α-AMILASI SALIVA
Determinazione enzimatica dell’α-AMILASI nella saliva.
LOT
IVD
Vedere etichetta esterna
DESTINAZIONE D’USO
Il kit α-Amilasi Saliva è un dosaggio cinetico
colorimetrico per la determinazione quantitativa
dell’amilasi nella saliva.
1. SIGNIFICATO CLINICO
L'amilasi è il nome dato agli enzimi che idrolizzano
l'amido. Sono classificati come saccaridasi, enzimi
che idrolizzano i polisaccaridi.
Anche se esistono differenti amilasi, indicate da
lettere greche differenti, agiscono tutte su legami α1,4-glicosidici.
Le α-amilasi sono metallo-enzimi, completamente
incapaci funzionare in assenza di calcio.
L'α-amilasi idrolizza i carboidrati a catena lunga, in
maltotrioso e maltosio dall'amilosio, o maltosio,
glucosio e “destrine limite” dall'amilopectina.
Negli animali è l'enzima digestivo principale. Anche
se è diffuso in molti tessuti, l'amilasi è presente
principalmente nei succhi pancreatici e nella saliva,
ciascun distretto presenta un’isoforma differente.
L'amilasi salivare idrolizza l'amido in maltosio e
destrina. Questa isoforma è denominata ptialina. La
ptialina agisce sulle grandi, molecole insolubili di
amido negli amidi solubili (amilodestrine,
eritrodestrine, acrodestrine) che successivamente
verranno scisse in amidi più piccoli e in maltosio. La
ptialina agisce sui legami α(1,4) glucosidici lineari,
ma l'idrolisi completa richiede un enzima in grado di
idrolizzare legami ramificati. L'amilasi salivare è
inattivata nello stomaco dall’acido gastrico.
L'α-amilasi pancreatica idrolizza in modo random i
legami α(1-4) glicosidici dell'amilosio liberando
destrina, maltosio o molecole di glucosio.
2. PRINCIPIO DEL METODO
L’amilasi umana catalizza l’idrolisi del 2-cloro -4
nitrofenil-α-maltotrioside (CNP-G3) in polimeri del
glucosio e p-nitrofenil-oligosaccaridi a catena corta
con formazione di 2-cloro-4-nitrofenolo (CNP).
L’aumento
di
estinzione
viene
valutato
fotometricamente a 405 nm e risulta proporzionale
all’attività dell’amilasi presente nel campione.
Σ = 96 test
REF DKO075
3. REATTIVI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE
3.1. Reattivi e materiali forniti nel kit
1. Reattivo A (1 flacone) 32 mL
CNP-G3 2 mmol/L, tampone di Good 100 mmol/L,
stabilizzanti e conservati
REF DCE042-0
2. Conc. Assay Buffer 5x (1 flacone) 50 mL
Hepes buffer 200 mM pH 7.4; BSA 0,5 g/L
REF DCE049/7549-1
3. Microplate
REF DMZ001-0
3.2. Reattivi necessari non forniti nel kit
Acqua distillata.
3.3. Materiale e strumentazione ausiliare
Dispensatori automatici.
Lettore per micropiastre (405 nm)
Note
Conservare tutti i reattivi a 2÷8C° al riparo dalla
luce.
4. PRECAUZIONI
• Dopo l’apertura, i componenti del kit devono
essere conservati a 2÷8°C al riparo dalla luce e
non devono essere utilizzati dopo la data di
scadenza.
• Il kit è da utilizzarsi per il solo uso diagnostico in
vitro.
• Evitare il contatto con reattivi che potrebbero
essere tossici se ingeriti. Non pipettare con la
bocca.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Preparazione dell’Assay Buffer
Diluire l’intero flacone di Assay Buffer Conc 5x in
200 ml di acqua distillata o deionizzata. Mantenere a
2÷8°c fino alla data di scadenza riportata
sull’etichetta del flacone
5.2. Preparazione del Campione
Per la raccolta del campione si consiglia l’utilizzo di
tubi in vetro da centrifuga e di una cannuccia in
plastica.
Fare defluire la saliva attraverso la cannuccia nel
tubo di vetro, congelarla e scongelarla per favorire la
precipitazione delle mucine. Centrifugare il
campione per 15 minuti a 3000 rpm.
Non usare tubi in plastica o dispositivi disponibili in
commercio in quanto alterano il risultato analitico.
Diluire il liquido sopranatante 10 µl a 1 mL con
Assay buffer diluito (reattivo 2). Mescolare
delicatamente lasciando almeno 5 minuti su agitatore
rotante.
Se il dosaggio non viene effettuato lo stesso giorno
del prelievo conservare il campione a -20°C.
5.3. PROCEDIMENTO
Portare tutti i reattivi a temperatura ambiente
22÷28°C.
Nel caso di dover dispensare manualmente un
numero elevato di campioni si consiglia di caricare
un numero massimo di quattro strip alla volta.
Allestire i pozzetti della micropiastra per ciascuno
dei campioni da testare. Riporre ogni strip
inutilizzata nella busta.
Campione
Bianco
Campione diluito
10 µL
--Acqua distillata
--10 µL
Reattivo A
300 µL
300 µL
Incubare a 37°C per 3 min immediatamente dopo la
dispensazione dei reattivi.
A fine incubazione porre la micropiastra nel lettore a
temperatura ambiente (22-28°C) e leggere la
variazione di assorbanza (∆A) a 405 nm due volte, la
prima volta dopo 1 minuto e la seconda dopo 5
minuti dalla fine dell’incubazione sottraendo ad ogni
lettura l’assorbanza del bianco.
6. CONTROLLO QUALITA’
Ogni laboratorio dovrebbe analizzare i campioni
nella gamma dei livelli elevati, normali e bassi di αAmilasi per il controllo delle prestazioni dell’analisi.
Questi campioni dovrebbero essere trattati come
ignoti ed i valori determinati in ogni test effettuato.
Le tabelle di controllo qualità dovrebbero essere
effettuate per seguire le prestazioni dei reagenti
forniti. Metodi statistici adeguati dovrebbero essere
impiegati per accertare il trend. Il laboratorio
dovrebbe fissare i limiti di accettabilità di prestazioni
dell’analisi. La deviazione significativa dalle
prestazioni stabilite può indicare il cambiamento
inosservato negli stati o nella degradazione
sperimentali dei reagenti del kit. Reagenti freschi
dovrebbero essere usati per determinare il motivo
delle variazioni.
7. LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
7.1. Prestazioni dell’analisi
E’ importante che il tempo di reazione di ogni
pozzetto sia lo stesso per la riproducibilità dei
risultati. I lettori di micropiastra misurano le OD
verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti.
8. RISULTATI
Calcolare il ∆A/Min.= [(A5 min –A1 min) / 4]
Calcolo: α-Amilasi (U/mL):
∆A/min x TV x DF
MMA x SV x LP
Dove :
∆A/Min = differenza di assorbanza per minuto
TV = volume totale del saggio (0,310 mL)
DF = fattore di diluizione
MMA = coefficiente di assorbimento (estinzione)
millimolare del 2-cloro-p-nitrofenolo (12,9)
SV = volume del campione (0,010 mL)
LP = cammino ottico in centimetri = 0,95 (specifico
per la micropiastra ricevuta con il kit)
∆A/min x 0,310 x 100 = ∆A/min X 253 = U/mL(*)
12,9 x 0,010 x 0,95
(*)
= attività di α-amilasi nel campione
Nota:
la micropiastra fornita nel kit non è trattata
chimicamente ed il suo uso è inteso come recipiente
di reazione. In altro modo la reazione potrebbe essere
condotta in un recipiente diverso (ad esempio su
cuvette per spettrofotometri) ed è quindi importante
determinare il giusto cammino ottico LP ovvero la
distanza percorsa dalla radiazione luminosa
attraverso il campione; in generale per le cuvette
standard è di 1 cm.
9. VALORI DI RIFERIMENTO
Adulti (Normali)
80,0 U/mL
Range assoluto:
4 – 400 U/mL
10. PARAMETRI CARATTERISTICI
10.1. Precisione
10.1.1. Intra-Assay
La variabilità all’interno dello stesso kit è stata
determinata replicando (16x) la determinazione di
due differenti campioni di saliva. La variabilità intraassay è del < 1,5 %.
10.1.2. Inter-Assay
La variabilità tra kit differenti è stata determinata
replicando la determinazione di tre differenti
campioni di saliva con due kit appartenenti a lotti
diversi. La variabilità inter-assay è del < 1,5 %.
10.2. Sensibilità
La concentrazione minima di α-Amilasi misurabile è
2,5 U/mL con un limite di confidenza del 95%.
10.3. Correlazione
Il kit α-Amilasi (Diametra) è stato comparato con un
kit analogo disponibile in commercio.
La curva di regressione è :
y = 1,19 x + 2,55
r = 0,998 (r2 = 0,996)
11. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO
I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le
leggi locali.
BIBLIOGRAFIA
- Tietz NW. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed.
Philadelphia: WB Saunders Company: 46-49 (1995)
- (IFCC) “Approved Recommendation on IFCC Methods
for the measurement of catalytic concentration of
Enzymes” _Part 9
- Clin Chem Lab Med 36(3): 185 –203 (1998)
Ed 04/2010
DCM075-2
DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, 18 – 20090
SEGRATE (MI) Tel. 0039-02-2139184 – 02-26921595 –
Fax 0039–02–2133354.
Manufact: Via Giustozzi 35/35a – Z.I Paciana – 06034
FOLIGNO (PG) ITALY. Tel. 0039-0762–24864
Fax 0039–0762–316197 E-mail: [email protected]
α-AMYLASE SALIVA
Enzymatic determination of α-AMILASE in saliva.
LOT
IVD
See external label
INTENDED USE
The α-Amylase Saliva assay is a kinetic colorimetric
method for quantitative determination of α-amylase
in saliva.
1. CLINICAL SIGNIFICANCE
Amylase is the name given to enzymes that break
down starch. They are classified as saccharidases,
enzymes that cleave polysaccharides.
Although the amylases are designated by different
greek letters, they all act on α-1,4 glycosidic bonds.
The α-amylases are calcium metalloenzymes,
completely unable to function in the absence of
calcium. The α-amylase breaks down long-chain
carbohydrates, ultimately yielding maltotriose and
maltose from amylose, or maltose, glucose and "limit
dextrin" from amylopectin. In animals, it is a major
digestive enzyme.
Although found in many tissues, the α-amylase is
most prominent in pancreatic juice and saliva which
each have their own isoform.
Salivary α-amylase breaks starch down into maltose
and dextrin. This form is also called ptyalin. Ptyalin
will break large, insoluble starch molecules into
soluble starches (amylodextrin, erythrodextrin,
achrodextrin) producing successively smaller
starches and ultimately maltose. Ptyalin acts on
linear α(1,4) glucosidic linkages, but compound
hydrolysis requires an enzyme which acts on
branched products. Salivary amylase is inactivated in
the stomach by gastric acid.
Pancreatic α-amylase randomly cleaves the
α(1-4)glycosidic linkages of amylose to yield dextrin,
maltose or glucose molecules.
2. PRINCIPLE
The human α-Amylase hydrolyses the 2-chloro-4
nitrophenyl-α-maltotrioside (CNP-G3) in glucose
polymers
and
short-chain
p-nitrophenyloligosaccharide with formation of 2-chloro-4nitrophenol (CNP).
The increase of the extinction is evaluated
spectrophotometrically at 405 nm and is proportional
to α-amylase activity in the sample.
Σ = 96 test
REF DKO075
3. REAGENT, MATERIAL AND INSTRUMENTATION
3.1. Reagent and material supplied in the kit
1. Reagent A (1 bottle) 32 mL
CNP-G3 2mmol/L, Goods buffer 100 mmol/L,
stabilisers and preservatives
REF DCE042-0
2. Conc. Assay Buffer 5x (1 bottle) 50 mL
Hepes buffer 200 mM pH 7.4; BSA 0,5 g/L
REF DCE049/7549-1
3. Microplate
REF DMZ001-0
3.2. Reagents necessary not supplied
Distilled water.
3.3. Auxiliary materials and instrumentation
Automatic dispenser.
Microplates reader (405 nm).
Note
Store all reagents between 2÷ 8C° in the dark.
4. PRECAUTION
• Once open, store all reagents between 2÷8°C and
do not use them beyond the expiration date.
• For in vitro diagnostic use only.
• Avoid the contact with reagents which could be
toxic if are ingested. Not pipette with the mouth.
5. PROCEDURE
5.1. Preparation of Assay Buffer
Dilute the whole bottle of Assay Buffer Conc 5x in
200 mL of distilled or deionized water. Keep
between 2÷8°c until expiration date (see vial label).
5.2. Preparation of the Sample
For sample collection is advised to use glass
centrifuge tubes and plastic straws.
Do not use plastic tube or commercially available
devices for the saliva collection to avoid false
results.
Let the saliva flow down through the straw into the
centrifuge glass tube, freeze and thaw it to help to
mucins precipitation. Centrifuge at 3000 rpm for 15
minutes.
Dilute 10 µL of supernatant liquid to 1 mL of diluted
Assay Buffer (reagent 2). Mix gently by leaving it
for at least 5 minutes on a rotating shaker.
If the assay is not carried out in the same day of
collection, store samples at -20°C.
5.3. PROCEDURE
All the reagents should be brought to room
temperature 22÷28°C.
If you should manually dispense a high number of
samples, it is advised to use to the maximum four
strips for each tests.
Format the microplate wells for each patient
specimen to be assayed in duplicate. Replace any
unused microwell strips back into the aluminium
bag, seal off and store at 2÷8°C
Sample
Blank
Diluted Sample
10 µL
--Distilled water
--10 µL
Reagent A
300 µL
300 µL
Incubate at 37°C for 3 min immediately after
reagents dispensation.
At the end of incubation time put the microplate on
microplate reader at ambient temperature (22-28°C)
and read the absorbance variation (∆A) two times at
405 nm, the first after 1 minute and the second after
5 minute from the end of incubation time, subtracting
each time the absorbance of blank.
6. QUALITY CONTROL
Each laboratory should assay controls at normal,
high and low levels range of α-amylase for
monitoring assay performance. These controls should
be treated as unknowns and values determined in
every test procedure performed. Quality control
charts should be maintained to follow the
performance of the supplied reagents. Pertinent
statistical methods should be employed to ascertain
trends. The individual laboratory should set
acceptable assay performance limits. Other
parameters that should be monitored include the 80,
50 and 20% intercepts of the standard curve for runto-run reproducibility. In addition, maximum
absorbance should be consistent with past
experience. Significant deviation from established
performance can indicate unnoticed change in
experimental conditions or degradation of kit
reagents. Fresh reagents should be used to determine
the reason for the variations.
7. LIMITATION OF PROCEDURE
7.1. Assay Performance
It is important that the time of reaction in each well
is held constant for reproducible results. Plate
readers measure the OD vertically. Do not touch the
bottom of the wells.
8. RESULTS
Calculate il ∆A/Min.= [(A5 min –A1 min) / 4]
Calcul: α-Amylase (U/mL):
∆A/min x TV x DF
MMA x SV x LP
Where :
∆A/Min = Absorbance difference per minute
TV = Total assay volume (0.310 mL)
DF = Dilution factor
MMA = Millimolar absorption (extinction)
coefficient of 2-chloro-p-nitrophenol (12.9)
SV = Sample volume (0.010 mL)
LP = Light path in centimeters = 0.95 (specific to
microplate received with kit)
∆A/min x 0.310 x 100 = ∆A/min X 253 = U/mL(*)
12.9 x 0.010 x 0.95
(*)
= α-amylase activity in sample
Note:
The microplate provided with the kit is not
chemically treated and its use is intended like a batch
of reaction. Otherwise the reaction may be conduct
in a different batch (for example in a
spectrophotometer cuvette) and it is important to
know the right optical path lenght LP that is the
distance the light travels through the sample; for
standard cuvette is generally 1 cm.
9. REFERENCE VALUE
Adults (Normal)
80.0 U/mL
Absolute Range:
4 – 400 U/mL
10. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS
10.1. Precision
10.1.1. Intra-Assay
Within run variation was determined by replicate
determination (16x) of three different levels of
control sera in one assay. The within assay
variability is < 1.5 %.
10.1.2. Inter-Assay
Between run variation was determined by replicate
measurements of three different saliva samples in 2
different lots. The between assay variability is <1.5
%.
10.2. Sensitivity
The lowest detectable concentration of α-amylase
that can be distinguished from the zero standard is
2.5 U/mL at the 95 % confidence limit.
10.3. Correlation
The α-Amylase kit (Diametra) was compared to a
similar commercially available kit.
The linear regression curve was calculated
y = 1.19 x + 2.55
r = 0.998 (r2 = 0.996)
11. WASTE MANAGEMENT
Reagents must be disposed off in accordance with
local regulations.
REFERENCES
- Tietz NW. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed.
Philadelphia: WB Saunders Company: 46-49 (1995)
- (IFCC) “Approved Recommendation on IFCC Methods
for the measurement of catalytic concentration of
Enzymes” _Part 9
- Clin Chem Lab Med 36(3): 185 –203 (1998)
Ed 04/2010
DCM075-2
DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, 18 – 20090
SEGRATE (MI) Tel. 0039-02-2139184 – 02-26921595 –
Fax 0039–02–2133354.
Manufact: Via Giustozzi 35/35a – Z.I Paciana – 06034
FOLIGNO (PG) ITALY.
Tel. 0039-0762–24864 Fax. 0039–0762–316197
E-mail:
[email protected]
DIA.METRA SRL
Mod. PIS
IT
PACKAGING INFORMATION SHEET
Spiegazione dei simboli
DE
FR
ES
Explication des symboles
Significado de los simbolos
PT
Verwendete Symbole
REF
yyyy-mm-dd
Σ = xx
Max
Min
GB
Explanation of symbols
Explicaçao dos simbolos
DE
ES
FR
GB
IT
PT
In vitro Diagnostikum
Producto sanitario para diagnóstico In vitro
Dispositif medical de diagnostic in vitro
In vitro Diagnostic Medical Device
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Dispositivos medicos de diagnostico in vitro
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Hergestellt von
Elaborado por
Fabriqué par
Manufacturer
Produttore
Produzido por
DE
ES
FR
GB
IT
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Bestellnummer
Nûmero de catálogo
Réferéncès du catalogue
Catalogue number
Numero di Catalogo
Número do catálogo
DE
ES
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GB
IT
PT
Herstellungs datum
Fecha de fabricacion
Date de fabrication
Date of manufacture
Data di produzione
Data de produção
DE
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GB
IT
PT
Verwendbar bis
Establa hasta (usar antes de último día del mes)
Utiliser avant (dernier jour du mois indiqué)
Use by (last day of the month)
Utilizzare prima del (ultimo giorno del mese)
Utilizar (antes ultimo dia do mês)
DE
ES
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GB
IT
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Biogefährdung
Riesco biológico
Risque biologique
Biological risk
Rischio biologico
Risco biológico
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GB
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Gebrauchsanweisung beachten
Consultar las instrucciones
Consulter le mode d’emploi
Consult instructions for use
Consultare le istruzioni per l’uso
Consultar instruções para uso
DE
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GB
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Chargenbezeichnung
Codigo de lote
Numero de lot
Batch code
Codice del lotto
Codigo do lote
DE
ES
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Ausreichend für “n” Tests
Contenido suficiente para ”n” tests
Contenu suffisant pour “n” tests
Contains sufficient for “n” tests
Contenuto sufficiente per “n” saggi
Contém o suficiente para “n” testes
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Inhalt
Contenido del estuche
Contenu du coffret
Contents of kit
Contenuto del kit
Conteúdo do kit
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Temperaturbereich
Límitaciôn de temperatura
Limites de température de conservation
Temperature limitation
Limiti di temperatura
Temperaturas limites de conservação
yyyy-mm
Cont.
\\Strumenti\metodiche\Metodiche WORD\Metodiche aggiornate Word\DCM075-2 metodica AMILASI SALIVA CE.doc
DIA.METRA SRL
Mod. PIS
PACKAGING INFORMATION SHEET
SUGGERIMENTI PER LA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI/TROUBLESHOOTING
ERRORE CAUSE POSSIBILI/ SUGGERIMENTI
Nessuna reazione colorimetrica del saggio
- mancata dispensazione del Reattivo A
- contaminazione del Reattivo A
- errori nell’esecuzione del saggio (es. Dispensazione accidentale dei reagenti provenienti da
flaconi sbagliati, etc.)
Reazione troppo blanda (OD troppo basse)
- Reattivo A non idoneo (es. non proveniente dal kit originale)
- tempo di incubazione troppo breve, temperatura di incubazione troppa bassa
Reazione troppo intensa (OD troppo alte)
- Reattivo A non idoneo (es. non proveniente dal kit originale)
- tempo di incubazione troppo lungo, temperatura di incubazione troppa alta
Valori inspiegabilmente fuori scala
- contaminazione di pipette, puntali o contenitori , CV% intrasaggio elevato
- reagenti e/o strip non portate a temperature ambiente prima dell’uso
- condizioni di incubazione non costanti (tempo o temperatura)
- dilatazione dei tempi di dispensazione
- variabilità intrinseca degli operatori
ERROR POSSIBLE CAUSES / SUGGESTIONS
No colorimetric reaction
- no Reagent A pipetted
- contamination of Reagent A
- errors in performing the assay procedure (e.g. accidental pipetting of reagents from the wrong
vial, etc.)
Too low reaction (too low ODs)
- incorrect Reagent A (e.g. not from original kit)
- incubation time too short, incubation temperature too low
Too high reaction (too high ODs)
- incorrect Reagent A (e.g. not from original kit)
- incubation time too long, incubation temperature too high
Unexplainable outliers
- contamination of pipettes, tips or containers, CV% too high within-run
- reagents and/or strips not pre-warmed to room temperature prior to use
- incubation conditions not constant (time, temperature), CV % too high between-run
- too long dispense time
- person-related variation
\\Strumenti\metodiche\Metodiche WORD\Metodiche aggiornate Word\DCM075-2 metodica AMILASI SALIVA CE.doc
