Veterinaria, Anno 17, n. 1, Febbraio 2003
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VALUTAZIONE DELL’EFFICACIA
DELLA VACCINAZIONE PER LA MALATTIA
DI NEWCASTLE NEL CANARINO
(SERINUS CANARIUS)
CALOGERO TERREGINO1, MARTA VASCELLARI2,
FRANCO MUTINELLI2, ILARIA CAPUA1
1
Centro di Referenza Nazionale per la Malattia di Newcastle e l’Influenza Aviaria
Reparto di Istopatologia - Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, viale dell’Università 10, 35020 Legnaro (PD)
2
Riassunto
Durante l’anno 2000 l’Italia è stata colpita da un’epidemia di malattia di Newcastle (ND). Fra i provvedimenti previsti
per il controllo di tale epidemia, vi è stata l’implementazione di un programma di vaccinazione obbligatorio in tutte le
specie sensibili, compresi gli uccelli da gabbia. Nel presente lavoro si è voluto valutare la sensibilità del canarino verso
stipiti di virus della malattia di Newcastle altamente patogeni e testare l’efficacia di programmi vaccinali standardizzati
per questa specie. Si è deciso di utilizzare un programma vaccinale costituito da più interventi (con vaccini vivi e spenti), in modo da avere una risposta immunitaria efficace e duratura che garantisse una protezione clinica ed una riduzione significativa dello shedding virale. La prova di challenge ha confermato la scarsa sensibilità del canarino all’infezione con virus della ND altamente patogeni. L’efficacia del protocollo vaccinale sperimentato è stata molto elevata, infatti,
in nessuno dei canarini sottoposti a vaccinazione sono stati rilevati sintomi riferibili ad infezione sistemica o localizzata
da NDV. L’analisi statistica ha evidenziato una differenza significativa (p<0,01) tra il gruppo vaccinato e il gruppo di
controllo.
Summary
In 2000 Italy was affected by an epidemic of Newcastle disease (ND). Among the restrictive measures to control the spread
of the disease was an increase of compulsory vaccination program for all susceptible species, included pet birds. The aim of
this study was to test the susceptibility of canary to high pathogen NDV and the efficacy of a vaccination program specific for
this specie. A vaccination program with live and inactivated vaccines was performed in order to have an effective and enduring
immunity able to protect the birds from the clinical disease and to decrease the viral shedding. The efficacy of the vaccination
was performed on 15 birds by using a high pathogen NDV strain. The challenge confirmed the low susceptibility of the canary
to NDV infection. The efficacy of the vaccination program performed was very high and no vaccinated canary showed clinical
signs of Newcastle disease after challenge. The difference between the vaccinated group and the control group was statistically significant (p<0.01).
“Articolo ricevuto dal Comitato di Redazione il 22/7/2002 ed accettato per pubblicazione dopo revisione il 14/11/2002”.
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Valutazione dell’efficacia della vaccinazione per la malattia di Newcastle nel canarino (Serinus canarius)
INTRODUZIONE
Vaccini
La malattia di Newcastle (Newcastle disease, ND) o Pseudopeste aviaria, è sostenuta da Paramyxovirus tipo 1 appartenenti al genere Rubulavirus, famiglia Paramyxoviridae, ordine
Mononegavirales. Rappresenta una delle malattie aviarie più
diffuse a livello mondiale nonché una delle maggiori cause di
perdite per il pollame determinando, nelle specie sensibili,
episodi di mortalità con picchi superiori al 50%.
La ND è inclusa nella lista A dell’Office International
des Epizooties (OIE) ed in Italia è disciplinata dal DPR
657/96 che costituisce il regolamento di attuazione della
direttiva 92/66/CEE relativa alle misure comunitarie di
lotta contro la malattia di Newcastle.
Il virus della ND è in grado di infettare almeno 236 diverse specie di uccelli appartenenti a 27 dei 50 ordini esistenti 2. La sua patogenicità è estremamente variabile in
funzione del ceppo virale, dose infettante, via di infezione,
specie, età e condizioni ambientali. Tra le specie più sensibili, soprattutto in giovane età, risultano il pollo ed il tacchino, mentre gli uccelli acquatici sono considerati resistenti alla forma clinica.
Durante l’anno 2000 l’Italia è stata colpita da un’epidemia di ND 3. Fra i provvedimenti previsti per il controllo
di tale epidemia, vi è stata l’implementazione di un programma di vaccinazione obbligatorio in tutte le specie
aviarie allevate, allo scopo di ridurre la popolazione recettiva all’infezione. Oltre alla vaccinazione dei volatili da
reddito allevati intensivamente e a scopo familiare, è stata
imposta anche la vaccinazione degli uccelli da gabbia come prerequisito per la partecipazione alle fiere e alle mostre ornitologiche.
I vaccini disponibili in commercio sono registrati per le
specie da reddito, e non esistono dati pubblicati su protocolli vaccinali per il canarino. Inoltre, dagli scarsi dati disponibili in letteratura sulla ND nel canarino risulterebbe
che questa specie sia parzialmente refrattaria all’infezione
4,5
nonostante sia da tempo conosciuto il ruolo degli uccelli
da voliera nella diffusione di questi virus 6.
Gli obiettivi del presente lavoro sono stati quelli di verificare la sensibilità del canarino verso stipiti ND altamente
patogeni e di valutare l’efficacia di programmi vaccinali
standardizzati per questa specie allestiti con vaccini disponibili in commercio.
Vaccino vivo attenuato contro la pseudopeste aviaria
BIO-VAC B1: Fatro S.p.A., preparato con il ceppo B1 di
Hitchner, titolo > 106,5 DIE50/dose.
Vaccino inattivato contro la Pseudopeste aviaria OLVAC: Fatro S.p.A., emulsionato in olio minerale, titolo
non inferiore a 100 DP50/dose.
MATERIALI E METODI
Animali utilizzati per la prova
Canarini di colore, lipocromici e melanici, di 5 mesi di età.
Gli animali sono stati alimentati con mangime, pastoncino a base di uova ed acqua ad libitum per tutta la durata
della sperimentazione. Tutti gli animali sono risultati sieronegativi alla ND all’inizio della prova.
Virus di challenge
Virus della ND altamente patogeno (Indice di Patogenicità Intracerebrale = 1,8) 3015/V00 6, isolato in Italia nel
corso dell’epidemia del 2000.
Protocollo di challenge
In considerazione del fatto che questi animali sono allevati come animali d’affezione e che spesso un soggetto può vivere per oltre 10 anni, si è optato per valutare l’efficacia di
programmi vaccinali costituiti da più interventi (con vaccini
vivi e spenti), in modo da avere una risposta immunitaria efficace e duratura che garantisse una protezione clinica ed
una riduzione significativa dello shedding virale.
Non potendo disporre, per motivi etici, di un numero elevato di soggetti da sottoporre alle prove sperimentali, si è divisa la sperimentazione in due fasi, come riportato di seguito.
Fase 1. Somministrazione dei vaccini vivi attenuati: valu tazione della risposta immunitaria umorale in funzione della
via di somministrazione:
In questa prima fase si è voluto individuare la via di somministrazione dei vaccini attenuati in grado di indurre una migliore risposta immunitaria. A tal proposito sono stati utilizzati 45
soggetti divisi in tre distinti gruppi in cui i vaccini attenuati sono stati somministrati per 2 volte a distanza di 21 giorni mediante tre modalità: per instillazione oculo-nasale, per spray
(aerosolizzazione) ed in acqua di bevanda. Dopo tre settimane
dalla seconda vaccinazione è stato valutato il titolo anticorpale
mediante prova di inibizione dell’emoagglutinazione (HI) 8.
Per le motivazioni indicate in precedenza e sulla base
dei risultati delle indagini sierologiche, si è deciso di adottare un unico schema vaccinale per la prosecuzione dell’esperimento tramite infezione sperimentale (challenge) con
virus della malattia di Newcastle altamente patogeno.
Fase 2. Challenge
Sono stati utilizzati 22 canarini suddivisi in due gruppi e
alloggiati in gabbie per uccelli da voliera sistemate negli
stabulari del Centro di Referenza Nazionale per la malattia
di Newcastle e per l’influenza aviaria (Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Legnaro, Padova):
GRUPPO 1: 15 animali vaccinati secondo il seguente
schema:
• Giorno 1: 1a somministrazione di vaccino vivo attenuato mediante spray a grosse gocce
• Giorno 21: 2a somministrazione di vaccino vivo attenuato mediante spray a grosse gocce
• Giorno 35: vaccino inattivato somministrato per via
sottocutanea nella regione dorsale del collo alla dose di
0,02 ml/10 g di peso vivo (circa 0,05 ml)
• Giorno 56: 2a somministrazione di vaccino inattivato
per via sottocutanea.
GRUPPO 2: 7 soggetti utilizzati come gruppo di controllo
non sottoposti ad alcuna vaccinazione, sieronegativi alla ND.
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Valutazione dello shedding virale
Dopo 30 giorni dal quarto intervento vaccinale è stato
effettuato un prelievo ematico da tutti i canarini (circa 200
µl per soggetto dalla giugulare destra da cui è stato possibile ricavare in media circa 50 µl di siero) per il controllo
del titolo anticorpale mediante prova di HI secondo la direttiva 92/66/EEC. Dopo 7 giorni dal prelievo tutti i canarini sono stati infettati sperimentalmente con 100 µl di una
sospensione virale del virus di challenge alla dose di 108,5
EID50 somministrati per via nasale ed orale.
La valutazione dell’eliminazione virale è stata effettuata
mediante l’esame virologico delle feci dei due gruppi. La
raccolta delle feci è stata eseguita al 2°, 4°, 8°, 14°, 24°,
40° e 60° giorno post-challenge.
La raccolta è stata effettuata su fogli di carta sterili depositati per circa 1 ora sul fondo della gabbia. Le feci sono state quindi decontaminate e sottoposte ad esame virologico 8.
Valutazione dell’efficacia del programma
vaccinale
RISULTATI
L’efficacia del programma vaccinale è stata valutata mediante esame clinico, anatomo-patologico, istologico e virologico. I
dati raccolti sono stati sottoposti ad analisi statistica mediante
il test di Fisher. I soggetti sono stati tenuti sotto osservazione
per tutta la durata dell’esperimento per evidenziare eventuali
sintomi clinici riferibili alla malattia di Newcastle. I soggetti venuti a morte sono stati sottoposti ad esame anatomo-patologico, e da questi canarini sono stati prelevati cervello, polmoni,
trachea, stomaco muscolare, stomaco ghiandolare, intestino,
pancreas e reni per l’esame istologico. Porzioni di cervello, cervelletto, polmoni ed intestino sono stati opportunamente trattati per l’esame virologico in uova embrionate di pollo SPF 8.
La somministrazione dei vaccini vivi attenuati e dei vaccini spenti non ha mai provocato reazioni indesiderate negli animali, nonostante i prodotti commerciali siano registrati per il pollo.
Le risposte anticorpali alle vaccinazioni effettuate con i
vaccini vivi attenuati somministrati in 3 diverse modalità
sono riportate in Tabella 1. La media geometrica dei titoli
sierologici dei gruppi vaccinati per instillazione oculo-nasale, in acqua di bevanda e per spray è stata rispettivamente di 22, 9 e 29.
L’andamento della sintomatologia clinica nei due gruppi
è riassunto nelle Tabelle 2 e 3.
Tabella 1
Titoli sierologici, ottenuti mediante prova di HI, nei tre gruppi di canarini vaccinati per due volte con vaccini vivi attenuati
somministrati con tre differenti modalità
< 1:16
Vaccinati per via oculo-nasale
Vaccinati con acqua di bevanda
Vaccinati per spray
3/13
7/13
3/15
1:16
1:32
10/13
5/13
12/15
8/13
5/13
10/15
1:64
3/13
1/13
4/15
1:128
1:256
1:512
1/13
0/13
1/15
0/13
0/13
1/15
0/13
0/13
1/15
GMT
22
9
29
GMT= Geometric mean titre
Tabella 2
Gruppo di controllo, canarini non vaccinati
Sintomi clinici
Normale
Malato
Gravemente malato
Morto
Giorni successivi al challenge
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
7
0
0
0
7
0
0
0
7
0
0
0
6
0
1
0
4
2
0
1
3
2
1
1
3
1
1
2
3
0
1
3
2
1
0
4
2
1
0
4
2
0
1
4
2
0
0
5
2
0
0
5
2
0
0
5
2
0
0
5
Tabella 3
Gruppo in trattamento, canarini vaccinati
Sintomi clinici
Normale
Malato
Gravemente malato
Morto
Giorni successivi al challenge
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
15
0
0
0
15
0
0
0
15
0
0
0
15
0
0
0
15
0
0
0
15
0
0
0
15
0
0
0
14
1
0
0
14
1
0
0
14
1
0
0
14
1
0
0
15
0
0
0
15
0
0
0
15
0
0
0
15
0
0
0
80
Valutazione dell’efficacia della vaccinazione per la malattia di Newcastle nel canarino (Serinus canarius)
Esame clinico, anatomo-istopatologico e virologico
Nel gruppo non vaccinato di controllo, i primi sintomi
costituiti da arruffamento delle piume e riluttanza al movimento (Fig. 1), sono comparsi in quarta giornata p.i.
Con il progredire della malattia sono comparsi anche sintomi nervosi caratterizzati da perdita di equilibrio e tendenza a ribaltarsi sul dorso (Fig. 2). L’efficacia della vaccinazione, intesa come la capacità del vaccino di evitare
l’insorgenza della malattia clinicamente manifesta, nel
gruppo degli animali vaccinati, è stata molto elevata. Infatti, in nessuno dei canarini sottoposti a vaccinazione sono stati rilevati sintomi riferibili ad infezione sistemica o
localizzata da virus della ND. Solo un soggetto ha mostrato per qualche giorno un lieve stato di malessere generale costituito da apatia e tendenza ad arruffare il piumaggio. L’analisi statistica dei dati ha confermato una
differenza significativa (p< 0,01) tra i due gruppi sottoposti al challenge.
All’esame necroscopico dei soggetti deceduti non è stata
riscontrata alcuna alterazione macroscopica dei visceri.
L’esame istopatologico eseguito nei soggetti deceduti o soppressi in fase pre-agonica, ha evidenziato congestione epatica,
splenica, renale, pancreatica e polmonare. In un solo animale
è stata rilevata degenerazione idropica del fegato. Nel sistema
nervoso centrale di quattro canarini è stato rilevato il tipico
quadro istopatologico della ND caratterizzato da manicotti
linfocitari perivasali (Figg. 3 e 4) ed aree di necrosi associate a
gliosi e spongiosi della sostanza bianca (Fig. 5).
FIGURA 3: Manicotti perivasali linfocitari nel ponte. E.-E., 20x.
FIGURA 1 - Il soggetto sul fondo della gabbia presenta segni di malessere generale.
FIGURA 4: Manicotto perivasale linfocitario nella sostanza bianca del
cervelletto. E.-E., 20x.
FIGURA 2 - Sintomatologia nervosa.
FIGURA 5 - Spongiosi e necrosi della sostanza bianca del cervelletto.
E.-E., 20x.
Veterinaria, Anno 17, n. 1, Febbraio 2003
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Tabella 4
Titoli sierologici nei canarini vaccinati valutati tramite prova di HI
< 1:16
30 gg. dopo la 4a vaccinazione
21 gg. dopo il challenge
0/15
0/13
1:16
1:32
1:64
15/15
15/15
13/15
15/15
9/15
13/13
1:128
1:256
7/15
9/15
2/13
2/15
1:512
GMT
0/15
0/13
67
97
GMT= Geometric mean titre
Il virus è stato isolato dal sistema nervoso centrale di
tutti i cinque canarini venuti a morte, e dall’apparato respiratorio di tre di questi cinque soggetti. Non è stato mai
isolato virus dall’intestino, e relativamente allo shedding virale, tutti i campioni esaminati (sia dei soggetti vaccinati
sia dei soggetti del gruppo di controllo) sono risultati negativi all’esame virologico.
Esame sierologico:
La risposta anticorpale alle vaccinazioni effettuate con i
vaccini vivi attenuati in associazione con i vaccini spenti è
illustrata in Tabella 4.
L’effetto booster atteso negli animali vaccinati e sottoposti al challenge è stato minimo (Tab. 4). Nei due canarini
del gruppo di controllo sopravvissuti all’infezione sperimentale e sottoposti a prelievo ematico 3 settimane dopo il
challenge si è registrata una modesta sieroconversione con
titoli all’HI di 1:32 e 1:64.
DISCUSSIONE
La prova di challenge ha confermato la bassa sensibilità del
canarino all’infezione con virus della ND. Infatti, nonostante
la dose utilizzata sia stata molto elevata, due soggetti immunologicamente scoperti sono sopravvissuti all’infezione.
L’osservazione della sintomatologia clinica e delle lesioni istopatologiche, in associazione con il dato virologico,
indicano che la ND nel canarino può avere caratteristiche
di uno spiccato neurotropismo. Rimane da determinare se
questa caratteristica è da ricondurre alla specie oppure allo stipite virale utilizzato nella prova di challenge.
Lo schema vaccinale utilizzato, è stato in grado di proteggere i soggetti vaccinati dalle manifestazioni cliniche.
Per avere un buon titolo protettivo è stato necessario sottoporre gli animali ad un programma vaccinale iniziale intenso, al quale occorrerebbe far seguire, almeno per i primi anni di vita, un richiamo con vaccino spento annuale o
comunque effettuato almeno entro le quattro settimane
che precedono la riproduzione e la partecipazione a gare,
esposizioni e raduni. Relativamente alla via di somministrazione dei vaccini vivi attenuati il miglior risultato è stato ottenuto con la somministrazione del vaccino mediante
spray a grosse gocce, che risulta anche un metodo di facile
applicazione. Un altro motivo per preferire la somministrazione del vaccino con il metodo spray è rappresentato
dal fatto che, oltre ad un più elevato titolo di anticorpi circolanti, si favorisce l’instaurarsi di una più valida immunità locale a livello della mucosa dell’apparato respiratorio, abituale porta d’ingresso del virus della ND.
Tabella 5
Esito degli esami virologici
Canarino n. 1
Canarino n. 2
Canarino n. 3
Canarino n. 4
Canarino n. 5
Cervello
Polmone
Intestino
+
+
+
+
+
+
negativo
+
+
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
Si può quindi dedurre che un adeguato piano vaccinale
aumenti la resistenza del canarino verso la forma clinica
della ND. Non è stato possibile valutare se la profilassi
vaccinale riduce anche lo shedding virale, in quanto non è
stato isolato virus neanche dalle feci dai soggetti non vaccinati. Dai dati raccolti risulta che la via di eliminazione
del virus ND nel canarino non avviene in maniera analoga
a quella di altre specie 3, cioè per via enterica. L’isolamento
del virus dall’apparato respiratorio porterebbe a pensare
che sia la principale via di eliminazione in questa specie.
Purtroppo la valutazione dell’escrezione virale per via respiratoria, mediante esame virologico di tamponi tracheali,
in uccelli così piccoli risulta impraticabile in vivo. Comunque, essendo stata la risposta immunitaria indotta dal vaccino in grado di impedire la generalizzazione dell’infezione, la riduzione dell’eliminazione virale nei soggetti vaccinati appare verosimile. È noto, dagli studi effettuati in altre specie, che l’eliminazione virale non può essere annullata dalla vaccinazione1 e che pertanto la vaccinazione rimane uno strumento di prevenzione da applicare sempre
in associazione ad idonee misure di profilassi diretta.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare lo staff del Laboratorio
di Virologia per l’effettuazione degli esami virologici e siero logici e le dott.sse Marica Toson e Marzia Mancin per l’ana lisi statistica dei dati.
Parole chiave
Malattia di Newcastle, canarino, vaccinazione.
Key words
Newcastle disease, canary, vaccination.
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Valutazione dell’efficacia della vaccinazione per la malattia di Newcastle nel canarino (Serinus canarius)
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