INFEZIONI SPERIMENTALI CON CEPPI DI VIRUS DELLA PRRS

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SUINI
Large Animals Review, Anno 11, n. 2, Aprile 2005
INFEZIONI SPERIMENTALI CON CEPPI DI VIRUS
DELLA PRRS (PORCINE RESPIRATORY
REPRODUCTIVE SYNDROME)
IN SUINI SVEZZATI E SCROFE GESTANTI
MAURA FERRARI*, CINZIA ROBOTTI*, ARRIGO NIGRELLI**, CARLO ROSIGNOLI**,
PAOLO BORGHETTI***, ANNAMARIA CANTONI***, ATTILIO CORRADI***
*Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Centro Substrati Cellulari,
** Sezione di Mantova, ***Dipartimento di Salute Animale, Università degli Studi di Parma
Riassunto
Quattro ceppi virali isolati in corso di forme cliniche di PRRS sono stati utilizzati per studiare la virulenza “in vivo” su
suini di 30 giorni e su scrofe gestanti. I ceppi virali sono stati scelti sulla base delle sequenze geniche della regione ORF 5
per la loro distanza dal ceppo europeo di riferimento rappresentato dal virus di Lelystad. Per ciascun ceppo sono stati
inoculati 5 soggetti e 3 sono stati tenuti a contatto durante un periodo di osservazione di 40 giorni. Gli animali dei 4 gruppi hanno manifestato un rialzo termico, più o meno protratto e il virus è stato dimostrato nel sangue per tempi variabili
fra i 3 e i 26 giorni post-infezione e a livello degli organi con particolare riferimento a polmoni e amigdale. Tre suini infettati con il ceppo 162/P/2000 e due infettati con il ceppo 114/P2000 sono stati soppressi prima del 40° giorno rispettivamente a causa di grave deperimento e di sintomatologia respiratoria. I ceppi utilizzati hanno presentato nel complesso
una virulenza non elevata e più bassa di quella documentata per i cosiddetti ceppi “atipici” nordamericani. Solo per un
ceppo le lesioni anatomopatologiche prodotte sono state indicative di una maggiore aggressività e sono state registrate
manifestazioni respiratorie rilevanti, anche se probabilmente aggravate da una concomitante infezione batterica nel gruppo sperimentale.
Le scrofe infettate con due diversi virus hanno entrambe mostrato viremia con nascita a termine di suinetti morti (rispettivamente 9 su 16 e 6 su 12). I risultati confermano che una difformità delle caratteristiche genetiche/antigeniche è
associata a differenze nella virulenza, la cui espressione in campo può essere ampiamente influenzata da altri fattori, come la linea genetica dei soggetti, le condizioni di allevamento, le patologie intercorrenti e naturalmente lo stato immunitario specifico.
Summary
Four viral strains isolated from clinical cases of PRRS were used for experimental trials to study the virulence on 30
days pigs and pregnant sows. The strains were selected on the basis of the low sequence homology in the ORF5 region
with the Lelystad European reference strain. For each strain 8 pigs were selected, of which 5 were inoculated with the virus
and 3, untreated, were left into contact. The animals were observed for 40 days post-infection. The four groups showed a
febrile response with viremia and the virus was reisolated from day 3 to 26 p.i. from blood and organs (i.e. lungs and tonsils). Three pigs infected with the strain 162/P/2000 and two infected with the strain 114/P2000 showed respectively severe recumbency and severe respiratory symptoms and were sacrificed before the day 40th. The four viral strains definitely
exhibited a moderate virulence, lower than that reported for the so called “atypical” North American PRRSV. Significant
pathological changes were seen only in the group of pigs infected with the strain 114/P2000, in which a concurrent bacterial infection was also observed.
The inoculated sows showed viremia and stillbirth (9/16 and 6/12 dead piglets respectively). These results confirm the
relationship between the genetic/antigenic differences and the virulence variability for the PRRSV strains and also suggest
that in field conditions the expression of symptoms could be widely influenced by the genetic of animals, environmental
factors, other concurrent diseases and specific immunity status.
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Infezioni sperimentali con ceppi di virus della PRRS in suini svezzati e scrofe gestanti
INTRODUZIONE
Il virus designato comunemente con la sigla PRRS (porcine reproductive respiratory syndrome) è stato isolato per
la prima volta in Olanda nel 1991 nel corso di episodi infettivi contraddistinti da turbe dell’apparato riproduttivo,
elevata nati-mortalità e forme respiratorie nella fase dello
svezzamento e dell’ingrasso13, 14.
Negli anni successivi tale infezione si è andata gradualmente propagando ed attualmente può essere ritenuta ubiquitaria
nella popolazione suina della maggior parte dei Paesi ed è
causa di ingenti danni economici. Essa inoltre, deprimendo le
difese naturali dell’organismo, predispone ed aggrava infezioni da parte di agenti batterici e virali comunemente presenti
nell’allevamento, con conseguente aggravamento delle manifestazioni cliniche di maggiore gravità. Appare evidente che
la persistenza negli allevamenti di questa infezione costituisce
una minaccia continua allo stato sanitario degli animali con
ripercussioni economiche molto significative.
I virus della PRRS (Fig. 1), appartenenti al genere Arterivirus, sono comunemente suddivisi in due diversi gruppi
antigenici, definiti “virus nord-americani” e “virus europei”. Tra i ceppi dei due differenti gruppi ma anche tra
quelli dello stesso gruppo, esiste un’ampia variabilità antigenica principalmente attribuibile a differenze a livello
della regione genomica ORF5 codificante per la glicoproteina E di superficie1, 3, 4. Tali differenze sembrano influire
sulle caratteristiche biologiche dei ceppi virali poiché accanto ad episodi di malattia conclamati si riscontrano frequentemente episodi sub-clinici11, 12.
Sulla base di questi presupposti lo scopo del presente
lavoro è stato di accertare mediante prove in vivo, l’eventuale correlazione tra la variabilità antigenica e la virulenza
presentata da ceppi di PRRS il cui genoma ha rilevato differenze genetiche di rilievo.
FIGURA 1 - PRRSV: Particella virale completa di core nucleocapsidico
circondato da envelope.
MATERIALI E METODI
Ceppi virali
I ceppi virali selezionati per la sperimentazione sono stati scelti sulla base dei risultati ottenuti in una precedente
fase operativa in cui sono stati analizzati campioni di polmoni, linfonodi, milza, organi fetali e sieri di animali con
manifestazioni cliniche conclamate o con forma sub-clinica. Gli animali provenivano da vari allevamenti situati nell’area compresa tra le province di Brescia, Bergamo, Cremona, Lodi, Parma e Reggio Emilia. Dei 425 campioni pervenuti, 300 sono stati analizzati e di questi 171 sono risultati positivi all’indagine relativa all’amplificazione con primers6 diretti verso la regione genomica ORF7. Tale regione
infatti, a causa della maggiore stabilità, viene utilizzata in
campioni diagnostici come bersaglio per la identificazione
di sequenze virali del virus della PRRS. Dei 171 campioni
positivi 54, rappresentativi dei differenti conferimenti, sono stati successivamente amplificati con primers6 diretti
verso la regione ipervariabile ORF5 e sottoposti all’analisi
di sequenziamento. Dall’analisi filogenetica dei diversi
campioni, svolta utilizzando il programma Clustalw Routine (http://www.ebi.ac.uk), 5 ceppi, identificati con la sigla
BS/P/55/2000, BS/P/114/2000, BS/162/P/2000, BS178/
FIGURA 2 - Analisi filogenetica dei 54 ceppi di PRRSV sottoposti a sequenziamento del frammento ORF5. In rosso i 4 ceppi utilizzati per le
infezioni sperimentali; in verde il ceppo di riferimento Europeo Lelystad.
P/2000 e BS/P/418/2003 hanno mostrato elevate differenze rispetto al ceppo di referenza europeo di Lelystad (sequenza depositata GeneBank M96262) (Fig. 2).
In una fase successiva, quattro di tali virus sono stati coltivati in cellule di macrofagi alveolari di suini SPF (MAS)
previamente controllate nella sensibilità al virus, al fine di
allestire stocks virali. Le cellule sono state infettate con gli
stessi campioni (sieri utilizzati tal quali o surnatante ottenuto dall’omogeneizzazione dei campioni di tessuto/organi)
risultati precedentemente positivi alla PCR per l’ORF7.
Animali
Sono stati impiegati suini LargeWhite-Landrace x Duroc
di 30 giorni di vita di allevamenti convenzionali, ma sierolo-
gicamente negativi e indenni da PRRS. Sono inoltre stati
utilizzati animali gestanti provenienti dal nucleo SPF dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, noti essere indenni da tale infezione.
Infezione sperimentale
I campioni di tessuto polmonare dei suini infettati con i
ceppi virali selezionati (114/P/2000, 55/P/2000 e 162/P/
2000), isolati nel corso di focolai respiratori in suini di allevamenti delle province di Brescia e Mantova, ed il ceppo
418/P/2003, isolato da un omogenato di polmone di un
suino proveniente da un’azienda con problemi riproduttivi,
sono stati utilizzati tal quali per le indagini sperimentali.
Rianimalizzazione
Ciascun ceppo virale è stato inizialmente inoculato per
via endonasale (e.n.) in ragione di 2 ml in un suino di 30
giorni quotidianamente sottoposto ad esame clinico ed a
prelievi ematici per accertarne la viremia. Ad infezione
conclamata gli animali sono stati sacrificati e gli organi
bersaglio (polmoni, amigdale, linfonodi tracheobronchiali)
ed il siero sono stati prelevati e sottoposti ad indagini di
laboratorio al fine di accertare la presenza di PRRSV. In
caso di positività si è scelto il polmone che, previa omogeneizzazione, è stato utilizzato come matrice virale per le
successive prove sperimentali.
Suini di 30 giorni di vita
Sono stati utilizzati quattro gruppi ciascuno costituito
da undici soggetti. Per ciascun gruppo, cinque suini sono
stati inoculati per via e.n. con 2 ml della matrice virale il
cui titolo è stato uniformato a 103,50 DCP50/ml, tre suini
non infettati sono stati mantenuti a contatto con i cinque
animali trattati e quale gruppo di controllo, altri tre soggetti sono stati sottoposti a trattamento placebo e alloggiati in stabulari totalmente separati ma allevati nelle medesime condizioni ambientali sperimentali.
Animali gestanti
Gli animali al 90° giorno di gestazione sono stati infettati sperimentalmente per via endonasale-orofaringea con
due dei campioni virali risultati più virulenti nelle prove
sperimentali eseguite sui giovani suini (BS/114/P/2000,
BS/162/P/2000). Dopo l’infezione sono stati eseguiti controlli sistematici al fine di poter rilevare eventuali manifestazioni cliniche, aborti od altri eventi irregolari ed ascrivibili all’infezione virale indotta.
Rilievi clinici ed indagini di laboratorio
I suini sono stati quotidianamente sottoposti ad osservazioni cliniche con rilievi termometrici. È stato inoltre monitorato il peso di ogni animale dall’inizio (T0) alla fine
(T21-33) del trial. Sono stati anche eseguiti prelievi ematici
ad intervalli pre-determinati (T0, 15 giorni dall’infezione e
al momento dell’abbattimento o morte). Sia il siero che i
leucociti sono stati controllati per la presenza virale trami-
13
te RT-PCR ed inoculazione su cellule MAS. Per ciascun
campione sono stati eseguiti due passaggi seriali, su ciascuno dei quali la presenza virale è stata accertata sempre mediante PCR. Il medesimo iter investigativo è stato applicato agli omogenati d’organo (amigdale, polmoni e linfonodi
tracheobronchiali) ottenuti dai suini sacrificati al termine
dell’esperimento che in media si è protratto per 40 giorni.
Per l’identificazione dell’acido nucleico di PRRSV, l’RNA
virale è stato estratto mediante Nucleospin®RNAII kit
(Macherey-Nagel) ed utilizzato nella successiva reazione di
RT-nested-PCR specifica per la regione ORF76.
Il titolo anticorpale sui campioni di siero è stato analizzato
tramite un kit commerciale ELISA (IDEXX) e, sulla base
delle indicazioni fornite dal produttore, sono stati considerati
positivi i campioni con un rapporto S/P > 0.4. I leucociti ottenuti mediante centrifugazione sono anche stati posti in incubazione con anticorpi anti CD4 (topo anti-CD4 suino,
Mab 74-12-4, VRDM) o con anticorpi anti CD8 (topo antiCD8 suino MCA 1223, SEROTEC), quindi nuovamente incubati con un anticorpo marcato anti-topo (DAKO) ed analizzati tramite citometria a flusso (Epics XL-MCL, Coulter).
Al termine delle prove o in caso di grave sintomatologia clinica, i soggetti sono stati sacrificati e sottoposti ad esame anatomopatologico durante il quale sono stati prelevati campioni
di polmoni e tessuti linfoidi, parte dei quali è stata utilizzata
per le indagini virologiche e batteriologiche (se ritenute necessarie) e parte è stata fissata in formalina. I tessuti così trattati sono stati inclusi in paraffina (a 56°C-58°C) e successivamente dagli stessi sono state ricavate delle sezioni di 5 µm da
destinarsi all’esame istologico ed immunoistochimico. Gli
stessi tipi di indagine sono stati eseguiti su tutti i suini nati
dalle scrofe infettate sperimentalmente e sugli organi bersaglio delle scrofe prelevati al momento dell’eutanasia.
RISULTATI
Suini di 30 giorni
Comportamento clinico
Gli animali dei quattro gruppi hanno presentato un rialzo termico mediamente dal 4° fino al 5°-6° giorno post–infezione (range 40.0-41.5°C). Solamente in due soggetti,
inoculati rispettivamente con i ceppi BS/162/P/2000 e
BS/418/P/2003, l’ipertermia si è protratta per tutta la durata della prova sperimentale. In alcuni casi sono stati osservati sporadici episodi di diarrea, lieve dispnea e tosse.
Non sono state registrate variazioni significative di peso
corporeo, ad eccezione di 2 suini infettati con il ceppo
BS/162/P/2000 per i quali è stato rilevato un grave deperimento, e di un suino infettato con il ceppo BS/114/P/2000
che è andato incontro a decremento ponderale e tumefazione
degli arti posteriori in corrispondenza dell’articolazione tibiotarsica. Tre suini infettati con il ceppo BS/162/P/2000 sono
stai sacrificati in gravi condizioni prima della fine della prova
(a T26) mentre per 2 suini infettati con il ceppo BS/114/P/
2000 si è reso necessario l’abbattimento a causa della gravità
della forma respiratoria manifestatasi. Le indagini batteriologiche hanno rilevato in questo ultimo gruppo, una concomitante infezione da Pasteurella multocida suggerendo la possibilità che la particolare severità dell’infezione rilevata sia da
attribuirsi alla concomitante infezione batterica5.
SUINI
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Infezioni sperimentali con ceppi di virus della PRRS in suini svezzati e scrofe gestanti
è stato rilevato tra T3 e T31 nel siero e nei leucociti. Le prove condotte sugli organi hanno rivelato una elevata presenza virale a livello di polmoni, amigdale e linfonodi. Il ceppo virale BS/114/P/2000 è stato rilevato nel siero e nei
leucociti dei soggetti inoculati soprattutto tra T4 e T31.
Ampia positività è stata riscontrata negli organi, soprattutto a livello di amigdale. L’isolamento del virus, per altro rivelatosi una metodica meno sensibile della RT-PCR, è stato effettuato più frequentemente dai leucociti che non dal
siero, ad eccezione di quanto rilevato per il ceppo
BS/55/P/2000.
Nelle tabelle 1 e 2 sono riportati sinteticamente i risultati degli esami virologici eseguiti sugli organi degli animali
sacrificati e sul siero e sui leucociti prelevati nel corso della
sperimentazione.
Indagini virologiche
Il virus è stato rilevato in alcuni dei soggetti inoculati
con il ceppo BS/55/P/2000; in particolare per quanto riguarda le prove condotte sul siero e leucociti, più frequentemente dai campioni prelevati tra T7 e T11. Relativamente
agli organi esaminati invece, il virus è stato rilevato più frequentemente nei polmoni. La positività è risultata nettamente inferiore rispetto all’esame diretto dopo la inoculazione su cellule MAS. Nei soggetti inoculati con il ceppo
BS/418/P/2003 è stato possibile rilevare il virus nel siero
nel periodo compreso tra T3 e T12 e sino al 26° giorno nei
leucociti. Risultati ampiamente positivi sono stati per altro
ottenuti anche dall’analisi eseguita sui campioni di organo.
Nel gruppo inoculato con il ceppo BS/162/P/2000 il virus
Tabella 1
Positività per PRRSV in RT-PCR e dopo isolamento su macrofagi alveolari suini (MAS) sul totale dei campioni di organo esaminati per ciascun gruppo
(animali infettati e animali a contatto)
AMIGDALE
CEPPO VIRALE
METODICA
POLMONI
LINFONODI
Infettati
(+/Tot)
Contatto
(+/Tot)
Infettati
(+/Tot)
Contatto
(+/Tot)
Infettati
(+/Tot)
Contatto
(+/Tot)
RT-PCR diretta
2/5
1/3
2/5
0/3
1/5
0/3
Isolamento su MAS
1/5
0/3
1/5
1/3
1/5
0/3
RT-PCR diretta
5/5
2/3
1/5
2/3
3/5
1/3
Isolamento su MAS
4/5
3/3
5/5
1/3
4/5
3/3
RT-PCR diretta
5/5
3/3
5/5
2/3
5/5
2/3
Isolamento su MAS
4/5
1/3
1/5
2/3
3/5
1/3
RT-PCR diretta
4/5
0/3
4/5
1/3
4/5
1/3
Isolamento su MAS
4/5
1/3
5/5
1/3
5/5
1/3
BS 55
BS 418
BS 162
BS 114
Tabella 2
Positività in RT-PCR per PRRSV su siero e leucociti nei diversi momenti di prelievo (giorni post infezione) sul totale dei campioni esaminati
per ciascun gruppo (animali infettati e animali a contatto);*i soggetti mancanti sono stati sacrificati o non prelevati
Infettati (+/Tot)
Contatto (+/Tot)
Infettati (+/Tot)
Contatto (+/Tot)
Infettati (+/Tot)
Contatto (+/Tot)
Infettati (+/Tot)
Contatto (+/Tot)
T6
(31 gg PI)
Contatto (+/Tot)
BS
114
T5
(25-26 gg PI)
Infettati (+/Tot)
BS
162
T4
(18-21 gg PI)
Contatto (+/Tot)
BS
418
T3
(10-13 gg PI)
Siero
0/5
0/3
2/5
0/3
0/5
0/3
0/5
0/3
ND
ND
ND
ND
Leucociti
2/5
1/3
5/5
2/3
1/5
1/3
0/5
0/3
ND
ND
ND
ND
Siero
1/5
1/3
0/5
1/3
1/5
0/3
3/5
0/3
3/5
0/3
ND
ND
Leucociti
3/5
0/3
5/5
0/3
5/5
0/3
3/5
0/3
ND
ND
ND
ND
Siero
5/5
3/3
5/5
3/3
5/5
3/3
5/5
3/3*
2/3*
1/2*
1/2*
1/2*
Leucociti
5/5
3/3
5/5
3/3
5/5
3/3
4/4*
1/2*
2/2*
1/2*
2/2*
1/2*
Siero
4/5
0/3
5/5
0/3
5/5
0/3
2/5
0/3
3/3*
2/3
2/3*
2/3
Leucociti
3/5
0/3
5/5
0/3
5/5
0/3
2/5
0/3
2/3*
0/3
2/3*
2/3
CEPPO VIRALE
E MATRICE
BS
55
T2
(5-8 gg PI)
Infettati (+/Tot)
T1
(2-4 gg PI)
Indagini sierologiche
Sieroconversione è stata rilevata nella quasi totalità dei
suini sottoposti ad infezione oltre che in due dei soggetti
posti a contatto con il gruppo infettato dal ceppo
BS/55/P/2000 ed in uno di quelli a contatto del gruppo
infettato con il ceppo BS/418/P/2003. Per quanto concerne i gruppi dei suini infettati rispettivamente con i virus
BS/162/P/2000 e BS/114/P/200, nonostante il frequente
reisolamento virale e il deperimento dei soggetti, la presenza anticorpale è stata rilevata soltanto in alcuni dei suini infettati in entrambi i gruppi. Nei suini che costituivano
il gruppo di controllo non è stato possibile rilevare presenza di virus o di anticorpi specifici per il virus stesso.
Immunità cellulo-mediata
Risultati contrastanti sono stati rilevati per i diversi ceppi virali. Nei suini infettati con i ceppi BS/55/P/2000 e
BS/162/P/2000 si è registrato un incremento della popolazione linfocitaria CD8+ a partire dal 3° giorno post-infezione, con un picco massimo raggiunto tra il 7° ed il 10°
giorno post-infezione. Nei soggetti infettati con il ceppo
BS/418/P/2003 si evidenzia un più precoce decremento
della sopraccitata popolazione linfocitaria (Fig. 3). Nessuna variazione significativa è stata invece registrata in questi
gruppi relativamente ai linfociti CD4+. Inoltre, negli animali infettati con il ceppo BS/114/P/2000, è stata registra-
15
ta, tra il 4° ed il 6° giorno post infezione, una marcata diminuzione dei linfociti circolanti (popolazione totale), in
particolare dei CD4+ e dei CD8+. Verso il 14° giorno è
inoltre evidente la tendenza dei CD4+ a riassestarsi gradualmente verso i valori registrati a T0, mentre i
CD8+hanno mostrato un recupero più graduale (Fig. 4).
Osservazioni macroscopiche
ed indagini istopatologiche
All’esame anatomopatologico le lesioni macroscopiche
rilevate a livello degli organi bersaglio nel gruppo dei soggetti sottoposti ad infezione sperimentale si sono rivelate simili a quelle riscontrate nei suini che costituivano i gruppi
di controllo. Tuttavia, peculiari lesioni definibili quali foci
di polmonite interstiziale e di iperplasia linfocitaria a livello
degli organi linfatici principali, sono state individuate nei
gruppi di suini infettati con i ceppi BS/55/P/2000 e
Figura 5 - Polmone di suino: in un contesto di polmonite interstiziale si
rilevano due cellule giganti multinucleate (frecce nere) (Eosina-Ematossilina 10x).
FIGURA 3 - Andamento dell’immunità cellulo-mediata (% cellule positive) nei suini infettati con il ceppo BS/418/P/2003.
FIGURA 4 - Andamento dell’immunità cellulo-mediata (linfociti/mm3)
nei suini infettati con il ceppo BS/114/P/2000.
Figura 6 - Polmone di suino: nel parenchima polmonare, presentante
quadri di polmonite interstiziale, si rileva la numerosa presenza di elementi macrofagici immunopositivi per PRRSV (frecce rosse) (antiPRRSV 20x).
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Infezioni sperimentali con ceppi di virus della PRRS in suini svezzati e scrofe gestanti
BS/162/P/2000. Nei suini infettati con il ceppo
BS/114/P/2000, su pregressi fenomeni di polmonite interstiziale (Figg. 5 e 6) si è instaurato un processo purulento
probabilmente sostenuto, come riferito, da Pasteurella
multocida.
L’esame necroscopico dei due suini infettati con lo
stesso ceppo e sacrificati prima del termine della prova
ha evidenziato un’imponente polisierosite fibrinosa,
linfoadenomegalia generalizzata e processi di epatizzazione polmonare. Inoltre nei soggetti infettati con il ceppo
BS/418/P/2003 sono state riscontrate lesioni caratteristiche della polmonite interstiziale espresse in forma più severa rispetto a quanto riscontrato nel caso dei ceppi
BS/55/P/2000 e BS/162/P/2000, così come più marcata
era la linfopenia a livello di organi linfatici.
Animali gestanti
Nella scrofa infettata con il virus BS/114/P/2000 si è riscontrata una transitoria fase viremica nei primi 2 giorni
dall’infezione con valori medi di temperatura di 40,1°C. Il
parto è avvenuto regolarmente secondo il termine previsto
con 9 soggetti morti e 7 vivi di cui successivamente, 2 sono
venuti a morte per schiacciamento e altri 3 sono deceduti
rispettivamente a 9, 14 e 15 giorni di vita. Il virus è stato
reisolato al momento del parto dai leucociti e dal colostro,
ma non dal siero della scrofa che è però risultato positivo a
9 giorni dall’infezione. L’isolamento è stato inoltre realizzato dagli organi bersaglio della scrofa (leucociti, polmone, amigdale e tessuto linfatico).
Per quanto riguarda i suinetti, il virus è stato isolato in 5
campioni di siero di sangue dei suini vivi prelevati alla nascita prima dell’assunzione del colostro, da 11 campioni di
polmone, da 8 campioni di fluido toracico dei soggetti nati
morti e da 9 cordoni ombelicali.
Viceversa, l’infezione attuata con il secondo virus
BS/162/P/2000, è risultata di minore intensità in quanto
non si è apparentemente rilevata alcuna viremia e successivamente all’eutanasia della scrofa, il virus è stato reisolato
soltanto dai linfonodi. Dei 12 suini partoriti regolarmente
a termine, 6 erano morti e 6 vivi. Il reisolamento virale è
stato effettuato dal siero dei 6 suini vivi (prelevato prima
dell’assunzione del colostro), dai cordoni ombelicali di 9
soggetti e rispettivamente da 6 polmoni e 5 campioni di
fluido toracico dei suini nati morti.
Entrambe le scrofe hanno presentato siero conversione con
S/P ratio di 1,79 (BS/114/P/2000) e 3,5 (BS/162/P/2000).
DISCUSSIONE
I risultati della ricerca svolta evidenziano come i ceppi
isolati in campo durante focolai respiratori e riproduttivi
da PRRS non siano stati in grado di riprodurre, in condizioni sperimentali, manifestazioni cliniche rilevanti o di
entità paragonabile a quella degli episodi clinici originari
confermando i dati di letteratura10. Infatti anche in altri
Paesi è stato segnalato come gli unici virus in grado di riprodurre forme respiratorie nei suini siano quelli isolati di
recente negli Stati Uniti nel corso di problematiche riproduttive di particolare gravità e associati a mortalità nelle
scrofe medesime e definiti come ceppi “atipici”. Nella sperimentazione condotta, l’unica eccezione è stata rappresentata dai suini infettati con il virus BS/114/P/2000 e
BS/162/P/2000. In particolare, nei soggetti infettati con il
ceppo virale BS/114/P/2000 si è riprodotta una sintomatologia clinica grave a carico dell’apparato respiratorio,
che ha comportato la necessità d’abbattimento di alcuni
degli animali coinvolti anche se deve essere sottolineato
che, nel caso delle prove svolte si è evidenziata una concomitante infezione batterica da Pasteurella multocida ponendo quindi in dubbio la reale virulenza del ceppo virale.
Nei soggetti infettati con gli altri ceppi, l’unico concreto
segno clinico manifestatosi è stato invece il rialzo termico.
Il virus è stato frequentemente reisolato dalla maggior parte degli animali che hanno invece presentato sieroconversione generalizzata. Gli esami anatomopatologici hanno
inoltre confermato come il ceppo BS/418P/2003 fosse
particolarmente più aggressivo del BS/55/P/2000 e del
BS/162/P/2000, sebbene basandosi esclusivamente sui riscontri ottenuti dagli esami immunologici, non siano state
evidenziate differenze significative relativamente alla reazione dell’immunità cellulo-mediata nei tre gruppi di suini
infettati con i suddetti virus.
Questi risultati così difformi sostanzialmente confermano quanto già riscontrato da altri autori7, 8 ovvero che nel
corso di infezioni sperimentali è possibile riscontrare marcate differenze nelle manifestazioni cliniche che possono
risultare particolarmente rilevanti soltanto se associate ad
infezioni batteriche, come riscontrato nel gruppo infettato
con il ceppo BS/114/P/2000. Conseguentemente, sebbene
una correlazione fra caratteristiche genetiche/antigeniche
e virulenza non possa essere non considerata, tuttavia altri
fattori svolgono un ruolo di particolare importanza nella
gravità degli episodi riscontrati nelle condizioni di campo.
Fra essi debbono essere annoverati la linea genetica dei
soggetti coinvolti, le condizioni manageriali, le condizioni
sanitarie e lo stato immunitario degli animali.
CONCLUSIONI
Sulla base dei dati acquisiti dalla recente letteratura e da
quanto emerso dalle prove sperimentali, appare evidente
come la correlazione tra il virus della PRRS e l’organismo
ospite sia del tutto peculiare. Proprio il meccanismo patogenetico, a tutt’oggi non completamente chiarito ed ancora in fase di studio, è la chiave del complesso meccanismo
di evoluzione virale. Appare altresì chiaro che il ruolo rivestito dalla ORF5 in questo processo è di cruciale importanza. È stato evidenziato come il virus sia strutturato per
evolversi ed adattarsi rapidamente ad un ambiente in continuo mutamento e che il dominio ipervariabile GP5 (glicoproteina E) incorra in fenomeni di ricombinazione e
mutazione ad un ritmo sorprendentemente veloce. Il successo evolutivo di questo virus pare dipendere da variazioni sostanziali relative ai domini immunogenici fondamentali, affiancate dalla conservazione di residui che eventualmente possono andare incontro a mutazioni di minima entità11. Queste variazioni genetiche, ed in particolare la ricombinazione, comportano una maggiore difficoltà nel
predire le future evoluzioni del virus della PRRS e di conseguenza la reale efficacia dei vaccini in campo. Al mo-
mento attuale sono stati evidenziati sia eventi ricombinanti
fra ceppi diversi16, sia la retromutazione di ceppi vaccinali
e riacquisizione della virulenza2. Nell’insieme, tali risultati
evidenziano come ideare un’efficace strategia vaccinale sia
particolarmente complicato e difficile nel caso della PRRS.
È stato evidenziato che in condizioni naturali i suini infettati dal PRRSV non sviluppano in tempi rapidi una risposta immunitaria protettiva e possono trascorrere dei mesi
prima che venga raggiunta una completa eliminazione virale. È d’altra parte stato rilevato come il virus PRRS non
sia in grado di attivare quei meccanismi iniziali in grado di
stimolare una risposta umorale e cellulare efficace. La
scarsa immunogenicità può essere a sua volta responsabile
di una attivazione della replicazione virale che sembra proprio essere favorita dalla presenza di anticorpi a basso titolo15. Questa caratteristica non è solo propria dei ceppi di
campo, ma è anche dei ceppi virali “attenuati” impiegati
quali presidi immunizzanti. Pertanto solo una costante
analisi epidemiologica volta a monitorare la variabilità dei
ceppi di campo, in associazione al perfezionamento delle
conoscenze relative alle proprietà e funzioni delle proteine
virali e al loro ruolo nella stimolazione dei meccanismi immunologici, consentiranno di poter adottare quelle strategie in grado di indurre una reale prevenzione/protezione
di questa infezione che, al momento attuale, sebbene non
inclusa nell’elenco delle malattie a particolare gravità dell’OIE, è universalmente riconosciuta come la causa principale di problematiche sanitarie e di concomitanti gravi
danni economici negli allevamenti suini. A tutt’oggi, in assenza di efficaci mezzi di prevenzione, viene altamente
raccomandato il ricorso a rigidi protocolli di biosicurezza,
relativi non solo alle norme igieniche ed al flusso degli animali nell’allevamento, ma anche alla gestione del materiale
seminale9. Ciò nonostante, nessuna delle numerose strategie di controllo e prevenzione attualmente disponibili, da
sola o in combinazione, rappresenta la risposta definitiva
alla problematica PRRS. Sulla base di quanto rilevato e
noto in campo internazionale, è possibile parlare di eliminazione della PRRS da un allevamento ma è ancora utopistico parlare di eradicazione, almeno fino a quando non
verrà individuata la giusta strategia per interrompere la
trasmissione indiretta del virus, evento che necessita ancora d’essere chiarito e compreso. A questo proposito non va
dimenticato che la crescente concentrazione geografica degli allevamenti suinicoli potrebbe di per sé rappresentare
un grosso ostacolo ai fini dell’eradicazione.
Al momento pare dunque più realistico perseguire la via
d’una migliore comprensione dei meccanismi patogenetici
e del comportamento virale per poter focalizzare le risorse
tecnologiche sulla preparazione di presidi innovativi in
grado di arginare in modo concreto il dilagare di questa
“nuova” patologia che, indubbiamente si configura come
una delle più temibili per l’allevamento suino.
Ringraziamenti
La ricerca è stata effettuata nell’ambito di un Progetto
parzialmente finanziato dal Ministero della Salute.
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Parole chiave
PRRS, suino, virulenza, infezione sperimentale.
Key words
PRRS, pig, virulence, experimental infection.
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