11 SUINI Large Animals Review, Anno 11, n. 2, Aprile 2005 INFEZIONI SPERIMENTALI CON CEPPI DI VIRUS DELLA PRRS (PORCINE RESPIRATORY REPRODUCTIVE SYNDROME) IN SUINI SVEZZATI E SCROFE GESTANTI MAURA FERRARI*, CINZIA ROBOTTI*, ARRIGO NIGRELLI**, CARLO ROSIGNOLI**, PAOLO BORGHETTI***, ANNAMARIA CANTONI***, ATTILIO CORRADI*** *Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Centro Substrati Cellulari, ** Sezione di Mantova, ***Dipartimento di Salute Animale, Università degli Studi di Parma Riassunto Quattro ceppi virali isolati in corso di forme cliniche di PRRS sono stati utilizzati per studiare la virulenza “in vivo” su suini di 30 giorni e su scrofe gestanti. I ceppi virali sono stati scelti sulla base delle sequenze geniche della regione ORF 5 per la loro distanza dal ceppo europeo di riferimento rappresentato dal virus di Lelystad. Per ciascun ceppo sono stati inoculati 5 soggetti e 3 sono stati tenuti a contatto durante un periodo di osservazione di 40 giorni. Gli animali dei 4 gruppi hanno manifestato un rialzo termico, più o meno protratto e il virus è stato dimostrato nel sangue per tempi variabili fra i 3 e i 26 giorni post-infezione e a livello degli organi con particolare riferimento a polmoni e amigdale. Tre suini infettati con il ceppo 162/P/2000 e due infettati con il ceppo 114/P2000 sono stati soppressi prima del 40° giorno rispettivamente a causa di grave deperimento e di sintomatologia respiratoria. I ceppi utilizzati hanno presentato nel complesso una virulenza non elevata e più bassa di quella documentata per i cosiddetti ceppi “atipici” nordamericani. Solo per un ceppo le lesioni anatomopatologiche prodotte sono state indicative di una maggiore aggressività e sono state registrate manifestazioni respiratorie rilevanti, anche se probabilmente aggravate da una concomitante infezione batterica nel gruppo sperimentale. Le scrofe infettate con due diversi virus hanno entrambe mostrato viremia con nascita a termine di suinetti morti (rispettivamente 9 su 16 e 6 su 12). I risultati confermano che una difformità delle caratteristiche genetiche/antigeniche è associata a differenze nella virulenza, la cui espressione in campo può essere ampiamente influenzata da altri fattori, come la linea genetica dei soggetti, le condizioni di allevamento, le patologie intercorrenti e naturalmente lo stato immunitario specifico. Summary Four viral strains isolated from clinical cases of PRRS were used for experimental trials to study the virulence on 30 days pigs and pregnant sows. The strains were selected on the basis of the low sequence homology in the ORF5 region with the Lelystad European reference strain. For each strain 8 pigs were selected, of which 5 were inoculated with the virus and 3, untreated, were left into contact. The animals were observed for 40 days post-infection. The four groups showed a febrile response with viremia and the virus was reisolated from day 3 to 26 p.i. from blood and organs (i.e. lungs and tonsils). Three pigs infected with the strain 162/P/2000 and two infected with the strain 114/P2000 showed respectively severe recumbency and severe respiratory symptoms and were sacrificed before the day 40th. The four viral strains definitely exhibited a moderate virulence, lower than that reported for the so called “atypical” North American PRRSV. Significant pathological changes were seen only in the group of pigs infected with the strain 114/P2000, in which a concurrent bacterial infection was also observed. The inoculated sows showed viremia and stillbirth (9/16 and 6/12 dead piglets respectively). These results confirm the relationship between the genetic/antigenic differences and the virulence variability for the PRRSV strains and also suggest that in field conditions the expression of symptoms could be widely influenced by the genetic of animals, environmental factors, other concurrent diseases and specific immunity status. 12 Infezioni sperimentali con ceppi di virus della PRRS in suini svezzati e scrofe gestanti INTRODUZIONE Il virus designato comunemente con la sigla PRRS (porcine reproductive respiratory syndrome) è stato isolato per la prima volta in Olanda nel 1991 nel corso di episodi infettivi contraddistinti da turbe dell’apparato riproduttivo, elevata nati-mortalità e forme respiratorie nella fase dello svezzamento e dell’ingrasso13, 14. Negli anni successivi tale infezione si è andata gradualmente propagando ed attualmente può essere ritenuta ubiquitaria nella popolazione suina della maggior parte dei Paesi ed è causa di ingenti danni economici. Essa inoltre, deprimendo le difese naturali dell’organismo, predispone ed aggrava infezioni da parte di agenti batterici e virali comunemente presenti nell’allevamento, con conseguente aggravamento delle manifestazioni cliniche di maggiore gravità. Appare evidente che la persistenza negli allevamenti di questa infezione costituisce una minaccia continua allo stato sanitario degli animali con ripercussioni economiche molto significative. I virus della PRRS (Fig. 1), appartenenti al genere Arterivirus, sono comunemente suddivisi in due diversi gruppi antigenici, definiti “virus nord-americani” e “virus europei”. Tra i ceppi dei due differenti gruppi ma anche tra quelli dello stesso gruppo, esiste un’ampia variabilità antigenica principalmente attribuibile a differenze a livello della regione genomica ORF5 codificante per la glicoproteina E di superficie1, 3, 4. Tali differenze sembrano influire sulle caratteristiche biologiche dei ceppi virali poiché accanto ad episodi di malattia conclamati si riscontrano frequentemente episodi sub-clinici11, 12. Sulla base di questi presupposti lo scopo del presente lavoro è stato di accertare mediante prove in vivo, l’eventuale correlazione tra la variabilità antigenica e la virulenza presentata da ceppi di PRRS il cui genoma ha rilevato differenze genetiche di rilievo. FIGURA 1 - PRRSV: Particella virale completa di core nucleocapsidico circondato da envelope. MATERIALI E METODI Ceppi virali I ceppi virali selezionati per la sperimentazione sono stati scelti sulla base dei risultati ottenuti in una precedente fase operativa in cui sono stati analizzati campioni di polmoni, linfonodi, milza, organi fetali e sieri di animali con manifestazioni cliniche conclamate o con forma sub-clinica. Gli animali provenivano da vari allevamenti situati nell’area compresa tra le province di Brescia, Bergamo, Cremona, Lodi, Parma e Reggio Emilia. Dei 425 campioni pervenuti, 300 sono stati analizzati e di questi 171 sono risultati positivi all’indagine relativa all’amplificazione con primers6 diretti verso la regione genomica ORF7. Tale regione infatti, a causa della maggiore stabilità, viene utilizzata in campioni diagnostici come bersaglio per la identificazione di sequenze virali del virus della PRRS. Dei 171 campioni positivi 54, rappresentativi dei differenti conferimenti, sono stati successivamente amplificati con primers6 diretti verso la regione ipervariabile ORF5 e sottoposti all’analisi di sequenziamento. Dall’analisi filogenetica dei diversi campioni, svolta utilizzando il programma Clustalw Routine (http://www.ebi.ac.uk), 5 ceppi, identificati con la sigla BS/P/55/2000, BS/P/114/2000, BS/162/P/2000, BS178/ FIGURA 2 - Analisi filogenetica dei 54 ceppi di PRRSV sottoposti a sequenziamento del frammento ORF5. In rosso i 4 ceppi utilizzati per le infezioni sperimentali; in verde il ceppo di riferimento Europeo Lelystad. P/2000 e BS/P/418/2003 hanno mostrato elevate differenze rispetto al ceppo di referenza europeo di Lelystad (sequenza depositata GeneBank M96262) (Fig. 2). In una fase successiva, quattro di tali virus sono stati coltivati in cellule di macrofagi alveolari di suini SPF (MAS) previamente controllate nella sensibilità al virus, al fine di allestire stocks virali. Le cellule sono state infettate con gli stessi campioni (sieri utilizzati tal quali o surnatante ottenuto dall’omogeneizzazione dei campioni di tessuto/organi) risultati precedentemente positivi alla PCR per l’ORF7. Animali Sono stati impiegati suini LargeWhite-Landrace x Duroc di 30 giorni di vita di allevamenti convenzionali, ma sierolo- gicamente negativi e indenni da PRRS. Sono inoltre stati utilizzati animali gestanti provenienti dal nucleo SPF dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, noti essere indenni da tale infezione. Infezione sperimentale I campioni di tessuto polmonare dei suini infettati con i ceppi virali selezionati (114/P/2000, 55/P/2000 e 162/P/ 2000), isolati nel corso di focolai respiratori in suini di allevamenti delle province di Brescia e Mantova, ed il ceppo 418/P/2003, isolato da un omogenato di polmone di un suino proveniente da un’azienda con problemi riproduttivi, sono stati utilizzati tal quali per le indagini sperimentali. Rianimalizzazione Ciascun ceppo virale è stato inizialmente inoculato per via endonasale (e.n.) in ragione di 2 ml in un suino di 30 giorni quotidianamente sottoposto ad esame clinico ed a prelievi ematici per accertarne la viremia. Ad infezione conclamata gli animali sono stati sacrificati e gli organi bersaglio (polmoni, amigdale, linfonodi tracheobronchiali) ed il siero sono stati prelevati e sottoposti ad indagini di laboratorio al fine di accertare la presenza di PRRSV. In caso di positività si è scelto il polmone che, previa omogeneizzazione, è stato utilizzato come matrice virale per le successive prove sperimentali. Suini di 30 giorni di vita Sono stati utilizzati quattro gruppi ciascuno costituito da undici soggetti. Per ciascun gruppo, cinque suini sono stati inoculati per via e.n. con 2 ml della matrice virale il cui titolo è stato uniformato a 103,50 DCP50/ml, tre suini non infettati sono stati mantenuti a contatto con i cinque animali trattati e quale gruppo di controllo, altri tre soggetti sono stati sottoposti a trattamento placebo e alloggiati in stabulari totalmente separati ma allevati nelle medesime condizioni ambientali sperimentali. Animali gestanti Gli animali al 90° giorno di gestazione sono stati infettati sperimentalmente per via endonasale-orofaringea con due dei campioni virali risultati più virulenti nelle prove sperimentali eseguite sui giovani suini (BS/114/P/2000, BS/162/P/2000). Dopo l’infezione sono stati eseguiti controlli sistematici al fine di poter rilevare eventuali manifestazioni cliniche, aborti od altri eventi irregolari ed ascrivibili all’infezione virale indotta. Rilievi clinici ed indagini di laboratorio I suini sono stati quotidianamente sottoposti ad osservazioni cliniche con rilievi termometrici. È stato inoltre monitorato il peso di ogni animale dall’inizio (T0) alla fine (T21-33) del trial. Sono stati anche eseguiti prelievi ematici ad intervalli pre-determinati (T0, 15 giorni dall’infezione e al momento dell’abbattimento o morte). Sia il siero che i leucociti sono stati controllati per la presenza virale trami- 13 te RT-PCR ed inoculazione su cellule MAS. Per ciascun campione sono stati eseguiti due passaggi seriali, su ciascuno dei quali la presenza virale è stata accertata sempre mediante PCR. Il medesimo iter investigativo è stato applicato agli omogenati d’organo (amigdale, polmoni e linfonodi tracheobronchiali) ottenuti dai suini sacrificati al termine dell’esperimento che in media si è protratto per 40 giorni. Per l’identificazione dell’acido nucleico di PRRSV, l’RNA virale è stato estratto mediante Nucleospin®RNAII kit (Macherey-Nagel) ed utilizzato nella successiva reazione di RT-nested-PCR specifica per la regione ORF76. Il titolo anticorpale sui campioni di siero è stato analizzato tramite un kit commerciale ELISA (IDEXX) e, sulla base delle indicazioni fornite dal produttore, sono stati considerati positivi i campioni con un rapporto S/P > 0.4. I leucociti ottenuti mediante centrifugazione sono anche stati posti in incubazione con anticorpi anti CD4 (topo anti-CD4 suino, Mab 74-12-4, VRDM) o con anticorpi anti CD8 (topo antiCD8 suino MCA 1223, SEROTEC), quindi nuovamente incubati con un anticorpo marcato anti-topo (DAKO) ed analizzati tramite citometria a flusso (Epics XL-MCL, Coulter). Al termine delle prove o in caso di grave sintomatologia clinica, i soggetti sono stati sacrificati e sottoposti ad esame anatomopatologico durante il quale sono stati prelevati campioni di polmoni e tessuti linfoidi, parte dei quali è stata utilizzata per le indagini virologiche e batteriologiche (se ritenute necessarie) e parte è stata fissata in formalina. I tessuti così trattati sono stati inclusi in paraffina (a 56°C-58°C) e successivamente dagli stessi sono state ricavate delle sezioni di 5 µm da destinarsi all’esame istologico ed immunoistochimico. Gli stessi tipi di indagine sono stati eseguiti su tutti i suini nati dalle scrofe infettate sperimentalmente e sugli organi bersaglio delle scrofe prelevati al momento dell’eutanasia. RISULTATI Suini di 30 giorni Comportamento clinico Gli animali dei quattro gruppi hanno presentato un rialzo termico mediamente dal 4° fino al 5°-6° giorno post–infezione (range 40.0-41.5°C). Solamente in due soggetti, inoculati rispettivamente con i ceppi BS/162/P/2000 e BS/418/P/2003, l’ipertermia si è protratta per tutta la durata della prova sperimentale. In alcuni casi sono stati osservati sporadici episodi di diarrea, lieve dispnea e tosse. Non sono state registrate variazioni significative di peso corporeo, ad eccezione di 2 suini infettati con il ceppo BS/162/P/2000 per i quali è stato rilevato un grave deperimento, e di un suino infettato con il ceppo BS/114/P/2000 che è andato incontro a decremento ponderale e tumefazione degli arti posteriori in corrispondenza dell’articolazione tibiotarsica. Tre suini infettati con il ceppo BS/162/P/2000 sono stai sacrificati in gravi condizioni prima della fine della prova (a T26) mentre per 2 suini infettati con il ceppo BS/114/P/ 2000 si è reso necessario l’abbattimento a causa della gravità della forma respiratoria manifestatasi. Le indagini batteriologiche hanno rilevato in questo ultimo gruppo, una concomitante infezione da Pasteurella multocida suggerendo la possibilità che la particolare severità dell’infezione rilevata sia da attribuirsi alla concomitante infezione batterica5. SUINI Large Animals Review, Anno 11, n. 2, Aprile 2005 14 Infezioni sperimentali con ceppi di virus della PRRS in suini svezzati e scrofe gestanti è stato rilevato tra T3 e T31 nel siero e nei leucociti. Le prove condotte sugli organi hanno rivelato una elevata presenza virale a livello di polmoni, amigdale e linfonodi. Il ceppo virale BS/114/P/2000 è stato rilevato nel siero e nei leucociti dei soggetti inoculati soprattutto tra T4 e T31. Ampia positività è stata riscontrata negli organi, soprattutto a livello di amigdale. L’isolamento del virus, per altro rivelatosi una metodica meno sensibile della RT-PCR, è stato effettuato più frequentemente dai leucociti che non dal siero, ad eccezione di quanto rilevato per il ceppo BS/55/P/2000. Nelle tabelle 1 e 2 sono riportati sinteticamente i risultati degli esami virologici eseguiti sugli organi degli animali sacrificati e sul siero e sui leucociti prelevati nel corso della sperimentazione. Indagini virologiche Il virus è stato rilevato in alcuni dei soggetti inoculati con il ceppo BS/55/P/2000; in particolare per quanto riguarda le prove condotte sul siero e leucociti, più frequentemente dai campioni prelevati tra T7 e T11. Relativamente agli organi esaminati invece, il virus è stato rilevato più frequentemente nei polmoni. La positività è risultata nettamente inferiore rispetto all’esame diretto dopo la inoculazione su cellule MAS. Nei soggetti inoculati con il ceppo BS/418/P/2003 è stato possibile rilevare il virus nel siero nel periodo compreso tra T3 e T12 e sino al 26° giorno nei leucociti. Risultati ampiamente positivi sono stati per altro ottenuti anche dall’analisi eseguita sui campioni di organo. Nel gruppo inoculato con il ceppo BS/162/P/2000 il virus Tabella 1 Positività per PRRSV in RT-PCR e dopo isolamento su macrofagi alveolari suini (MAS) sul totale dei campioni di organo esaminati per ciascun gruppo (animali infettati e animali a contatto) AMIGDALE CEPPO VIRALE METODICA POLMONI LINFONODI Infettati (+/Tot) Contatto (+/Tot) Infettati (+/Tot) Contatto (+/Tot) Infettati (+/Tot) Contatto (+/Tot) RT-PCR diretta 2/5 1/3 2/5 0/3 1/5 0/3 Isolamento su MAS 1/5 0/3 1/5 1/3 1/5 0/3 RT-PCR diretta 5/5 2/3 1/5 2/3 3/5 1/3 Isolamento su MAS 4/5 3/3 5/5 1/3 4/5 3/3 RT-PCR diretta 5/5 3/3 5/5 2/3 5/5 2/3 Isolamento su MAS 4/5 1/3 1/5 2/3 3/5 1/3 RT-PCR diretta 4/5 0/3 4/5 1/3 4/5 1/3 Isolamento su MAS 4/5 1/3 5/5 1/3 5/5 1/3 BS 55 BS 418 BS 162 BS 114 Tabella 2 Positività in RT-PCR per PRRSV su siero e leucociti nei diversi momenti di prelievo (giorni post infezione) sul totale dei campioni esaminati per ciascun gruppo (animali infettati e animali a contatto);*i soggetti mancanti sono stati sacrificati o non prelevati Infettati (+/Tot) Contatto (+/Tot) Infettati (+/Tot) Contatto (+/Tot) Infettati (+/Tot) Contatto (+/Tot) Infettati (+/Tot) Contatto (+/Tot) T6 (31 gg PI) Contatto (+/Tot) BS 114 T5 (25-26 gg PI) Infettati (+/Tot) BS 162 T4 (18-21 gg PI) Contatto (+/Tot) BS 418 T3 (10-13 gg PI) Siero 0/5 0/3 2/5 0/3 0/5 0/3 0/5 0/3 ND ND ND ND Leucociti 2/5 1/3 5/5 2/3 1/5 1/3 0/5 0/3 ND ND ND ND Siero 1/5 1/3 0/5 1/3 1/5 0/3 3/5 0/3 3/5 0/3 ND ND Leucociti 3/5 0/3 5/5 0/3 5/5 0/3 3/5 0/3 ND ND ND ND Siero 5/5 3/3 5/5 3/3 5/5 3/3 5/5 3/3* 2/3* 1/2* 1/2* 1/2* Leucociti 5/5 3/3 5/5 3/3 5/5 3/3 4/4* 1/2* 2/2* 1/2* 2/2* 1/2* Siero 4/5 0/3 5/5 0/3 5/5 0/3 2/5 0/3 3/3* 2/3 2/3* 2/3 Leucociti 3/5 0/3 5/5 0/3 5/5 0/3 2/5 0/3 2/3* 0/3 2/3* 2/3 CEPPO VIRALE E MATRICE BS 55 T2 (5-8 gg PI) Infettati (+/Tot) T1 (2-4 gg PI) Indagini sierologiche Sieroconversione è stata rilevata nella quasi totalità dei suini sottoposti ad infezione oltre che in due dei soggetti posti a contatto con il gruppo infettato dal ceppo BS/55/P/2000 ed in uno di quelli a contatto del gruppo infettato con il ceppo BS/418/P/2003. Per quanto concerne i gruppi dei suini infettati rispettivamente con i virus BS/162/P/2000 e BS/114/P/200, nonostante il frequente reisolamento virale e il deperimento dei soggetti, la presenza anticorpale è stata rilevata soltanto in alcuni dei suini infettati in entrambi i gruppi. Nei suini che costituivano il gruppo di controllo non è stato possibile rilevare presenza di virus o di anticorpi specifici per il virus stesso. Immunità cellulo-mediata Risultati contrastanti sono stati rilevati per i diversi ceppi virali. Nei suini infettati con i ceppi BS/55/P/2000 e BS/162/P/2000 si è registrato un incremento della popolazione linfocitaria CD8+ a partire dal 3° giorno post-infezione, con un picco massimo raggiunto tra il 7° ed il 10° giorno post-infezione. Nei soggetti infettati con il ceppo BS/418/P/2003 si evidenzia un più precoce decremento della sopraccitata popolazione linfocitaria (Fig. 3). Nessuna variazione significativa è stata invece registrata in questi gruppi relativamente ai linfociti CD4+. Inoltre, negli animali infettati con il ceppo BS/114/P/2000, è stata registra- 15 ta, tra il 4° ed il 6° giorno post infezione, una marcata diminuzione dei linfociti circolanti (popolazione totale), in particolare dei CD4+ e dei CD8+. Verso il 14° giorno è inoltre evidente la tendenza dei CD4+ a riassestarsi gradualmente verso i valori registrati a T0, mentre i CD8+hanno mostrato un recupero più graduale (Fig. 4). Osservazioni macroscopiche ed indagini istopatologiche All’esame anatomopatologico le lesioni macroscopiche rilevate a livello degli organi bersaglio nel gruppo dei soggetti sottoposti ad infezione sperimentale si sono rivelate simili a quelle riscontrate nei suini che costituivano i gruppi di controllo. Tuttavia, peculiari lesioni definibili quali foci di polmonite interstiziale e di iperplasia linfocitaria a livello degli organi linfatici principali, sono state individuate nei gruppi di suini infettati con i ceppi BS/55/P/2000 e Figura 5 - Polmone di suino: in un contesto di polmonite interstiziale si rilevano due cellule giganti multinucleate (frecce nere) (Eosina-Ematossilina 10x). FIGURA 3 - Andamento dell’immunità cellulo-mediata (% cellule positive) nei suini infettati con il ceppo BS/418/P/2003. FIGURA 4 - Andamento dell’immunità cellulo-mediata (linfociti/mm3) nei suini infettati con il ceppo BS/114/P/2000. Figura 6 - Polmone di suino: nel parenchima polmonare, presentante quadri di polmonite interstiziale, si rileva la numerosa presenza di elementi macrofagici immunopositivi per PRRSV (frecce rosse) (antiPRRSV 20x). SUINI Large Animals Review, Anno 11, n. 2, Aprile 2005 16 Infezioni sperimentali con ceppi di virus della PRRS in suini svezzati e scrofe gestanti BS/162/P/2000. Nei suini infettati con il ceppo BS/114/P/2000, su pregressi fenomeni di polmonite interstiziale (Figg. 5 e 6) si è instaurato un processo purulento probabilmente sostenuto, come riferito, da Pasteurella multocida. L’esame necroscopico dei due suini infettati con lo stesso ceppo e sacrificati prima del termine della prova ha evidenziato un’imponente polisierosite fibrinosa, linfoadenomegalia generalizzata e processi di epatizzazione polmonare. Inoltre nei soggetti infettati con il ceppo BS/418/P/2003 sono state riscontrate lesioni caratteristiche della polmonite interstiziale espresse in forma più severa rispetto a quanto riscontrato nel caso dei ceppi BS/55/P/2000 e BS/162/P/2000, così come più marcata era la linfopenia a livello di organi linfatici. Animali gestanti Nella scrofa infettata con il virus BS/114/P/2000 si è riscontrata una transitoria fase viremica nei primi 2 giorni dall’infezione con valori medi di temperatura di 40,1°C. Il parto è avvenuto regolarmente secondo il termine previsto con 9 soggetti morti e 7 vivi di cui successivamente, 2 sono venuti a morte per schiacciamento e altri 3 sono deceduti rispettivamente a 9, 14 e 15 giorni di vita. Il virus è stato reisolato al momento del parto dai leucociti e dal colostro, ma non dal siero della scrofa che è però risultato positivo a 9 giorni dall’infezione. L’isolamento è stato inoltre realizzato dagli organi bersaglio della scrofa (leucociti, polmone, amigdale e tessuto linfatico). Per quanto riguarda i suinetti, il virus è stato isolato in 5 campioni di siero di sangue dei suini vivi prelevati alla nascita prima dell’assunzione del colostro, da 11 campioni di polmone, da 8 campioni di fluido toracico dei soggetti nati morti e da 9 cordoni ombelicali. Viceversa, l’infezione attuata con il secondo virus BS/162/P/2000, è risultata di minore intensità in quanto non si è apparentemente rilevata alcuna viremia e successivamente all’eutanasia della scrofa, il virus è stato reisolato soltanto dai linfonodi. Dei 12 suini partoriti regolarmente a termine, 6 erano morti e 6 vivi. Il reisolamento virale è stato effettuato dal siero dei 6 suini vivi (prelevato prima dell’assunzione del colostro), dai cordoni ombelicali di 9 soggetti e rispettivamente da 6 polmoni e 5 campioni di fluido toracico dei suini nati morti. Entrambe le scrofe hanno presentato siero conversione con S/P ratio di 1,79 (BS/114/P/2000) e 3,5 (BS/162/P/2000). DISCUSSIONE I risultati della ricerca svolta evidenziano come i ceppi isolati in campo durante focolai respiratori e riproduttivi da PRRS non siano stati in grado di riprodurre, in condizioni sperimentali, manifestazioni cliniche rilevanti o di entità paragonabile a quella degli episodi clinici originari confermando i dati di letteratura10. Infatti anche in altri Paesi è stato segnalato come gli unici virus in grado di riprodurre forme respiratorie nei suini siano quelli isolati di recente negli Stati Uniti nel corso di problematiche riproduttive di particolare gravità e associati a mortalità nelle scrofe medesime e definiti come ceppi “atipici”. Nella sperimentazione condotta, l’unica eccezione è stata rappresentata dai suini infettati con il virus BS/114/P/2000 e BS/162/P/2000. In particolare, nei soggetti infettati con il ceppo virale BS/114/P/2000 si è riprodotta una sintomatologia clinica grave a carico dell’apparato respiratorio, che ha comportato la necessità d’abbattimento di alcuni degli animali coinvolti anche se deve essere sottolineato che, nel caso delle prove svolte si è evidenziata una concomitante infezione batterica da Pasteurella multocida ponendo quindi in dubbio la reale virulenza del ceppo virale. Nei soggetti infettati con gli altri ceppi, l’unico concreto segno clinico manifestatosi è stato invece il rialzo termico. Il virus è stato frequentemente reisolato dalla maggior parte degli animali che hanno invece presentato sieroconversione generalizzata. Gli esami anatomopatologici hanno inoltre confermato come il ceppo BS/418P/2003 fosse particolarmente più aggressivo del BS/55/P/2000 e del BS/162/P/2000, sebbene basandosi esclusivamente sui riscontri ottenuti dagli esami immunologici, non siano state evidenziate differenze significative relativamente alla reazione dell’immunità cellulo-mediata nei tre gruppi di suini infettati con i suddetti virus. Questi risultati così difformi sostanzialmente confermano quanto già riscontrato da altri autori7, 8 ovvero che nel corso di infezioni sperimentali è possibile riscontrare marcate differenze nelle manifestazioni cliniche che possono risultare particolarmente rilevanti soltanto se associate ad infezioni batteriche, come riscontrato nel gruppo infettato con il ceppo BS/114/P/2000. Conseguentemente, sebbene una correlazione fra caratteristiche genetiche/antigeniche e virulenza non possa essere non considerata, tuttavia altri fattori svolgono un ruolo di particolare importanza nella gravità degli episodi riscontrati nelle condizioni di campo. Fra essi debbono essere annoverati la linea genetica dei soggetti coinvolti, le condizioni manageriali, le condizioni sanitarie e lo stato immunitario degli animali. CONCLUSIONI Sulla base dei dati acquisiti dalla recente letteratura e da quanto emerso dalle prove sperimentali, appare evidente come la correlazione tra il virus della PRRS e l’organismo ospite sia del tutto peculiare. Proprio il meccanismo patogenetico, a tutt’oggi non completamente chiarito ed ancora in fase di studio, è la chiave del complesso meccanismo di evoluzione virale. Appare altresì chiaro che il ruolo rivestito dalla ORF5 in questo processo è di cruciale importanza. È stato evidenziato come il virus sia strutturato per evolversi ed adattarsi rapidamente ad un ambiente in continuo mutamento e che il dominio ipervariabile GP5 (glicoproteina E) incorra in fenomeni di ricombinazione e mutazione ad un ritmo sorprendentemente veloce. Il successo evolutivo di questo virus pare dipendere da variazioni sostanziali relative ai domini immunogenici fondamentali, affiancate dalla conservazione di residui che eventualmente possono andare incontro a mutazioni di minima entità11. Queste variazioni genetiche, ed in particolare la ricombinazione, comportano una maggiore difficoltà nel predire le future evoluzioni del virus della PRRS e di conseguenza la reale efficacia dei vaccini in campo. Al mo- mento attuale sono stati evidenziati sia eventi ricombinanti fra ceppi diversi16, sia la retromutazione di ceppi vaccinali e riacquisizione della virulenza2. Nell’insieme, tali risultati evidenziano come ideare un’efficace strategia vaccinale sia particolarmente complicato e difficile nel caso della PRRS. È stato evidenziato che in condizioni naturali i suini infettati dal PRRSV non sviluppano in tempi rapidi una risposta immunitaria protettiva e possono trascorrere dei mesi prima che venga raggiunta una completa eliminazione virale. È d’altra parte stato rilevato come il virus PRRS non sia in grado di attivare quei meccanismi iniziali in grado di stimolare una risposta umorale e cellulare efficace. La scarsa immunogenicità può essere a sua volta responsabile di una attivazione della replicazione virale che sembra proprio essere favorita dalla presenza di anticorpi a basso titolo15. Questa caratteristica non è solo propria dei ceppi di campo, ma è anche dei ceppi virali “attenuati” impiegati quali presidi immunizzanti. Pertanto solo una costante analisi epidemiologica volta a monitorare la variabilità dei ceppi di campo, in associazione al perfezionamento delle conoscenze relative alle proprietà e funzioni delle proteine virali e al loro ruolo nella stimolazione dei meccanismi immunologici, consentiranno di poter adottare quelle strategie in grado di indurre una reale prevenzione/protezione di questa infezione che, al momento attuale, sebbene non inclusa nell’elenco delle malattie a particolare gravità dell’OIE, è universalmente riconosciuta come la causa principale di problematiche sanitarie e di concomitanti gravi danni economici negli allevamenti suini. A tutt’oggi, in assenza di efficaci mezzi di prevenzione, viene altamente raccomandato il ricorso a rigidi protocolli di biosicurezza, relativi non solo alle norme igieniche ed al flusso degli animali nell’allevamento, ma anche alla gestione del materiale seminale9. Ciò nonostante, nessuna delle numerose strategie di controllo e prevenzione attualmente disponibili, da sola o in combinazione, rappresenta la risposta definitiva alla problematica PRRS. Sulla base di quanto rilevato e noto in campo internazionale, è possibile parlare di eliminazione della PRRS da un allevamento ma è ancora utopistico parlare di eradicazione, almeno fino a quando non verrà individuata la giusta strategia per interrompere la trasmissione indiretta del virus, evento che necessita ancora d’essere chiarito e compreso. A questo proposito non va dimenticato che la crescente concentrazione geografica degli allevamenti suinicoli potrebbe di per sé rappresentare un grosso ostacolo ai fini dell’eradicazione. Al momento pare dunque più realistico perseguire la via d’una migliore comprensione dei meccanismi patogenetici e del comportamento virale per poter focalizzare le risorse tecnologiche sulla preparazione di presidi innovativi in grado di arginare in modo concreto il dilagare di questa “nuova” patologia che, indubbiamente si configura come una delle più temibili per l’allevamento suino. Ringraziamenti La ricerca è stata effettuata nell’ambito di un Progetto parzialmente finanziato dal Ministero della Salute. Bibliografia 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Parole chiave PRRS, suino, virulenza, infezione sperimentale. Key words PRRS, pig, virulence, experimental infection. 17 15. 16. Andreyev V.G., Wesley R.D:, Mengeling W.L., Vorvald A.C., Lager K.M. 1997. “Genetic variation and philogenetic relationship of the 22 porcine reproductive and respiratory sindrome virus (PRRSV) field strains based on sequential analysis of open reading frame 5”. Arch. Virol. 142, 993-1001. 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