università di pisa

UNIVERSITÀ DI PISA
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso di Laurea Magistrale in
Biologia Molecolare e Cellulare
TESI DI LAUREA MAGISTRALE
Anno Accademico 2012-2013
Uso di cellule staminali embrionali di topo
per lo studio del differenziamento della corteccia cerebrale:
il ruolo di BMP, Wnt e Shh nell’acquisizione dell’identità neuronale
Candidato:
Relatore:
Alessandro Vanni
Dr. Federico Cremisi
Sommario
Elenco delle figure e tabelle .................................................................................................. 5
Riassunto ............................................................................................................................... 8
INTRODUZIONE ............................................................................................................... 10
1.1 Cellule Staminali ....................................................................................................... 11
1.2 Sviluppo Embrionale nei mammiferi ........................................................................ 15
1.3
Regionalizzazione precoce del sistema nervoso ................................................... 18
1.4
Neurulazione ......................................................................................................... 20
1.5
Sviluppo e morfologia della corteccia .................................................................. 23
1.6
Via di segnalazione di Wnt/β-catenina ................................................................. 28
1.7
Via di segnalazione di BMP ................................................................................. 30
1.8
Via di segnalazione di Sonic Hedgehog ............................................................... 32
1.9
Colture cellulari e protocolli di neuralizzazione................................................... 33
1.10
Ciclo cellulare e differenziamento ........................................................................ 36
1.11
Scopo della tesi ..................................................................................................... 40
MATERIALI E METODI ................................................................................................... 42
2.1
Coltura di cellule staminali ................................................................................... 43
2.1.1
Tripsinizzazione ............................................................................................ 44
2.1.2
Congelamento e scongelamento delle cellule ............................................... 46
2.2
Protocollo di induzione neurale ............................................................................ 48
2.3
Estrazione di RNA ................................................................................................ 52
2.4
Retrotrascrizione ................................................................................................... 53
2.5
Real Time q-PCR.................................................................................................. 54
2.6
Progettazione dei primers da PCR........................................................................ 59
2.7
Immunocitochimica su monostrato ...................................................................... 61
2.8
Acquisizione ed elaborazione immagini............................................................... 63
2.9
Citofluorimetria a flusso ....................................................................................... 65
RISULTATI ........................................................................................................................ 68
3.1
Protocollo di corticalizzazione ............................................................................. 69
3.2
Analisi dei marcatori corticali in seguito alle inibizioni di Wnt e BMP .............. 71
3.2.1
Le colture hanno memoria dei trattamenti applicati durante lo step2 ........... 75
3.2.2
Immunocitorivelazione di marcatori corticali in colture WiBi ..................... 76
3.3
Modulazione del ciclo cellulare ............................................................................ 79
3.3.1
Effetto del SAG e Ciclopamina sul ciclo cellulare ....................................... 80
3.3.2
Controllo degli effetti del SAG e Ciclopamina sul differenziamento ........... 83
3.3.3
Ciclo cellulare e generazione di neuroni corticali ......................................... 85
CONCLUSIONI .................................................................................................................. 89
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................. 95
Elenco delle figure e tabelle
Figura 1.1 - Cellule staminali durante la vita dell'uomo.…………………………………. 12
Figura 1.2 - Self-renewal e divisioni asimmetriche di una cellula staminale…………….. 13
Figura 1.3 - Differenziamento in vitro delle ESC per la terapia cellulare………………... 14
Figura 1.4 - Segmentazione nei mammiferi………………………………………………. 16
Figura 1.5 - Transizione epitelio-mesenchimatica durante la formazione del mesoderma.. 17
Figura 1.6 - Regionalizzazione precoce del sistema nervoso in Xenopus……………….. 19
Figura 1.7 - La neurulazione nei mammiferi……………………………………………... 21
Figura 1.8 - Regionalizzazione D/V del tubo neurale…………………………………….. 22
Figura 1.9 - Sviluppo del sistema nervoso centrale nei mammiferi……………………… 22
Figura 1.10 - Movimenti oscillatori dei nuclei della Zona Ventricolare…………………. 23
Figura 1.11 - La corticogenesi nei mammiferi…………………………………………… 24
Figura 1.12 - Strati della corteccia e loro interconnessioni………………………………. 26
Figura 1.13 - Teorie classiche sulla formazione delle aree funzionali nella corteccia…… 27
Figura 1.14 - Meccanismo molecolari della via di segnalazione di Wnt…………………. 29
Figura 1.15 - Meccanismo molecolari della via di segnalazione di BMP………………... 31
Figura 1.16 - Via di segnalazione di Shh…………………………………………………. 32
Figura 1.17 - Rosetta neurale……………………………………………………………... 36
Figura 1.18 - Ciclo cellulare……………………………………………………………… 37
Figura 2.1 - Camera di Bürker……………………………………………………………. 45
Figura 2.2 - Protocollo di neuralizzazione……………………………………………….. 48
Figura 2-3 - Corpi Embrioidi…………………………………………………………….. 49
Figura 2.4 - Rosette neurali ………………………………………………………………. 50
Figura 2.5 - Gel di elettroforesi per il controllo dell’integrità dell’RNA………………… 53
Figura 2.6 - Coltura di cellule neuronali marcate con immunocitochimica……………… 64
Figura 2.7 - Dot Plot SSC/FSC nell’analisi al FACS……………………………………... 66
Figura 2.8 - Distribuzione delle intensità di fluorescenza cellulare misurata al FACS…... 67
Figura 2.9 - Dot Plot per l’analisi del ciclo cellulare al FACS…………………………… 67
Figura 3.1 - Protocollo di corticalizzazione………………………………………………. 69
Figura 3.2 - Marcatori del patterning A/P………………………………………………… 71
Figura 3.3 - Analisi di RT-PCR di marcatori corticali a fine Step 2……………………… 72
Figura 3.4 - Piano sperimentale per l’analisi degli effetti delle inibizioni d BMP e Wnt nel
differenziamento neuronale…………………………………………………... 73
Figura 3.5 - Analisi mediante RT-PCR a fine step3 di marcatori corticali……………….. 74
Figura 3.6 - Analisi mediante RT-PCR di marcatori corticali per il controllo del
mantenimento temporale……………………………………………………... 75
Figura 3.7 - Analisi mediante immunocitochimica di marcatori corticali al termine dello
step3…………………………………………………………………………... 77
Figura 3.8 - Analisi mediante immunocitochimica di marcatori corticali tardivi………… 78
Figura 3.9 - Azione dei principali inibitori/attivatori della via di Shh……………………. 79
Figura 3.10 - Piano sperimentale per il controllo degli effetti di Sag e Cyc sul ciclo
cellulare……………………………………………………………………... 81
Figura 3.11 - Effetti sul ciclo cellulare di Sag e Cyc al termine del Checkpoint1………... 81
Figura 3.12 - Effetti del Sag e Cyc sul ciclo cellulare in tutte e le finestre temporali
analizzate……………………………………………………………………. 82
Figura 3.13 - Piano sperimentale per l’analisi degli effetti del SAG e della Cyc sull’asse
D/V…………………………………………………………………………. 83
Figura 3.14 - Analisi mediante RT-PCR degli effetti del SAG e della Cyc sull'asse D/V. 84
Figura 3.15 - Piano sperimentale per l’analisi mediante immunocitochimica di marcatori
corticali in seguito a trattamento con SAG o Cyc………………………….. 85
Figura 3.16 - Analisi mediante immunocitochimica degli effetti del SAG e Cyc su
marcatori corticali…………………………………………………………... 86
Figura 3.17 - Analisi mediante immunocitochimica di marcatori corticali in colture trattate
con mimosina……………………………………………………………….. 88
Figura 4.1 - L’inibizione di Wnt e BMP favorisce la comparsa di marcatori dei neuroni
della corteccia………………………………………………………………. 92
Tabella 2.1 - Composizione del PBS……………………………………………………... 43
Tabella 2.2 - Composizione del mezzo di coltura delle cellule staminali………………… 44
Tabella 2.3 - Composizione del mezzo di inattivazione della tripsina…………………… 45
Tabella 2.4 - Composizione del mezzo minimo di coltura N2B27……………………….. 51
Tabella 2.5 - Composizione del mix di retrotrascrizione…………………………………. 54
Tabella 2.6 - Fasi di una reazione di RT-PCR……………………………………………. 55
Tabella 2.7 - Composizione del mix di reazione di una RT-PCR………………………… 56
Tabella 2.8 - Elenco delle sequenze dei primers utilizzati nelle RT-PCR………………... 60
Tabella 2.9 - Composizione della soluzione di bloccaggio……………………………….63
Tabella 2.10 - Elenco anticorpi utilizzati negli esperimenti di immunocitochimica……... 63
Tabella 2.11 - Composizione della soluzione di Ioduro di Propidio……………………... 66