Influenza aviare (H5N1) e influenza H1N1
Come protteggere me stesso, la mia famiglia e la collettività
Azienda Ospedaliera L. Sacco – Milano
5 Ottobre 2009
Epidemiologia e diagnosi
dell’influenza aviare in Italia
Ana Moreno Martin
Istituto Zooprofilattico Sperimentale
della Lombardia e dell’Emilia Romagna - Italy
1
Influenza aviare: una “nuova”
emergenza?
NON è una malattia nuova
Segnalata da un veterinario Perroncito, nel
1878 !!!
Identificazione dell’agente causale come un
microrganismo filtrabile (1902 Centanni e
Savonuzzi)
A/Chicken/Brescia/1902 H7N7
Conosciuta ad inizio secolo scorso come peste
lombarda (Hutyra & Marek)
2
Eziologia
AIV
Orthomyxoviridae
Influenzavirus tipo A
Sottotipi
Haemagglutinin (16)
Neuraminidase (9)
NA
HA
Multiple combinazioni
HA-NA
3
Specie ospiti dei virus influenzali
Sensibilità ad H e N
H7
H15
H16
4
Virus influenzali
Affinità tra proteina H e sito recettoriale
2 tipi di recettori:
9 SAα2,3Gal – Virus aviari, equini
9 SAα2,6Gal – Virus umani, suini
Specificità recettori - mutazioni aa nella HA
L226, S228 SAα2,6Gal
Q226, G228 SAα2,3Gal (Vilnes et al, J Virol, 1998)
V135S, A138S >affinità SAα2,6Gal (Das et al, J Comput
Chem, 2009)
5
Distribuzione dei recettori nei
tessuti ospiti
Uomo
Recettori SAα2,6Gal - faringe, trachea, bronchi
Recettori SAα2,3Gal – bronchioli, alveoli
Prove Istochimica (lectine):
Sambucus nigra - SA α2,6 Gal
(verde)
Maackia amurensis- SA α2,3 Gal
(rosso)
Nature(2006), 440:435-436
6
Distribuzione dei recettori nei
tessuti ospiti
Anatra
Recettori SAα2,3Gal – trachea,
intestino, rene
Recettori SAα2,6Gal - rene
Pollo
Recettori SAα2,6Gal – trachea,
rene
Recettori SAα2,3Gal – intestino
J Mol Genet Med(2009) 3:143-151
7
RESERVOIRS
SPILLOVER
DEAD-END
hosts
?
GENE POOL
Contesto Ecologico
interconnessione tra ospiti
serbatioi, spillover, aberranti
8
Ospite reservoir
Anseriformi: anatre, oche, cigni
Caradriiformi: gabbiani, rondini marine, trampolieri
Mantiene l’infezione
Non contrae la malattia o solo in forma lieve
Animali giovani
Ciclo oro-fecale
9
Flussi migratori
Flussi migratori di
A.platyrhincos, A. querquedula
in Eurasia ed Africa ed A.
discors in America
Aree di riproduzione
Aree specie presenti
tutto l’anno
Aree di ivernazzione
10
Science 312, 384 (2006)
Ospite spillover
Pollame domestico
Suscettibile all’infezione se esposto
Trasmette l’infezione ad altri ospiti
Non mantiene la disseminazione virale per
lungo tempo
Una malattia più grave dei reservoir
Ciclo respiratorio
11
Ospite aberrante
S’infetta raramente
di solito contrae una malattia grave
ininfluenti nella epidemiologia della malattia, ma possono
esserne gravemente colpiti
Infezione H5N1:
uomo, cane, gatto,
tigre, leopardo
12
Influenza aviare:due malattie
Distinte per:
-
Sintomatologia clinica indotta nei volatili
Caratteristiche degli stipiti virali:
Influenza aviaria a
bassa patogenicità
(LPAI)
Influenza aviaria ad
alta patogenicità
(HPAI)
H5, H7
13
Basi molecolari della patogenicità
Virus a bassa
patogenicità
Virus ad alta
patogenicità
Possiedono un solo aminoacido
basico nel sito di “cleavage”
Possiedono più aminoacidi basici
nel sito di “cleavage”
Es. sequenze aminoacidiche H7:
Es. sequenze aminoacidiche H7:
-PEIPKGR*GLF-,
-PENPKGR*GLF-
-PEIPKKKKR*GLF-, PETPKRKRKR*GLF-,
-PEIPKKREKR*GLF-, PETPKRRRR*GLF-
14
Patogenesi e patogenicità
Fusione envelope con membrana cellula
ospite
Peptide di fusione dell’emoagglutinina
ALTA
BASSA
liberato da enzimi
presenti in tutti i
tessuti
liberato da enzimi
presenti solo in tessuti
respiratori ed enterici
Entrata virione nella cellula
Replicazione
Fuoriuscita del virione
15
Virus influenzali H5, H7
Uccelli acquatici selvatici: virus a bassa
patogenicità
Pollame domestico: adattamento dei virus
influenzali
HA addizione siti di glicosilazione
NA delezione aminoacidi
Virus H5 e H7: variazione della patogenicità
(drift antigenico)
Influenza aviaria a bassa virulenza (H5 e H7) LPAI
Influenza aviaria ad alta virulenza (HPAI)
16
Disposizioni legislative
DIR 2005/94/CEE
Influenza aviaria - infezione del pollame o
altri volatili causata da virus influenzale A:
sottotipi H5, H7
IVPI > 1,2 nei pulcini di 6 sett
Manuale OIE maggio 2005
Notifiable Avian Influenza Virus (NAI)
HPAIV, tutti AIV H5 e H7
LPAIV – tutti i virus non NAI
17
H7N1 LPAI – 1999 (tacchini)
18
H7N1 HPAI -1999-2000 (tacchini)
19
H7N1 HPAI- 1999-2000 (anatre)
20
Influenza aviare
Italia
1998
H5N2 (HPAI) Veneto
H5N9 (LPAI) Emilia Romagna
1999-2001 H7N1 ca. 500 milioni €
¾ Marzo - Dicembre 1999
199 LPAI focolai
¾ Dicembre 1999 – Aprile 2000
413 HPAI focolai
¾ Agosto- Marzo 2001
73 LPAI focolai
21
Influenza aviare - Italia
2002-2004 H7N3 (LPAI) ca.45 milioni €
¾ Ottobre 2002 – Settembre 2003: 388 focolai
¾ 15 settembre 2004 – 06 novembre 2004: 28 focolai
22
Influenza aviare - Italia
2005 H5N2 (LPAI) ca.1,8 milioni €
¾ 12 aprile-10 maggio: 15 focolai Lombardia
23
Influenza aviare - Italia
2007 H7N3 (LPAI)
¾Mag-Ott: 17 focolai
H5N2 (LPAI):
1 focolaio Emilia Romagna
24
Influenza aviare - Italia
2009 H5N7 (LPAI)
Apr- Mag: 4 focolai
Veneto, Lombardia
H7N3 (LPAI)
Apr- 1 Sett: 4 focolai
22 H7
25
AIV in uccelli acquatici
LPAI (H4N6)
MALLARD
BRESCIA PROVINCE
07/11/2005
LPAI (H10N7)
MALLARD
CREMONAPROVINCE
10/04/2006
LPAI (H11N9)
MALLARD
PAVIA PROVINCE
2005
LPAI (H5N1)
MALLARD
MODENA PROVINCE
2005
26
Diagnosi
27
Ricerca antigene o genoma virale
Immunofluorescenza: sensibilità
bassa, specificità buona per influenza
tipo A
ELISA sandwich (per nucleoproteina
tipo A)
Kit immunoenzimatici
Rt-PCR: real time
tradizionale
28
Directigen
Flu A BD
TQ
-1
-2
-3
-4
-5
Anigen
AIV Ag
Animal
Genetics Inc
Sensibilità
equivalente dei
tre test
C+
C-
5F10
Np-A
ELISA
29
Ricerca genoma virale
PCR Tradizionale
gene M
- Fouchier et al, J Clin Microbiol, 2000
- Sapckman et al, J Clin Microbiol, 2002
H5, H7
- Diagnostic manual of avian influenza
2005/94/EC
H9
- Slomka et al, Av Dis, 2007
Real time
Diagnostic manual of avian influenza
2005/94/EC
gene M, H5, H7
- Sapckman et al, J Clin Microbiol, 2002
H9
- Monne et al, J Clin Microbiol, 2008
30
Diagnosi virologica
ISOLAMENTO VIRALE
Uova embrionate di pollo 9-11 gg via i.a.
Colture cellulari (MDCK)
Identificazione
Tipo A Mab based sandwich ELISA (NPA)
Sottotipo tipizzazione antigenica
Emoagglutinina: HI
Neuraminidasi: NI
Mab based sandwich ELISAs H5, H7, N1-N9
31
H5N3
H7N1
H7N3
H7N7
H2N2
H1N2
H3N2
H4N6
H1N1
NEG
PMV2
PMV3
PMV4
H6N2
H9N2
H9N8
H10N4
NDV
H5N2
C+
C-
NEG
PMV2
PMV3
PMV4
H6N2
H9N2
H9N8
H10N4
NDV
H5N2
C+
C-
H5N1
Elisa virologica sandwich H5
Mab 5D8
NEG
H1N1
H4N6
H3N2
H1N2
H2N2
H7N7
H7N3
H7N1
H5N3
H5N1
H5N2
H5N2
NEG
Tipizzazione Hemagglutinina
Elisa virologica sandwich H7
Mab 7A4
32
Tipizzazione Neuraminidasi
N1
H8N4
H1N1
H5N2
H6N2
H6N5
H7N3
H9N3
H5N1
N2
N3
N4
N5
NpA(Ctrl+)
N6
N7
N8
N9
NpA(Ctrl+)
H4N6
H9N8
H10N7
H11N9
H3N8
H13N6
NDV
H7N7
Mab platform sandwich ELISA
33
Diagnosi sierologica
Ab verso Ag di gruppo
(Tipo A):
AGID
ELISA ( indiretta o
competitiva)
Ab sottotipo specifici
Anti-HA (16 H ≠):
HI
ELISA (H5 o H7)
Anti-NA(9 N ≠):
IF
Proteine M1 e NP
ELISA
Antigeni profondi
tipo-specifici
Proteine HA e NA
Antigeni superficiali
sottotipo-specifici
Heinen Vet Science Tomorrow,
2002
34
Elisa sierologica H5, H7
H5N2 sieri positivi di campo
H5
C+
H6/9
POS
H5N2 sieri positivi di campo
H5
C+
NEG
H7N3 sieri positivi di campo
H6/9
POS
Se= 100% (IC95%)
Sp= 98.5%(IC95%)
NEG
H7N3 sieri positivi di campo
NEG
H7
C+
Elisa competitiva H5
MAb 5D8/5D8Hrp
H6/9
POS
H6/9
POS
NEG
H7
C+
Elisa competitiva H7
Mab 7A4/7A4Hrp
Se= 99.7%(IC95%)
Sp= 100% (IC95%)
700 sieri pollo, tacchino : 200 –, 331 + H7, 113 + H5, 36 + H7/H 5
35
H7N1
H5N2
H7N3
100%
1404 sieri: 595 pollo, 717 tacchino, 75
anatra, 14 quaglia, 10 struzzi
Moreno et al, Vaccine, 2009
H7N3
H7N3
H9N2
H5N2
H1N1
H7N1
100% NEGATIVI
ELISA PER AC ANTI-N1
ELISA PER AC ANTI-N3
H7N1
H5N2
%
INIBIZI
ONE
SN
SP
N1
75
1
0,994
N2
75
0,976
0,995
N3
75
0,990
0,990
ELISA PER AC ANTI-N2
100%
H7N1
H7N3
100%
H7N3
H7N3
H9N2
H5N2
H1N1
100% NEGATIVI
H5N2
H7N1
H7N3
H7N3
H9N2
H5N2
H1N1
H7N1
100% NEGATIVI
H7N3
ELISA
36
Grazie per l’attenzione
Non fai ridere
proprio per niente
37
