Genetica dei Procarioti - 1 - Dipartimento di Scienze della vita

04/03/2016
Dipartimento di Scienze della Vita
CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)
A.A. 2015-16
Organizzazione dell’insegnamento
 Lezioni frontali
 Esercitazioni pratiche
 Discussione tema assegnato
Calendario delle Lezioni:
pagina web DSV
Genetica dei Procarioti - 1
Sebbene consigliata, la frequenza non è obbligatoria
Prof. Laura Marri
ricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail
Contenuti dell’insegnamento
Struttura e funzione degli acidi nuleici
Genomi batterici e analisi metagenomica
Replicazione del cromosoma e divisione cellulare
Riparazione del DNA: risposta SOS
Organizzazione genica
Regolazione dell’espressione genica
Controllo trascrizionale
Controllo traduzionale
Quorum Sensing
Plasmidi
Tipi di plasmidi
Sistemi di classificazione
Mutazione e variazione
Variazione ed evoluzione
Tipi di mutazioni
Isolamento e identificazione dei mutanti
Trasferimento genico
meccanismi di trasferimento genico
HGT in situ
Plasticità genomica
continua …
Elementi trasponibili
Variazione di Fase
continua …
1
04/03/2016
Sfruttamento del potenziale microbico
Valutazione finale
Ingegneria genetica per l'ottimizzazione di espressione
di proteine in batteri (plasmidi, promotori, fusioni, etc.)
Il voto sarà determinato da:
Metodi di mutagenesi e protein engineering per
l'ottimizzazione dell'attività catalitica di enzimi di
interesse industriale
Dr. Immaculada Margarit Y Ros
1discussione su un tema assegnato: ad ogni studente sarà
assegnato un gene di Escherichia coli su cui dovrà redigere
una scheda monografica che sarà oggetto di una breve
presentazione (5 min) il 3 maggio p.v.
Valutazione finale
Valutazione finale
Il voto finale sarà determinato da:
2- Relazione di ogni esercitazione pratica completata in
aula (obbligatoria per chi frequenta le attività ) .
Le relazioni, ai fini del conseguimento del punteggio
previsto, devono essere consegnate entro e non oltre
giovedì 12 maggio p.v.
Il mancato adempimento comporterà una
penalizzazione di -1,5 punti sul voto finale totale
Il voto finale sarà determinato da:
3-
Esame scritto di 60 minuti basato su domande 10/11
aperte che richiedono una risposta breve
Appelli 2016
16 giugno
8 luglio
26 luglio
9 settembre
29 settembre
Le date indicate possono essere suscettibili a modifiche
2
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Testi consigliati per la consultazione
Voto finale:
+
J.W. Dale & S.F. Park
MOLECULAR GENETICS
OF BACTERIA
5th Ed. Wiley, 2010
+
Madigan, Martinko, Parker
BROCK, BIOLOGIA DEI
MICRORGANISMI voll.1, 2, 3
Pearson Italia Milano-Torino, 2012
G. Dehò & e. Galli
BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI
2a Ed. CEA, 2014
N.B.:
E’ possibile sostenere esclusivamente il compito scritto.
In questo caso il voto massimo raggiungibile sarà di: 27/30
Testi consigliati per la consultazione
N. Trun & J. Trempy
discussione su un tema assegnato: ad ogni studente sarà
assegnato un gene di Escherichia coli su cui dovrà redigere
una scheda monografica che sarà oggetto di una breve
presentazione (5 min) il 3 maggio p.v.
Fundamental
BACTERIAL GENETICS
Wiley-Blackwell, 2003
http://www.blackwellpublishing.com/trun/default.htm
Articoli
scientifici
Esempio:
3
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Gene Name:
lacZ
Protein Name: LacZ, beta-D-galactosidase
Pathway: lactose degradation
Gene Local Context
Regulation Summary
NEGATIVE
REGULATION
POSITIVE
REGULATION
4
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1866
Mendel scopre I geni
1943
il DNA è il materiale genetico
1951
prima sequenza di una proteina (insulina)
1953
struttura del DNA
1959
struttura della mioglobina
1960s
delucidazione del codice genetico
1977
sequenziamento del DNA
1975-79
primi clonaggi di geni umani
1986
sviluppo di un sistema di seq. aut. del DNA
1995
primo genoma completo (Haemophilus influenzae)
1997
Genoma di Escherichia coli
1999
primo cromosoma umano (Chr #22)
2000
Drosophila / Arabidopsis genomi
2001
genomi dell’uomo e di topo
Avery, McCarty, and MacLeod’s experiments, 1943
Griffith’s Experiments, 1929
R
R
S
To the Heat-Killed Smooth Type, added enzymes that destroyed…
Mice injected with
live cells of harmless
strain R do not die.
Live R cells in their
blood.
Mice injected with live
cells of killer strain S
die. Live S cells in their
blood.
Mice injected with heatkilled S cells do not die.
No live S cells in their
blood.
Mice injected with
live R cells plus
heat-killed S cells
die. Live S cells in
their blood.
Carbohydrates
Lipids
Proteins
RNA
DNA
5
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S-Type Carbohydrates S-Type
Destroyed
Lipids
Destroyed
S-Type
Proteins
Destroyed
S-Type RNA S-Type DNA
Destroyed
Destroyed
Conclusion:
DNA was the transforming
factor!
Hershey and Chase’s Experiments, 1952
35S
remains
outside cells
Virus particle
coat proteins
labeled with 35S
DNA being
injected into
bacterium
Virus DNA
labeled with 32P
32P
remains
inside cells
Labeled DNA
being injected
into bacterium
Prova biochimica che il fattore trasformante di Griffith era il DNA.
Genoma
La conferma che il DNA è la sede dell’informazione genetica.
insieme delle informazioni genetiche che
sono costituite dai geni, dalle loro
sequenze regolative e dalle sequenze di
24
DNA non codificanti
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INFORMAZIONE GENETICA NEI PROCARIOTI.
L’informazione genetica della cellula procariotica è
costituita dal DNA cromosomale (uno o più
cromosomi) e dal DNA extracromosomale (plasmidi).
Cromosomi e plasmidi possono essere sotto forma di
molecole sia circolari sia lineari.
I due tipi di DNA possono essere portatori di diverse
classi di elementi genetici (genomi virali, plasmidi e
trasposoni).
Prokaryotic Chromosomes
La lisi della cellula batterica,
con trattamenti delicati,
libera il cromosoma sotto
forma di molecola continua
di DNA di dimensioni molto
superiori alla lunghezza del
batterio.
Eukaryotic Chromosomes
Many prokaryotes contain a single
circular chromosome
Eukaryotes contain multiple linear
chromosomes
P. chromosomes are condensed in the
nucleoid via DNA supercoiling and the
binding of various architectural proteins
E. chromosomes are condensed in a
membrane-bound nucleus via histones
Transcription and translation occur
simultaneously
Transcription occurs in the nucleus, and
translation occurs in the cytoplasm
Most prokaryotes contain only one copy
of each gene (i.e., they are haploid).
Most eukaryotes contain two copies of
each gene (i.e., they are diploid).
Nonessential prokaryotic genes are
commonly encoded on
extrachromosomal plasmids
Extrachromosomal plasmids are not
commonly present in eukaryotes.
P. genomes are efficient and compact,
containing little repetitive DNA.
E. contain large amounts of noncoding
and repetitive DNA.
La figura illustra in modo
approssimativo le
dimensioni del DNA non
compattato rispetto alle
dimensioni della cellula.
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LE PRINCIPALI PROTEINE ASSOCIATE AL NUCLEOIDE
Science, 1995, Vol 269:496-512
1.83 Mbp
How many base pairs are there in the E. coli chromosome?
kb (= kbp) = kilo base pairs = 1,000 bp
Mb = mega base pairs = 1,000,000 bp
Mar. 2014: 3654 citazioni
Mar. 2015: 3769 citazioni
Mar. 2016: 3909 citazioni
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La figura riporta l’estensione delle dimensioni dei genomi (in pb) nei tre domini e le
dimensioni del genoma in alcune specie di riferimento.
ESEMPIO DI POLIMORFISMO ALL’INTERNO DI UNA STESSA SPECIE
Bacterial chromosomes ranges from 0.6 Mbp to over 10 Mbp
Archael chromosomes range from 0.5 Mbp to 5.8 Mbp
project
E. coli K-12
I due ceppi di E. coli, non patogeno (MG1665) e patogeno (EDL933), hanno 4,1 x 106
pb in comune e differiscono per sequenze specifiche (5 x 105 per il primo e 1,3 x 106
per il secondo).
disease
nonpathogen;
reference
strain
strain
genome plasmid(s)*
size
status
MG1655
4.6 Mb
(none) published (1997)
E. coli O157:H7 haemorrhagic EDL933
(EHEC)
colitis,
haemolytic
uremic
syndrome
5.4 Mb
2 published (2001)
uropathogenic cystitis,
CFT073
E. coli
pylonephritis
(UPEC)
5.2 Mb
(none) published (2002)
E. coli K1
(NMEC)
5.2 Mb
septicemia,
neonatal
meningitis
Brook, Biologia dei
microrganismi – 1
Microbiologia generale
RS218
1 finishing (assembly in 3
contigs)
updated
June 10, 2004
Feb 13, 2001
Dec 5, 2002
May 17, 2006
36
9
04/03/2016
 I genomi procarioti sequenziati hanno dimensioni che vanno da
0,16 Mbp a 13 Mbp, e sono noti genomi anche di dimensioni
maggiori.
PERCENTUALE DI DNA NON CODIFICANTE IN ALCUNE SPECIE
RIFERIMENTO.
Notare il notevole incremento di DNA non codificante per proteine negli eucarioti.
DI
 Il più piccolo genoma procariote ha dimensioni minori di quelle del
genoma virale più grande.
 I genomi procarioti più grandi hanno più geni di alcuni genomi
eucarioti.
 Molti geni possono essere identificati attraverso la loro similitudine
di sequenza con i geni che si trovano in altri organismi.
 Il contenuto genico nei procarioti è caratteristicamente
proporzionale alle dimensioni del genoma.
 Una significativa percentuale di geni sequenziati, però, è ancora a
funzione sconosciuta.
Genes with known
function: ~ 40%
Genes with unknown
function: ~60%
In ogni genoma esaminato circa
¼
“ipotetico”
39
Brook, Biologia dei microrganismi – 1 Microbiologia generale
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Summary of the shifts in gene content with genome size in prokaryotic genomes.
Konstantinidis K T , and Tiedje J M PNAS 2004;101:31603165
Pelagibacter ubique
1,308,759 bp, 30% of the cell volume
R.F. DOOLITTLE Nature 416, 697 - 700 (2002)
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Stages of genome reduction in host-restricted bacteria for which small
population sizes and an asexual life cycle result in mutation fixation.
Note that some symbionts and pathogens (such as Rhizobium spp. and Vibrio fischeri) that can persist
in the outside environment and that re-infect hosts frequently do not undergo these genomic changes
Genes involved in informational processing are in blue, those involved in vitamin
or amino acid biosynthesis are in maroon, ribosomal RNA genes are in green,
other genes are light grey and breaks are non-coding regions.
A minimal genome was defined in 1999 by A. Mushegian as a genome
containing the smallest number of genetic elements sufficient to build a
modern-type free-living cellular organism. Consequently, the concept
of minimal genome is fundamentally related with the definition of a
minimal cell.
A minimal cell is a hypothetical biological system that
posses only the necessary and sufficient attributes to be
considered alive. Therefore, it must be able to maintain its
own structures (homeostasis); self-reproduce; and evolve
in a supportive, protected, and stable environment.
(R. Gil, 2011)
How Simple Can Life Get? . . . It’s complicated
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The total number of prokaryotic cells on earth has been estimated
Metagenomica
to be approximately 4-6 × 1030
Metagenomica (detta anche genomica ambientale) è lo
studio dei genomi recuperati da ambienti piuttosto che da
singoli organismi
Comunità intestinali, comunità marine (es. i batteri del mar
dei Sargassi), biofilm …..
In a particular environment, the sum of all microbial genes
corresponds to the METAGENOME.
"whole-genome
shotgun sequencing"
Sargasso Sea,
Bermuda
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Fig. 1. MODIS-Aqua satellite image of ocean chlorophyll in the Sargasso Sea grid about the BATS site
from 22 February 2003
1700 litri
filtri:0.1-3.0 micron
J. C. Venter et al., Science 304, 66 -74 (2004)
"whole-genome shotgun sequencing"
Sargasso Sea, Bermuda
 1.045 miliardi bp di sequenze non ridondanti analizzate
 1800 specie, di cui 148 sconosciute
 1.2 milioni di geni
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Complete Genome Projects
Metagenomi: 637
L’analisi metagenomica del terzo
segmento dell’intestino posteriore delle
termiti ha rivelato la presenza di 12
Phyla e 216 filotipi (nessuno collocabile
nel dominio Archaea)
MetaHIT (Metagenomics of the Human Intestinal Tract)
January 1, 2008 - June 30, 2012
project financed by the European
Commission under the 7th FP program. The
consortium gathers 13 partners from
academia and industry, a total of 8 countries.
Its total cost has been evaluated at more than
21,2 million €
Of the 395 bacterial phylotypes, 244 (62%) were novel and 80%
March 4 2010
represented sequences from species that have not been cultivated
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Why bacteria matter in animal development and evolution
BioEssays
Volume 32, Issue 7, pages 571-580, 11 JUN 2010 DOI: 10.1002/bies.200900192
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bies.200900192/full#fig2
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Trends in Biotechnology
Volume 28, Issue 12, December 2010, Pages 611-618
Number of publicly available genome sequences for selected bacterial pathogens
Species
N. of draft (or “in
progress”) genomes
N. of finished
genomes
Bacillus anthracis
20
6
Bacillus cereus
43
9
Borrelia burgdorferi
12
5
Chlamidia trachomatis
23
20
Clostridium botulinum
8
11
Escherichia coli
270
38
Haemophilus influenzae
25
4
Listeria monocytogenes
24
6
Mycobacterium tuberculosis
71
5
Salmonella enterica
62
18
Staphylococcus aureus
69
21
Streptococcus pneumoniae
186
12
Yersinia pestis è
considerato un clone di
Y. pseudotuberculosis
(batterio del suolo)
comparso negli ultimi
1.500 – 20.000 anni
Three biovars (Antiqua, Medievalis, and Orientalis) have been distinguished
within the Y. pestis clone.
3 PANDEMIE
~ 200
milioni
di morti
6th sec., Africa/Asia
14th sec., Europa (1/3 popolazione europea)
19th/20th sec., Asia
Negli ultimi 20 anni ci sono stati da 1000 a 5000 casi di peste e da
100 a 200 decessi all’anno (WHO)
The formation of each pathogenic lineage in the Yersinia genus is marked by key gene gain and
gene loss events.
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(A) Map showing countries with known presence of plague in wild reservoir species
(B) Annual number of human plague cases over different continents, reported to WHO
1954–2005.
(C) Cumulative number of countries that reported plague to WHO since 1954.
The ancient sequence is surprisingly similar to modern Y. pestis strains.
It differed from modern strains at only 97 positions all of which matched
the ancestral genes from Yersinia psuedotuberculosis.
tight genetic conservation in this organism over the last 660 years
The genes of the Black Death clones do not have significant
genetic differences that would make the ancient clone(s) more
virulent than modern strains.
East Smithfield
(fossa comune scavata tra il 1348 e il 1349 per seppellire le vittime della pandemia)
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“genomics era”
‘population genomics era’
collection of multiple genomes of a
bacterial species
(or another discrete taxonomic unit)
PAN-GENOME
A pan-genome is the sum of all genomes of similar strains; each having
similar (core genome) or distinct (cenomes) sets of nonpersistent genes.
∼500 persistent genes form the paleome.
Phenotype
Ensable of observable characteristics of an organism
Genotype
Organism’s genetic material
Gene
discret unit of genetic information
1 MEGABASE PROKARYOTIC
DNA = 1000 ORFs
Mutation
process by which genes undergo a structural change
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