Biotecnologie

Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
SOLUZIONI AI PROBLEMI DEL CAPITOLO 19
Domande concettuali
C1. Un microrganismo ricombinante contiene DNA che è stato manipolato in vitro e poi
reintrodotto nell'organismo. I microrganismi ricombinanti sono stati utilizzati per sintetizzare
prodotti genici umani (per esempio l'insulina), oppure come agenti di controllo biologico (per
esempio i batteri Ice-), o nel biorisanamento (come i batteri “mangia petrolio”).
C2. A. radiobacter sintetizza un antibiotico che uccide A. tumefaciens. I geni necessari per la
biosintesi dell’antibiotico e la resistenza sono codificati da un plasmide e possono essere
trasferiti durante la coniugazione interspecifica. Se A. tumefaciens ricevesse questo plasmide
durante la coniugazione, esso sarebbe resistente all’antibiotico. Perciò, il ceppo incapace di
effettuare la coniugazione impedisce la presenza di ceppi di A. tumefaciens resistenti.
C3. Il biorisanamento si riferisce all'impiego dei microrganismi (oppure di piante) per eliminare gli
inquinanti dall'ambiente. Nella biotrasformazione, gli enzimi modificano un inquinante tossico
alterandone la struttura. Nella biodegradazione, un composto tossico viene scisso in un
composto più piccolo e meno tossico.
C4. Un agente di controllo biologico è un organismo che impedisce gli effetti dannosi di alcuni altri
agenti nell’ambiente. Esempi includono Bacillus thuringiensis, un batterio che sintetizza
composti che agiscono da tossine per uccidere gli insetti, i batteri Ice– che inibiscono la
proliferazione dei batteri Ice+, e l’utilizzo di Agrobacterium radiobacter che previene la
formazione della galla del colletto causato da Agrobacterium tumefaciens.
C5. La purificazione di questi farmaci a partire da materiale di origine umana è difficile e costosa.
Il vantaggio degli organismi geneticamente modificati è quello di poter produrre grandi
quantità di questi farmaci a minor costo. Ci sono alcuni svantaggi. Per esempio, un farmaco
può richiedere delle modificazioni post-traduzionali che non avvengono nei microrganismi. La
percezione dell'opinione pubblica circa l'ingegneria genetica può rappresentare un problema,
nonostante in questa particolare area dell'ingegneria genetica solitamente non si tratti di un
problema enorme.
C6. Un modello murino è un ceppo di topi che porta una mutazione di un gene murino analoga a
quella responsabile di una malattia genetica umana. Questi topi possono essere impiegati per
studiare la malattia e per saggiare i potenziali agenti terapeutici.
C7. Un organismo transgenico è un organismo con DNA ricombinante integrato nel suo genoma. Il
pomodoro Flavr Savr è un esempio di pianta transgenica (Approfondimento web 19.2). Le
piante tolleranti verso particolari erbicidi ne rappresentano un altro esempio Il topo di grande
dimensione illustrato nella Figura 19.2 possiede un gene codificante per l'ormone della crescita
umano. Anche le pecore che esprimono gli ormoni umani nel loro latte sono transgeniche.
C8. Il T-DNA si trasferisce nella cellula vegetale; in seguito si integra nel genoma di questa cellula.
C9. L'inserzione si verifica quando un gene viene introdotto in una cellula e si integra nel DNA
cromosomico mediante ricombinazione non omologa. Il gene viene semplicemente inserito nel
genoma. La sostituzione genica avviene mediante ricombinazione omologa. Nella sostituzione
genica il gene che viene introdotto in una cellula viene scambiato con un gene omologo che è
già presente nel genoma.
A. Questa è una sostituzione genica. Il gene murino normale viene sostituito con un gene
mutante.
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
B. Questa è un'inserzione genica. Il T-DNA che porta un gene di interesse può integrarsi in
diversi siti all'interno del genoma di una pianta.
C10.
A. Rispetto ai geni ad effetto materno, il fenotipo dipenderà dall’animale che ha donato
l’ovocita. È il citoplasma dell’oocita che accumula i prodotti dei geni a effetto materno.
B. I caratteri extranucleari dipendono dal genoma mitocondriale. I mitocondri si trovano
nell’oocita e nella cellula somatica. Perciò, in teoria, entrambe le cellule potrebbero
contribuire ai caratteri extranucleari. In realtà, tuttavia, i ricercatori hanno trovato che in
Dolly i mitocondri derivavano dall’animale che aveva donato l’oocita. Non è chiaro per
quale motivo Dolly non avesse mitocondri derivanti dalla cellula mammaria.
C. L’animale clonato sarebbe geneticamente identico all’organismo che ha donato il nucleo per
quanto riguarda i caratteri determinati dai geni nucleari, che sono espressi durante la vita
dell’individuo. Rispetto ai caratteri che sono determinati dai geni a effetto materno e dai geni
mitocondriali, l’animale clonato potrebbe essere invece diverso da quello che ha donato il
nucleo. Questo animale non è un vero clone, ma è probabile che assomigli molto all’animale
che ha donato il nucleo, perché la grande maggioranza dei geni si trovano in quel
compartimento cellulare.
C11.Vedi la Tabella 19.5
C12. Alcune persone sono preoccupate del rilascio nell’ambiente di microrganismi geneticamente
modificati. Il timore è che tali organismi possano continuare a proliferare e non sia possibile
“arrestarli”. Una seconda preoccupazione riguarda l’utilizzo degli organismi geneticamente
modificati nel nostro cibo. Alcune persone sono preoccupate che gli organismi geneticamente
modificati possano costituire un rischio non ancora evidente per la salute. Una terza
problematica è di natura etica. Alcune persone pensano che sia moralmente scorretto interferire
con la genetica degli organismi. Questa opinione si riferisce anche all’applicazione delle
tecniche genetiche quali la clonazione, la ricerca sulle cellule staminali, e la terapia genica.
Domande sperimentali
S1. Il gene umano che codifica per l'ormone viene manipolato in vitro e poi trasformato in un
batterio. In molti casi, la sequenza codificante del gene per l'ormone umano viene fusa con un
gene batterico per prevenire la rapida degradazione dell'ormone umano. I batteri quindi
esprimono la proteina di fusione e l'ormone viene separato mediante bromuro di cianogeno.
S2. Il plasmide con l’orientamento scorretto non funzionerebbe, perché la sequenza codificante si
troverebbe in posizione sbagliata relativamente al promotore. Perciò, la regione contenente la
sequenza codificante non verrebbe tradotta in somatostatina
S3. Una possibilità è clonare i geni per la produzione delle tossine da B. thuringiensis e introdurli
in P. syringae. Questo ceppo batterico avrebbe il vantaggio di non richiedere la ripetizione
delle applicazioni. Tuttavia, sarebbe un ceppo ricombinante e potrebbe essere considerato in
modo negativo dalle persone contrarie all'impiego degli organismi ricombinanti su campo. Al
contrario, B. thuringiensis è una specie presente in natura.
S4. Per costruire la sequenza codificante della somatostatina, i ricercatori sintetizzarono otto
oligonucleotidi, indicati con le lettere A-H. Quando questi oligonucleotidi furono mescolati
assieme, essi formarono dei legami idrogeno tra loro, determinati dalla complementarietà delle
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
sequenze. L’aggiunta della ligasi formò poi dei legami covalenti nella struttura del DNA.
L’estremità 5’ della sequenza codificante conteneva un sito EcoRI, e all’estremità 3’ era presente
un sito BamHI; questi siti rendevano possibile l’inserimento di questa sequenza all’estremità del
gene per la β-galattosidasi. Puoi anche notare che il codone ATG (AUG nell’mRNA) precede il
primo codone per l’alanina nella somatostatina. Questo codone AUG codifica per la metionina,
che permette alla somatostatina di essere tagliata dalla β-galattosidasi usando bromuro di
cianogeno. Questo era necessario perché la somatostatina, come tale, verrebbe velocemente
degradata in E. coli, al contrario della proteina di fusione.
S5. Sostanzialmente, si potrebbe seguire la strategia descritta nella Figura 19.4. Se avviene la
ricombinazione omologa, solamente il gene NeoR viene incorporato nel genoma. Le cellule
saranno resistenti alla neomicina e anche al ganciclovir. Se si verifica inserzione genica, le
cellule saranno sensibili al ganciclovir. Coltivando le cellule in presenza di ganciclovir e
neomicina, si potrebbe selezionare i ricombinanti derivanti dalla ricombinazione omologa. Le
chimere vengono identificate mediante l'osservazione del mantello che apparirà chiaro e scuro.
S6. Il T-DNA contiene un gene per la resistenza alla kanamicina. L’esposizione alla kanamicina
seleziona favorevolmente le sole cellule della pianta che hanno incorporato il T-DNA nel loro
genoma. La carbenecillina uccide A. tumefaciens. Gli ormoni vegetali promuovono la
rigenerazione della pianta intera a partire dalle cellule somatiche. Se non si aggiungesse la
kanamicina, non sarebbe possibile selezionare le cellule che hanno assorbito il T-DNA.
S7.
1. A. tumefaciens (trasferimento genico mediato da T-DNA): i geni vengono clonati nel T-DNA
del plasmide Ti. Questo plasmide viene trasferito nella cellula vegetale quando è infettata dal
batterio.
2. Trasferimento genico biolistico: la cellula vegetale viene “bombardata” con microproiettili
ad alta velocità rivestiti da DNA.
3. Microiniezione: un ago di dimensioni microscopiche contenente una soluzione di DNA
viene utilizzato per iniettare il DNA nelle cellule vegetali.
4. Elettroporazione: per introdurre il DNA nelle cellule vegetali viene utilizzata la corrente
elettrica.
5. Inoltre, il DNA può essere introdotto nei protoplasti mediante trattamento con
polietilenglicole e fosfato di calcio.
S8. Il termine knockout genico si riferisce a un organismo nel quale la funzione di un particolare
gene è stata eliminata. Negli animali e nelle piante, un knockout di un gene autosomico è
omozigote per un difetto in entrambe le copie del gene. Se un knockout genico non manifestasse
alcun effetto fenotipico, il gene potrebbe essere ridondante. In altre parole, nel genoma ci
potrebbero essere più geni che svolgono la stessa funzione. Un’altra ragione per cui un knockout
genico non manifesta alcun effetto fenotipico è attribuibile all’ambiente. Per esempio, diciamo
che un gene murino sia necessario per la sintesi di una vitamina. Se i ricercatori fornissero del
cibo contenente la vitamina, il topo knockout mancante di questo gene avrebbe un fenotipo
normale e sopravvivrebbe abbastanza bene. Talvolta, i ricercatori hanno problemi nel riconoscere
gli effetti di un knockout genico a meno che essi non modifichino le condizioni ambientali nelle
quali vengono allevati gli animali.
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
S9. Nel lavoro di Mendel e in quello di molti genetisti classici, un fenotipo alterato (mutante) è il
modo iniziale per identificare un gene. Per esempio, Mendel identificò un gene che influenzava
l'altezza delle piante mediante l'osservazione delle piante alte e nane. La trasmissione di questo
gene poteva essere seguita negli incroci genetici, e infine, il gene poteva venire clonato usando
le tecniche molecolari. La genetica inversa impiega la sequenza opposta dei passaggi. Il gene
viene dapprima clonato, e il fenotipo del gene (sulla base della produzione di un knockout
genico) viene scoperto in seguito, producendo un animale ricombinante con il gene knockout.
S10. La sostituzione genica si verifica a causa della ricombinazione omologa. Affinché avvenga la
ricombinazione omologa, devono avvenire due crossing-over, uno a livello di ciascuna estremità
del gene bersaglio. Dopo l’evento, solamente il gene NeoR, che è inserito nel gene bersaglio, può
essere incorporato nel DNA cromosomico della cellula staminale embrionale. Al contrario, la
ricombinazione non omologa può coinvolgere due crossing-over in qualsiasi sito del DNA
clonato. Siccome il gene TK e il gene NeoR sono adiacenti tra loro, la ricombinazione non
omologa solitamente trasferisce sia il gene TK che il gene NeoR. Se entrambi i geni vengono
trasferiti in una cellula staminale embrionale, essa morirà perché le cellule vengono coltivate in
presenza del farmaco antivirale ganciclovir. In queste condizioni il prodotto del gene TK
ucciderà le cellule. Al contrario, le cellule che in seguito alla ricombinazione omologa hanno
acquisito il gene NeoR ma non il gene TK sopravvivranno. Le cellule staminali che non hanno
assorbito il DNA clonato moriranno perché saranno uccise dalla neomicina. In questo modo, la
presenza del ganciclovir e della neomicina seleziona favorevolmente le cellule staminali che
hanno acquisito il gene bersaglio mediante ricombinazione omologa.
S11. Una chimera è un organismo composto da cellule derivanti da due diversi individui
(solitamente della stessa specie). Le chimere vengono prodotte mescolando le cellule
embrionali di due individui e lasciando che queste si organizzino e si sviluppino in un singolo
individuo.
S12.
A. I cromosomi di Dolly possono sembrare così vecchi perché erano già vecchi quando erano
nel nucleo incorporato nell’ovocita enucleato. I telomeri erano già diventati
significativamente corti nelle cellule mammarie. Questo accorciamento non è stato riparato
dall’ovocita.
B. L’accorciamento dei telomeri crea dei piccoli problemi, perché suggerisce che la cellula
somatica ha subito una forma di invecchiamento, che è stata trasmessa all’organismo
clonato. Se la clonazione fosse avvenuta per molte generazioni, questo avrebbe potuto alla
fine avere un impatto maggiore sulla durata della vita dell’organismo clonato, che potrebbe
morire molto prima rispetto a un organismo non clonato. Tuttavia, l’accorciamento dei
telomeri non si verifica sempre. Esso non sembrava essere avvenuto nei topi che sono stati
clonati per sei generazioni consecutive.
S13. Dovresti eseguire un Southern blot per determinare il numero delle copie. Come descritto nel
Capitolo 18, nel filtro ibridato osserverai numerose bande se ci sono numerose copie di un
gene. Questa informazione è importante per predire il risultato degli incroci. Per esempio, se
sono integrate quattro copie in siti diversi del genoma, un individuo della progenie potrebbe
ereditare da zero a quattro copie del gene. Quindi questo ti aiuta a predire i fenotipi della
progenie.
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
Dovresti eseguire un Northern blot oppure un Western blot per analizzare il livello di
espressione genica. Un Northern blot indicherà se il gene viene trascritto in mRNA, e un
Western blot indicherà se il gene viene tradotto in proteina.
S14. Il termine pharming molecolare si riferisce per esempio alla procedura di produzione di
animali transgenici che sintetizzano prodotti umani nel loro latte. Esso si riferisce anche alla
sintesi di farmaci da parte di piante di interesse agricolo. Il pharming molecolare può essere
vantaggioso quando le cellule batteriche non sono in grado di sintetizzare un prodotto proteico
funzionale da un gene umano. Per esempio, alcune proteine sono modificate a livello posttraduzionale mediante l’aggiunta di carboidrati. Questo tipo di modificazione non avviene nei
batteri, ma può verificarsi correttamente negli animali o nelle piante transgenici. Inoltre, le
mucche da latte producono grandi quantità di latte, che possono incrementare la resa dei prodotti
umani. In modo simile, le piante possono produrre grandi quantità di proteine ricombinanti.
S15. Per clonazione riproduttiva si intende la clonazione di un intero organismo pluricellulare. Nelle
piante ciò è relativamente semplice. Molte specie vegetali possono essere clonate mediante
talea. Negli animali, la clonazione si verifica naturalmente, come nei gemelli monozigotici. I
gemelli monozigotici sono repliche identiche perché originano da uno stesso oocita fecondato
(nota: potrebbero verificarsi delle mutazioni somatiche che renderebbero i gemelli
monozigotici leggermente diversi). Recentemente, come nel caso di Dolly, la clonazione
riproduttiva è diventata possibile mediante la fusione delle cellule somatiche con gli oociti
enucleati. Il vantaggio, dal punto di vista zootecnico, è che la clonazione riproduttiva
permetterebbe di scegliere l'animale migliore del bestiame e clonarlo numerose volte.
L'incrocio tra animali non sarebbe più necessario. Inoltre, gli incroci sono meno efficaci perché
la progenie eredita i caratteri sia materni che paterni.
S16.Dovresti inizialmente clonare il gene murino normale. I metodi di clonaggio sono descritti nel
Capitolo 18. Dopo avere clonato il gene normale, dovresti seguire il protocollo illustrato nella
Figura 19.4. Il gene normale viene inattivato dall’inserzione del gene NeoR, e il gene TK deve
essere clonato adiacente ad esso. Questo segmento di DNA deve essere introdotto nelle cellule
staminali embrionali di topo e coltivate in presenza di neomicina e ganciclovir. Questo
seleziona le cellule nelle quali si è verificata la ricombinazione omologa. Le cellule staminali
embrionali che sopravvivono vengono iniettate nell’embrione precoce, che si svilupperà in
chimera. I topi chimerici saranno identificati grazie alle loro macchie chiare e scure del
mantello. A questo punto, se tutto si è svolto nel modo corretto, parte delle cellule del topo sono
eterozigoti per il gene normale e il gene con l’inserto NeoR. Questo topo sarà incrociato, e i
maschi e le femmine della progenie incrociati tra loro. Tramite Southern blot può essere
determinato se la progenie porta il gene con la cassetta NeoR. Inizialmente, si potrebbero
identificare gli eterozigoti che hanno una copia del gene inserito. Gli eterozigoti verranno
incrociati tra loro per ottenere degli omozigoti. Gli omozigoti sono knockout genici perché la
funzione del gene è stata inattivata a causa dell’inserzione della cassetta NeoR nel gene. Forse
questi topi saranno nani e manifesteranno segni di ritardo mentale. A questo punto, il
ricercatore avrà un modello murino per studiare la malattia.
S17. La terapia ex vivo prevede la rimozione delle cellule viventi dal corpo di un individuo e la loro
successiva modificazione. Le cellule modificate vengono poi reintrodotte nel corpo della
persona. Questo approccio funziona per cellule come le cellule del sangue che sono facili da
rimuovere e sostituire. Al contrario, questo approccio non funziona per molti altri tipi cellulari.
Per esempio, le cellule polmonari non possono essere asportate e reintrodotte. In questo caso, si
devono ricercare approcci in vivo.
Principi di genetica - Robert J. Brooker
Copyright © 2010 – The McGraw-Hill Companies srl
S18. Come si legge dall’approfondimento web 19.3, nella terapia genica della fibrosi cistica uno
spray contenente il gene normale della fibrosi cistica in un retrovirus oppure in un liposoma,
viene utilizzato per fare entrare il gene normale nei polmoni. Le cellule epiteliali della superficie
dei polmoni assorbiranno il gene. Tuttavia, queste cellule epiteliali hanno una durata di vita
limitata, per cui sono necessarie applicazioni ripetute dell’aerosol. Idealmente, gli scienziati
sperano nello sviluppo di metodi mediante i quali il gene normale per la fibrosi cistica potrà
penetrare nel tessuto polmonare in maggiore profondità.
S19. È il prodotto genico (cioè il polipeptide) di un oncogene a indurre la crescita delle cellule
tumorali. L'RNA antisenso del gene introdotto mediante la terapia genica si lega all'mRNA
dell'oncogene. Questo ne impedirebbe la traduzione in polipeptide e perciò preverrebbe la
crescita delle cellule cancerose.