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SCIENTIFIC PAPERS
CONTRIBUTI SCIENTIFICI
Interferenza da acido niflumico/morniflumato nella determinazione dei
cannabinoidi su autoanalizzatore ILAB 600
Arcangelo de Gironimo, Vincenzo Musolino*
Ospedale Principale Marittimo "G. Venticinque" - Laboratorio Analisi - Servizio di Tossicologia -Taranto
*Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale - Dipartimento Provinciale di Brindisi
ABSTRACT
Interference from niflumic acid/morniflumate in cannabinoids determination on ILAB 600 automatic
analyzer
We describe an experimental investigation showing that some drugs give false positive results when metabolites of
cannabinoids are measure in urine samples by an immunochemical method, with the ILAB 600 instrument. The
observation of some samples positive to the immunochemical assay but not confirmed by chromatography led us to
consider the possibility that this could be due to drug interference in the immunochemical method. By means of GC-mass
spectrometry it was shown that niflumic acid and its beta-morphinoethilic ester (Morniflumate) are responsible for
false-positive results in the immunochemical assay. This finding was confirmed by the assay of urine samples from
subjects free from drug of abuse, but using therapeutic drugs containing niflumic acid/Morniflumate as the active
principle.
RIASSUNTO
Viene descritta una indagine sperimentale che dimostra come alcuni farmaci possano portare a risultati falsamente
positivi quando le urine vengono analizzate con metodo immunochimci, su ILAB 600, per la ricerca dei metaboliti urinari
dei Cannabinoidi. L’occasionale riscontro di campioni urinari positivi al test di screening non confermati dall’analisi
cromatografica, ha portato gli autori ad ipotizzare che tali risultati potessero dipendere dall’uso di farmaci che,
direttamente o attraverso loro metaboliti, inducano interferenze (falsi positivi) nell’analisi immunochimica. Indagando su
tale ipotesi, attraverso l’analisi cromatografica effettuata in GAS-Massa, si è scoperto che l’acido niflumico e il suo estere
beta-morfinoetilico (Morniflumato) sono le sostanze responsabili di alcuni risultati falsamente positivi quando le urine
vengono analizzate con il metodo sopra citato. Il risultato è stato confermato dall’analisi di urine di soggetti non dediti
all’uso di stupefacenti ma che facevano uso di farmaci contenenti, come principio attivo, acido niflumico/Morniflumato.
INTRODUZIONE
MATERIALI E METODI
Il monitoraggio dell’abuso di cannabis viene solitamente effettuato mediante test immunochimici (1-2-3). Tali
tecniche non richiedono trattamenti preanalitici (estrazione, idrolisi, concentrazione ecc..), pertanto sono facilmente automatizzabili e permettono l’analisi di un gran numero
di campioni in poco tempo. Nel dosaggio delle droghe
d’abuso tali test rappresentano il primo livello di analisi. I
campioni positivi ai test di screening (test presuntivi) vengono sottoposti ad una ulteriore analisi di tipo cromatografico (4-5-6), che rappresenta il secondo livello di indagine,
che chiameremo di verifica.
L’occasionale riscontro di campioni urinari positivi al
test di primo livello e però non confermati dall’analisi
cromatografica, ci ha portato ad ipotizzare che tali risultati
potessero dipendere dall’uso di farmaci che, direttamente
o attraverso loro metaboliti inducano interferenze (falsi
positivi) nel test immunochimico. Su tale ipotesi abbiamo
voluto indagare, partendo dal controllo critico dei metodi
e dei materiali usati nei procedimenti analitici.
Il test immunochimico (EMIT) di screening è stato
eseguito su strumento ILAB 600 della ditta Instrumentation Laboratory. I reagenti usati sono prodotti dalla stessa
Azienda e sono stati utilizzati attenendosi scrupolosamente alle istruzioni fornite. In ogni seduta analitica sono stati
analizzati controlli positivi e negativi ottenendo risultati
compresi nei limiti di accettabilità.
Le determinazioni cromatografiche in HPLC (Cromatografia Liquida ad Alte Prestazioni) sono state compiute
mediante sistema automatico Perkin Elmer in uso presso
il Servizio di Tossicologia dell’Ospedale Principale Marittimo "G. Venticinque" di Taranto. La strumentazione si
avvale di un personal computer provvisto del software
Turbocrom 4.0 che controlla la pompa quaternaria modello 200, l’autocampionatore AS 200 ed il rivelatore a serie
di diodi LC 235C. Il software è in grado di controllare le
unità LC collegate, elaborare i dati strumentali ed archiviare metodi, cromatogrammi e bollettini analitici. Può inoltre
eseguire la rielaborazione di dati memorizzati, la reintegrazione grafica e la calibrazione multilivello.
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L’estrazione in fase solida dei campioni urinari è stata
effettuata su colonne Bond Elut Certify II LCR (Varian) da
130 mg. L’analisi HPLC è stata condotta utilizzando la
colonna Supelco C18 ABZ plus 250 x 4,6 mm 5 µm
provvista di precolonna Supelcoguard 2 cm x 4.0 mm 5
µm. L’acido ∆9 THC COOH utilizzato come standard
analitico e il cannabinolo (standard interno) in soluzione
metanolica sono stati forniti dalla ditta Salars (Como), e i
reattivi, tutti di purezza analitica o di grado HPLC, da J.T.
Baker.
Per l’analisi in GC-MS è stato utilizzato un GAS cromatografo Perkin Elmer modello CLARUS 500 in uso presso
l’Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale - Dipartimento Provinciale di Brindisi, dotato di rilevatore di massa
con sistema di ionizzazione ad impatto elettronico (EI). L’analisi è stata effettuata su colonna capillare J&W DB-5 30 m x
0,32 mm d.i,. spessore del film = 0,25 µm.
RISULTATI
Il metodo HPLC utilizzato per le analisi di conferma è
stato sviluppato e validato presso il Servizio di Tossicolo-
Figura 1
Conferma in HPLC di un risultato positivo al test immunochimico.
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gia dell’Ospedale Principale Marittimo "G. Venticinque" di
Taranto e, fino ad oggi, sono stati analizzati oltre 1000
campioni, risultati tutti liberi da interferenze di sostanze
endogene o esogene. L’identificazione del metabolita acido del cannabinolo è operata per mezzo del tempo di
ritenzione caratteristico che è confrontato, in ogni seduta
analitica, con il tempo di ritenzione di uno standard puro
aggiunto ad urine di soggetti non dediti all’uso di cannabinoidi. La figura 1 riporta un cromatogramma di un campione positivo al test di primo livello confermato dall’indagine
in HPLC.
Come si può osservare, il tracciato riporta un picco
con tempo di ritenzione 10,12 minuti, corrispondente al
THC-COOH (112 ng/ml). La figura 2 rappresenta il risultato di un’analisi cromatografica condotta sulle urine di un
soggetto non dedito all’uso di droghe (urine drug-free).
L’osservazione di quest’ultimo tracciato mette in evidenza l’assenza di qualsiasi picco con tempo di ritenzione
comparabile con il THC-COOH.
Con il metodo descritto sono stati indagati alcuni campioni urinari risultati positivi al test immunochimico condotto su strumento ILAB 600. Il dosaggio qualitativo su tali
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Figura 2
Cromatogramma di un estratto urinario non contenete droghe.
campioni ha dato esito positivo (valore soglia 50 ng/ml). I
campioni in esame sono stati sottoposti ad analisi cromatografica per la ricerca dell’acido 11nor ∆9 THC COOH,
maggior metabolita urinario dei cannabinoidi
I cromatogrammi di questo esame non hanno mostrato
la presenza di picchi cromatografici con tempo di eluizione
compatibile con l’acido ∆9 THC COOH. Pertanto, i risultati
dei test di primo livello di questi campioni dovevano essere
considerati "falsamente" positivi. La figura 3 riporta il risultato cromatografico ottenuto dall’analisi di uno di questi
campioni.
Osservando la figura, è possibile notare la presenza di
un picco significativo con tempo di ritenzione pari a 6.44
min, che potrebbe rappresentare la sostanza interferente.
La frazione cromatografica dello stesso campione compresa tra 5,5 e 7,5 minuti è stata raccolta con un raccoglitore di frazioni e sottoposta ad ulteriore indagine mediante
gas-cromatografo dotato di detector di massa. C’è stato
un unico picco, e l’identificazione della sostanza a lui
corrispondente è stata operata in TIC al tempo di ritenzione di 9.38 min. Si è scoperto che si trattava dell’acido
niflumico. Per confermare tale risultato, in una successiva
indagine è stata raccolta l’urina di un soggetto non dedito
all’uso di cannabinoidi ma in trattamento terapeutico con
NIFLAM® (cps da 250 mg di acido niflumico).
Il campione urinario raccolto a 12 ore dall’assunzione
del farmaco (prima minzione del mattino) è stato analizzato mediante test EMIT su ILAB 600 per la ricerca dei
metaboliti urinari dei cannabinoidi. L’analisi ha dato esito
francamente positivo. La successiva indagine cromatografica ha escluso la presenza all’acido ∆9 THC COOH
(falso positivo al test di primo livello). Risultati analoghi
sono stati ottenuti con FLOMAX® (cps da 700 mg di
morniflumato).
DISCUSSIONE
Osservando il tracciato cromatografico di uno dei campioni risultato positivo al test di I livello ma non confermato
dall’indagine di II livello (figura 3), è possibile notare la
presenza di un rilevante picco (non compatibile con il ∆9
THC COOH) normalmente non presente nei campioni
urinari. La costante presenza di tale picco in campioni
positivi allo screening ma non confermati dall’indagine
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Figura 3
Cromatogramma dell’estratto di un campione urinario positivo al test immunochimico non confermato dall’analisi HPLC.
cromatografica ci ha portato ad ipotizzare che tale picco
potesse rappresentare la sostanza interferente.
L’indagine cromatografica condotta in gas-massa (fig.
4) sulla frazione raccolta ci ha permesso di identificare la
sostanza interferente come acido niflumico.
Il risultato è stato confermato dall’analisi di urine di
soggetti non dediti all’uso di stupefacenti ma che facevano
uso di farmaci contenenti, come principio attivo, acido
niflumico.
a risultati falsamente positivi quando le urine sottoposte al
test di screening per i cannabinoidi vengono analizzate
con il metodo sopra citato. Ancora una volta le nostre
osservazioni attestano l’indispensabilità dell’analisi cromatografica per confermare la presenza di droghe, o di
loro metaboliti, nei campioni positivi al test di screening.
BIBLIOGRAFIA
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CONCLUSIONI
L’acido niflumico e il suo estere beta morfolinoetilico
(morniflumato) sono derivati dell’acido nicotinico. Tali sostanze appartengono alla categoria degli antiinfiarm-matori non steroidei (FANS) e, come tali, vengono utilizzati in
diverse condizioni flogistiche. I farmaci più noti che contengono acido niflumico/morniflumato, distribuiti in Italia,
sono: Flomax®, Morniflu® e Niflam® . Si tratta di preparati
usati in larga diffusione anche in pediatria.
Secondo il nostro studio l’uso di tali farmaci può portare
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Figura 4
Risultato dell’analisi Gas-Massa sulla frazione raccolta dall’HPLC.
5.
Pellegrino S, Petrarulo M, Pollano M, Rodolico S, Tedeschi
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cannabinoidi urinari con l’ausilio di una procedura cromatografica di conferma. Giornale Italiano Chimica Clinica 1995;
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6.
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