe contengono uno ione rame che,
nella forma ossidata, conferisce loro un caratteristico ed intenso colore blu,
mentre nella forma ridotta è incolore. Questa peculiarità fa sı̀ che sia possibile utilizzare un metodo basato sulla fluorescenza per testare lo stato
di ossidazione del centro rame. Una sonda fluorescente il cui spettro di
emissione si sovrappone allo spettro di assorbimento del centro rame nello
stato ossidato viene attaccata covalentemente alla struttura polipeptidica.
Se il cofattore è nello stato ossidato, avviene un fenomeno di trasferimento
di energia per risonanza dalla sonda fluorescente verso il centro metallico
(FRET). All’opposto, se il cofattore è nello stato ridotto non vi è alcuna
risonanza: in questo caso si osserva un’elevata fluorescenza, mentre nel
primo caso, per via del trasferimento di energia, la fluorescenza osservata è
ridotta. Fluttuazioni nella fluorescenza della sonda sono perciò interpretate
come fluttuazioni dello stato di ossidazione della proteina.
Nei Capitoli 2 e 3 è presentato uno studio dei prodotti ottenuti dalla
reazione di etichettatura dell’azzurrina con una sonda fluorescente. Legando
covalentemente il label fluorescente ATTO 655 all’azzurrina si ottengono
una serie di prodotti che possono essere separati per mezzo di cromatografia
a scambio ionico. I diversi prodotti infatti differiscono l’uno dall’altro per la
posizione della sonda sulla superficie della proteina: questo conferisce loro
un diverso comportamento su colonna cromatografica, permettendone cosı̀
la separazione. Il processo di separazione e caratterizzazione dei prodotti
di reazione è descritto nel Capitolo 2. Le tre maggiori specie di addotto
azzurrina-ATTO 655 individuate sono: una recante la sonda sulla Lisina
122, molto vicina al centro rame, una recante la sonda sulla Alanina 1, Nterminale della proteina, ed infine una mistura contenente due specie, di cui
una etichettata sulla Lisina 128 e l’altra sulla Lisina 24 o 27. Nel Capitolo
3 è presentato lo studio della reazione di legame di ATTO 655 all’azzurrina
in funzione del pH e viene mostrato come regolando sapientemente tale variabile, sia possibile modificare le quantità relative dei prodotti di reazione.
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Sulle specie isolate per mezzo di cromatografia son stati effettuati ulteriori
studi utilizzando la Spettroscopia di Correlazione di Fluorescenza (Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS). Queste ricerche hanno evidenziato
che è possibile osservare una reazione di trasferimento elettronico tra ATTO
655 e ione rame qualora il primo sia legato alla Lisina 122. La velocità di
tale reazione è stata misurata e confrontata con i risultati di calcoli teorici.
È stato cosı̀ possibile evidenziare due potenziali meccanismi tramite cui
un elettrone può essere scambiato tra ATTO 655 e ione rame: il primo è
il passaggio diretto attraverso Lisina 122 e Metionina 121, mentre il secondo prevede il ripiegamento della sonda sulla superficie della proteina in
maniera tale che si metta in contatto diretto con l’Istidina 117, uno dei
leganti del rame.
Gli esperimenti presentati nel Capitolo 4 sono volti a studiare una
forma dimerica di azzurrina. Due monomeri di questa proteina sono stati
legati covalentemente in una conformazione che rende possibile lo scambio
di elettroni tra loro. Il dimero è stato caratterizzato, strutturalmente, in un
precedente lavoro. Le informazioni disponibili sulla sua struttura e sulla
reazione intramolecolare di trasferimento di elettroni rendono il dimero
adatto come sistema-modello per testare dei metodi di investigazione a
singola molecola. Negli esperimenti descritti in questo capitolo, la sonda
fluorescente ATTO 655 è stata legata ad uno dei monomeri costituenti il
dimero. Attraverso l’utilizzo dell’approccio FRET sopra descritto, è possibile monitorare lo stato di ossidazione dello ione rame più vicino al label.
Tramite esperimenti di FCS è stato possibile mostrare che combinando tale
tecnica con il metodo FRET (FCS-FRET) è possibile studiare la reazione
di trasferimento elettronico all’interno del dimero di azzurrina. La velocità
di reazione misurata è di (kET =) 9 × 103 s−1 e l’ampiezza dell’effetto è
stata caratterizzata in funzione dello stato di ossidazione del costrutto.
L’enzima blu nitrito reduttasi (bNiR) catalizza la riduzione dello ione
nitrito a monossido di azoto. Esso contiene due centri rame: uno è detto
Tipo 1 (T1) e l’altro Tipo 2 (T2). Il primo è il sito di ingresso degli elettroni
nella proteina, questi vengono poi trasferiti al secondo centro rame (T2).
Il sito T2 è il centro a cui si lega il nitrito e dove avviene il processo
catalitico. In letteratura vi è un continuo dibattito intorno alla domanda,
con che ordine avvengono i due eventi sopra descritti: avviene prima il
trasferimento di elettroni da T1 a T2 e solo dopo il nitrito si lega al centro
rame o viceversa? Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha proposto un
ordine casuale (random sequential mechanism, RSM), e ciò vuol dire che il
nitrito può legarsi al T2 sia prima che dopo il trasferimento di un elettrone
da T1 a T2. Il meccanismo può essere parzialmente influenzato variando il
pH o la concentrazione di substrato.
Nel Capitolo 5 sono esposti i risultati ottenuti tramite esperimenti
a singola molecola sull’enzima bNiR, immobilizzato in gel di agarosio. È
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Chapter 8. Summary
stato possibile osservare direttamente lo stato di ossidazione del centro T1
durante l’attività di catalisi, ottenendo cosı̀ una visione unica del meccanismo di funzionamento enzimatico. Ciò è stato possibile seguendo il
comportamento di bNiR “una molecola alla volta”. L’enzima è stato studiato per mezzo di Microscopia Confocale a Scansione (Scanning Confocal
Microscopy, SCM), combinata con la formazione di immagini di tempo
di decadimento della fluorescenza nel campione. L’enzima bNiR (estratto
da Alcaligenes xylosoxidans) immobilizzato è stato analizzato utilizzando
una scansione a piccoli passi. Ad ogni posizione la fluorescenza emessa da
ogni singola molecola è stata registrata. Attraverso l’utilizzo del tempo
di decadimento della fluorescenza emessa viene ricavato lo stato di ossidazione del centro rame T1 della molecola esaminata. Inoltre, osservando
l’evoluzione temporale dello stato di ossidazione è stato possibile ottenere
informazioni cinetiche sul comportamento catalitico, sottolineando cosı̀ un
nuovo aspetto di bNiR: apparentemente l’enzima, durante la catalisi, è
suddiviso in due popolazioni. La distribuzione di queste popolazioni è
influenzata dalla concentrazione del substrato e nel capitolo vengono presentati alcuni dettagli cinetici di ciascuna. Tale comportamento può essere
spiegato alla luce del meccanismo casuale, RSM, ma la vera novità presentata qui è che ciascheduna molecola di enzima segue una via di catalisi per
diversi cicli, mostrando cosı̀ un “effetto memoria”.
Nell’ultimo capitolo, Capitolo 6, son presentati ulteriori esperimenti
a singola molecola effettuati su bNiR. In particolare, è stato studiato il
comportamento enzimatico in funzione del pH. Analogamente a quanto descritto nel Capitolo 5, l’enzima è stato immobilizzato in una matrice di
agarosio e l’acquisizione di dati è avvenuta tramite SCM. L’approccio qui
utilizzato risulta però diverso: al posto che formare un immagine dell’intero
campione passo-passo, sono state monitorate solo le posizioni in cui era presente l’enzima raccogliendo cosı̀ un flusso ininterrotto di dati da ciascuna
molecola. In tal maniera è stata ottenuta una maggior risoluzione temporale. I dati presentati nel Capitolo 6, pur essendo uno studio preliminare,
permettono di discernere il differente comportamento dell’enzima a pH 6.0
e pH 7.5. L’attività dello stesso in funzione di pH e concentrazione di substrato é stata (parzialmente) studiata e i risultati supportano lo schema
RSM già citato. I dati raccolti potranno poi essere sottoposti ad ulteriori
analisi, capaci di rivelare maggiori dettagli sul ciclo enzimatico di bNiR.
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