Analizzatore genetico ABI PRISM ® 3100

Analizzatore genetico
ABI PRISM® 3100
Guida introduttiva all’analisi dei frammenti
© Copyright 2001, Applied Biosystems
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
FOR LIMITED LICENSE INFORMATION, PLEASE SEE THE ABI PRISM ® 3100 GENETIC ANALYZER USER’S MANUAL.
The ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer includes patented technology licensed from Hitachi, Ltd. as part of a strategic partnership between Applied
Biosystems and Hitachi, Ltd., as well as patented technology of Applied Biosystems.
ABI PRISM and its design, Applied Biosystems, BioLIMS, GeneScan, Genotyper, and MicroAmp are registered trademarks of Applera Corporation or its
subsidiaries in the U.S. and certain other countries.
ABI, BigDye, Factura, Hi-Di, POP, POP-4, and POP-6 are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the U.S. and certain other countries.
AmpliTaq is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc.
Microsoft, Windows, and Windows NT are registered trademarks of the Microsoft Corporation in the United States and other countries.
Oracle is a registered trademark of the Oracle Corporation.
pGEM is a registered trademark of Promega Corporation.
All other trademarks are the sole property of their respective owners.
Applied Biosystems vast distribution and service network, composed of highly trained support and applications personnel, reaches into 150 countries on
six continents. For international office locations, please call our local office or refer to our web site at www.appliedbiosystems.com.
Applera Corporation is committed to providing the world’s leading technology and information for life scientists. Applera Corporation consists of the
Applied Biosystems and Celera Genomics businesses.
Indice
1 Introduzione
Dati generali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-1
Il presente manuale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2
Ulteriori informazioni. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2
Assistenza tecnica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-3
Sicurezza. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-8
2 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Dati generali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-1
Prima di cominciare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Preparazione dei campioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-3
Avvio del software 3100 Data Collection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-5
Impostazione delle preferenze del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7
Uso del gruppo piastra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-10
Controllo e aggiunta dei fluidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-12
Posizionamento della piastra sull’autocampionatore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-16
Creazione di un record della piastra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-17
Collegamento di una piastra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-23
Avvio e monitoraggio della corsa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-26
Arresto di una corsa e recupero dei dati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-27
Visualizzazione, modifica o creazione di un modulo di corsa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-28
Visualizzazione e modifica di un modulo di analisi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-30
3 Visualizzazione e analisi dei dati
Dati generali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-1
Visualizzazione nel software Data Collection dei dati grezzi di una corsa completata . . . . . . . 3-2
Visualizzazione dei dati analizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5
Analisi o rianalisi dei dati. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12
4 Calibrazioni spaziale e spettrale
Dati generali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-1
Esecuzione di una calibrazione spaziale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-2
Esecuzione di una calibrazione spettrale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6
i
5 Manutenzione dello strumento
Dati generali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-1
Elenco delle operazioni di manutenzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-2
Rimozione della bolle d’aria dalla camera superiore del polimero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4
Controllo dello spazio disponibile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-6
Pulizia e controllo delle siringhe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-8
Rimozione delle camere del polimero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
Pulizia delle camere del polimero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-11
Aggiunta di polimero fresco allo strumento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12
Prima di installare un set di capillari precedentemente utilizzato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-13
Installazione e rimozione del set di capillari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-14
Conservazione di un set di capillari. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-16
Arresto dello strumento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-17
A Preparazione della formammide
Deionizzazione e conservazione della formammide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-1
Indice analitico
ii
Introduzione
1
1
Dati generali
Questo capitolo Il presente capitolo tratta i seguenti argomenti.
Argomento
Vedere pagina
Il presente manuale
1-2
Ulteriori informazioni
1-2
Assistenza tecnica
1-3
Sicurezza
1-8
Introduzione 1-1
Il presente manuale
Scopo Lo scopo del presente manuale è quello di fornire all’operatore le istruzioni
fondamentali per:
♦
l’esecuzione di una corsa per l'analisi di frammenti
♦
l’analisi dei dati risultanti
♦
la calibrazione e le operazioni di manutenzione ordinaria dell’ABI PRISM®
analizzatore genetico
Ulteriori informazioni
Dove reperire La seguente tabella riporta i manuali e le guide correlati all’analizzatore genetico.
ulteriori
informazioni
Per ottenere...
Consultare…
informazioni sulla sicurezza o sulla preparazione
del laboratorio per l’installazione dell’analizzatore
genetico
Guida per la preparazione del sito di installazione e
per la sicurezza dell’analizzatore genetico
ABI PRISM 3100
4324535
informazioni particolareggiate sull’analizzatore
genetico
Manuale d’uso dell’analizzatore genetico
ABI PRISM 3100
4315834
informazioni particolareggiate sull’analisi e la
visualizzazione dei dati dei frammenti mediante il
software ABI PRISM® GeneScan® Analysis
Manuale d’uso del software GeneScan Analysis
v. 3.7 ABI PRISM
4308923
una procedura breve per l’esecuzione di una corsa
tipica di sequenziamento, la visualizzazione e
l’analisi dei dati del ciclo e l’esecuzione delle
operazioni di manutenzione ordinaria
Guida introduttiva al sequenziamento
dell’analizzatore genetico ABI PRISM 3100
4315833
1-2 Introduzione
P.N.
Assistenza tecnica
Come contattare il Il servizio di assistenza tecnica della Applied Biosystems è disponibile via telefono,
servizio di assistenza fax, posta elettronica o tramite Internet. È possibile ordinare 24 ore al giorno i
tecnica documenti per gli operatori Applied Biosystems, le schede di sicurezza dei materiali
(MSDS), i certificati di analisi e altri documenti correlati. Inoltre, è possibile scaricare
documenti in formato PDF dal sito Web della Applied Biosystems (a questo proposito,
consultare la sezione “Documenti su richiesta” più avanti in questo capitolo).
Per contattare il Gli indirizzi di posta elettronica del servizio di assistenza tecnica sono forniti nella
servizio di assistenza seguente tabella in base alle diverse aree di prodotto.
tecnica tramite posta
Indirizzo di posta elettronica
elettronica Area di prodotto
Analisi genetica (sequenziamento del DNA)
[email protected]
Sistemi di determinazione della sequenza e
PCR
[email protected]
Sequenziamento delle proteine,
sintesi peptidica e del DNA
[email protected]
Biocromatografia, sistemi PerSeptive per la
sintesi del DNA, del PNA e peptidica,
®
spettrometri di massa CytoFluor , FMAT™,
Voyager™ e Mariner™
[email protected]
Applied Biosystems/MDS Sciex
[email protected]
Chemiluminescenza (Tropix)
[email protected]
Orari del servizio di Negli Stati Uniti e in Canada il servizio di assistenza tecnica è disponibile nei seguenti
assistenza tecnica orari.
telefonica
Per contattare il
servizio di assistenza
tecnica per telefono
o fax
Prodotto
Orari
Chemiluminescenza
dalle 8:30 alle 17:30, ora di New York
Centro assistenza Framingham
dalle 8:00 alle 18:00, ora di New York
Tutti gli altri prodotti
dalle 5:30 alle 17:00, ora della California
Nel Nord America
Per contattare il servizio di assistenza tecnica della Applied Biosystems, servirsi dei
numeri telefonici e di fax elencati qui sotto (per una chiamata di assistenza relativa ad
altre esigenze, o in caso di emergenza, comporre il numero 1-800-831-6844 e
premere 1).
Prodotto o
area di prodotto
Per telefonare
comporre il...
Per inviare un fax
comporre il...
Analizzatore di DNA ABI PRISM® 3700
1-800-831-6844,
1-650-638-5981
quindi premere 8
Sintesi del DNA
1-800-831-6844,
1-650-638-5981
quindi premere 21
Sequenziamento del DNA mediante
rilevamento della fluorescenza
1-800-831-6844,
1-650-638-5981
quindi premere 22
Introduzione 1-3
Prodotto o
area di prodotto
Per telefonare
comporre il...
Per inviare un fax
comporre il...
Analisi dei frammenti mediante
rilevamento della fluorescenza (incluse
®
le applicazioni GeneScan )
1-800-831-6844,
1-650-638-5981
Dispositivi integrati per il controllo
termico (strumenti ABI PRISM ® 877 e
Catalyst 800)
1-800-831-6844,
Analizzatore genetico ABI PRISM® 3100
1-800-831-6844,
quindi premere 23
1-650-638-5981
quindi premere 24
1-650-638-5981
quindi premere 26
BioInformatics (incluse le applicazioni
®
®
®
BioLIMS , BioMerge e SQL GT )
1-800-831-6844,
Sintesi peptidica (sistemi 433 e 43X)
1-800-831-6844,
1-505-982-7690
quindi premere 25
1-650-638-5981
quindi premere 31
Sequenziamento delle proteine (sistemi di
sequenziamento delle proteine Procise®)
1-800-831-6844,
PCR e rilevamento della sequenza
1-800-762-4001,
1-650-638-5981
quindi premere 32
1-240-453-4613
quindi premere 1 per
PCR, 2 per il 7700 o
5700, 6 per il 6700
o comporre il numero
1-800-831-6844, quindi
premere 5
Stazioni di lavoro per biospettrometria
MALDI-TOF Voyager™ e per spettrometria
di massa ESI-TOF Mariner™
1-800-899-5858,
Biocromatografia (stazioni di lavoro
BioCAD® e prodotti per cromatografia di
perfusione Poros®)
1-800-899-5858,
Sistemi per la sintesi dell’acido nucleico
Expedite™
1-800-899-5858,
Sintesi peptidica (sintetizzatori peptidici
Pioneer™ e 9050 Plus)
1-800-899-5858,
PNA su ordinazione e sintesi
1-800-899-5858,
1-508-383-7855
quindi premere 13
1-508-383-7855
quindi premere 14
1-508-383-7855
quindi premere 15
1-508-383-7855
quindi premere 15
1-508-383-7855
quindi premere 15
Sistema FMAT™ 8100 HTS e lettore di
piastre in fluorescenza CytoFluor® 4000
1-800-899-5858,
Chemiluminescenza (Tropix)
1-800-542-2369 (solo
1-508-383-7855
quindi premere 16
1-781-275-8581
per chi chiama dagli
USA), o
+1-781-271-0045
Applied Biosystems/MDS Sciex
1-800-952-4716
1-508-383-7899
Per telefonare
comporre il...
Per inviare un fax
comporre il...
In tutti gli altri Paesi
Regione
Africa e Medio Oriente
1-4 Introduzione
Africa (anglofona) e Asia Orientale
(Fairlands, Repubblica Sudafricana)
27 11 478 0411
27 11 478 0349
Repubblica Sudafricana (Johannesburg)
27 11 478 0411
27 11 478 0349
Regione
Paesi del Medio Oriente e Nordafrica
(Monza, Italia)
Per telefonare
comporre il...
Per inviare un fax
comporre il...
39 (0)39 8389 481
39 (0)39 8389 493
Estremo Oriente, Cina, Oceania
Australia (Scoresby, Victoria)
61 3 9730 8600
61 3 9730 8799
Cina (Pechino)
86 10 64106608
86 10 64106617
Hong Kong
852 2756 6928
852 2756 6968
Corea (Seoul)
82 2 593 6470/6471
82 2 593 6472
Malesia (Petaling Jaya)
60 3 758 8268
60 3 754 9043
Singapore
65 896 2168
65 896 2147
Taiwan (Taipei Hsien)
886 2 22358 2838
886 2 2358 2839
Tailandia (Bangkok)
66 2 719 6405
66 2 319 9788
Europa
Austria (Vienna)
43 (0)1 867 35 75 0
43 (0)1 867 35 75 11
Belgio
32 (0)2 712 5555
32 (0)2 712 5516
Repubblica Ceca e Slovacchia (Praga)
420 2 61 222 164
420 2 61 222 168
Danimarca (Naerum)
45 45 58 60 00
45 45 58 60 01
Finlandia (Espoo)
358 (0)9 251 24 250
358 (0)9 251 24 243
Francia (Parigi)
33 (0)1 69 59 85 85
33 (0)1 69 59 85 00
Germania (Weiterstadt)
49 (0) 6150 101 0
49 (0) 6150 101 101
Ungheria (Budapest)
36 (0)1 270 8398
36 (0)1 270 8288
Italia (Milano)
39 (0)39 83891
39 (0)39 838 9492
Norvegia (Oslo)
47 23 12 06 05
47 23 12 05 75
Polonia, Lituania, Lettonia ed Estonia
(Varsavia)
48 (22) 866 40 10
48 (22) 866 40 20
Portogallo (Lisbona)
351 (0)22 605 33 14
351 (0)22 605 33 15
Russia (Mosca)
7 095 935 8888
7 095 564 8787
Europa Sudorientale (Zagabria, Croazia)
385 1 34 91 927
385 1 34 91 840
Spagna (Tres Cantos)
34 (0)91 806 1210
34 (0)91 806 1206
Svezia (Stoccolma)
46 (0)8 619 4400
46 (0)8 619 4401
Svizzera (Rotkreuz)
41 (0)41 799 7777
41 (0)41 790 0676
Paesi Bassi (Nieuwerkerk a/d IJssel)
31 (0)180 331400
31 (0)180 331409
Regno Unito (Warrington, Cheshire)
44 (0)1925 825650
44 (0)1925 282502
Tutti gli altri Paesi non elencati
(Warrington, GB)
44 (0)1925 282481
44 (0)1925 282509
Giappone
Giappone (Hacchobori, Chuo-Ku, Tokyo)
81 3 5566 6230
81 3 5566 6507
America Latina
Del.A. Obregon, Messico
305-670-4350
305-670-4349
Introduzione 1-5
Per contattare il Per ottenere le risposte alle domande più frequenti e ulteriori informazioni sui nostri
servizio di assistenza prodotti, consigliamo vivamente di visitare il nostro sito Web. Tale sito consente inoltre
tecnica via Internet di ordinare documenti tecnici specifici o un indice dei documenti disponibili e di
richiederne l’invio tramite fax o posta elettronica. L’indirizzo del sito Web della Applied
Biosystems è:
http://www.appliedbiosystems.com/techsupp
Per inoltrare domande di carattere tecnico dal Nord America o dall’Europa, attenersi
alle seguenti istruzioni.
Step
Procedura
1
Accedere al sito Web di assistenza tecnica della Applied Biosystems.
2
Sotto l’intestazione Troubleshooting (Risoluzione dei problemi), fare clic su
Support Request Forms (Moduli per la richiesta di assistenza), quindi selezionare
la regione di assistenza pertinente per l’area di prodotto in questione.
3
Immettere le informazioni richieste e la propria domanda nel modulo visualizzato,
quindi fare clic sul pulsante blu con testo giallo Ask Us RIGHT NOW (Inoltra adesso).
4
Immettere le informazioni richieste nel modulo successivo (se non lo si è ancora
fatto), quindi fare clic su Ask Us RIGHT NOW.
Entro 24-48 ore, uno degli specialisti del servizio di assistenza tecnica invierà per
posta elettronica una risposta all’operatore.
Documenti su L’accesso gratuito e ininterrotto alla documentazione tecnica della Applied Biosystems
richiesta (incluse le MSDS) è disponibile via fax, posta elettronica o tramite il sito Web.
Per ordinare i
documenti...
Procedura
per numero
d’indice
a. Accedere al sito Web del servizio di assistenza tecnica della Applied
Biosystems all’indirizzo
http://www.appliedbiosystems.com/techsupp
b. Fare clic sul collegamento Index (Indice) relativo al tipo di
documento desiderato, quindi individuare il documento in questione
e annotarne il numero d’indice.
c. Utilizzare i numeri d’indice per richiedere i documenti in base alle
procedure descritte qui di seguito.
per telefono, per
la consegna via
fax
a. Dagli USA o dal Canada, comporre il numero 1-800-487-6809;
da tutti gli altri Paesi, comporre il numero +1-858-712-0317.
b. Per ordinare i documenti desiderati, attenersi alle istruzioni vocali
fornite.
Nota
1-6 Introduzione
Vi è un limite di cinque documenti per richiesta.
Per ordinare i
documenti...
tramite Internet,
per la consegna
via fax o posta
elettronica
Procedura
a. Accedere al sito Web del servizio di assistenza tecnica della Applied
Biosystems all’indirizzo
http://www.appliedbiosystems.com/techsupp
b. Sotto Resource Libraries (Librerie di consultazione), fare clic sul tipo
di documento desiderato.
c. Immettere o selezionare le informazioni desiderate nel modulo
visualizzato, quindi fare clic su Search (Cerca).
d. Nei risultati della ricerca visualizzati, selezionare la casella
corrispondente al metodo di consegna desiderato per ciascun
documento corrispondente ai criteri specificati, quindi fare clic su
Deliver Selected Documents Now (Consegna i documenti selezionati
adesso); in alternativa, fare clic sull’icona PDF corrispondente al
documento desiderato per scaricarlo immediatamente.
e. Completare il modulo di informazioni (se non lo si è ancora fatto),
quindi fare clic su Deliver Selected Documents Now per inoltrare il
proprio ordine.
Nota La consegna via fax prevede un limite di cinque documenti per
richiesta; la consegna per posta elettronica non è invece soggetta ad
alcun limite per quanto riguarda il numero di documenti ordinabili.
Introduzione 1-7
Sicurezza
Note cautelative per
l’operatore utilizzate
nella
documentazione
Le note cautelative utilizzate nella documentazione della Applied Biosystems
destinata agli operatori sono cinque. Ciascuna nota presuppone un particolare livello
di osservanza o l’esecuzione di una particolare operazione da parte dell’operatore,
secondo quanto descritto qui di seguito.
Nota
Richiama l’attenzione dell’operatore su informazioni utili.
IMPORTANTE Indica informazioni necessarie ai fini del corretto funzionamento dello
strumento.
! ATTENZIONE Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata,
potrebbe causare lesioni di minore o moderata entità. Può inoltre essere usata per mettere in
guardia l’operatore nei confronti di pratiche pericolose.
! AVVERTENZA Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata,
potrebbe causare lesioni gravi o decesso.
! PERICOLO Indica una situazione di pericolo incombente che, se non evitata, causerà
decesso o lesioni gravi. Questa nota cautelativa viene usata esclusivamente nelle situazioni di
estremo pericolo.
Avvertenze relative ! AVVERTENZA SOSTANZE CHIMICHE PERICOLOSE. Alcune delle sostanze chimiche
alle sostanze utilizzate con gli strumenti e i protocolli Applied Biosystems sono potenzialmente pericolose e
chimiche pericolose possono provocare lesioni, malattie o decesso.
1-8 Introduzione
♦
Leggere e comprendere a fondo le informazioni contenute nelle MSDS fornite
dalla ditta produttrice delle sostanze chimiche o dei materiali pericolosi, prima di
riporli in magazzino, manipolarli o utilizzarli.
♦
Ridurre al minimo il contatto e l’inalazione delle sostanze chimiche. Durante la
manipolazione delle sostanze chimiche, indossare gli opportuni corredi di
protezione personale (come occhiali di protezione, guanti e indumenti protettivi).
Per ulteriori indicazioni relative alla sicurezza, consultare le MSDS.
♦
Non lasciare aperti i contenitori delle sostanze chimiche e usare tali sostanze solo
in ambienti adeguatamente ventilati.
♦
Verificare regolarmente l'eventuale presenza di perdite o fuoriuscite. In caso di
perdite o fuoriuscite, attenersi alle procedure per la pulizia fornite dalla ditta
produttrice della sostanza chimica in questione nella MSDS ad essa
corrispondente.
♦
Rispettare tutte le leggi e le norme locali, regionali/provinciali e statali relative alla
conservazione, alla manipolazione e allo smaltimento delle sostanze chimiche.
\
Avvertenze relative ! AVVERTENZA SCORIE CHIMICHE PERICOLOSE. Le scorie generate dagli strumenti
alle scorie chimiche Applied Biosystems sono potenzialmente pericolose e possono provocare lesioni, malattie o
pericolose decesso.
Guida per la
preparazione del sito
di installazione e per
la sicurezza
♦
Prima di riporre in magazzino, manipolare o smaltire le scorie chimiche, leggere e
comprendere a fondo le informazioni contenute nelle MSDS fornite dalle ditte
produttrici delle sostanze chimiche presenti nel contenitore delle scorie.
♦
Manipolare le scorie chimiche all’interno di una cappa aspirante.
♦
Ridurre al minimo il contatto e l’inalazione delle scorie chimiche. Durante la
manipolazione delle scorie chimiche, indossare gli opportuni corredi di protezione
personale (come occhiali di protezione, guanti e indumenti protettivi).
♦
Dopo avere vuotato il contenitore delle scorie, chiuderlo ermeticamente con il
tappo fornito.
♦
Smaltire il contenuto della vaschetta e del flacone delle scorie chimiche in
osservanza delle prassi di sicurezza del laboratorio e delle norme locali,
regionali/provinciali e statali relative alla tutela dell’ambiente e della salute.
La guida per la preparazione del sito di installazione e per la sicurezza è un
documento separato che viene inviato a tutti gli acquirenti e gli utilizzatori degli
strumenti Applied Biosystems. Per informazioni sulla preparazione del sito di
installazione, sulla sicurezza dello strumento, sulla sicurezza delle sostanze chimiche
e sulle caratteristiche delle scorie, consultare la guida specifica per lo strumento in
dotazione.
Schede di sicurezza Alcune delle sostanze chimiche utilizzate con il presente strumento sono classificate
dei materiali come pericolose dalle rispettive ditte produttrici. In questo caso, le etichette dei
(MSDS) contenitori di tali sostanze recano in posizione ben visibile le apposite avvertenze.
Prima della consegna o all’atto della consegna delle sostanze chimiche pericolose, le
rispettive ditte produttrici forniranno una MSDS ai nuovi clienti e ne allegheranno una
copia aggiornata alla prima consegna di una sostanza chimica pericolosa la cui la
scheda abbia subito delle modifiche. Le MSDS forniscono all’operatore le informazioni
necessarie per garantire la sicurezza della conservazione, la manipolazione, il
trasporto e lo smaltimento delle sostanze chimiche.
Qualora, alla consegna di un lotto di sostanze chimiche pericolose si riceva una
scheda aggiornata, si consiglia di sostituirla a quella in archivio.
! AVVERTENZA SOSTANZE CHIMICHE PERICOLOSE. Prima di procedere all’uso di
reagenti o solventi, leggere con attenzione le rispettive MSDS.
Introduzione 1-9
Per ordinare le Utilizzare le seguenti informazioni per ordinare copie supplementari gratuite delle
schede MSDS MSDS relative alle sostanze chimiche prodotte o distribuite dalla Applied Biosystems.
Per ordinare le MSDS...
Fare così…
via Internet
a. visitare il sito Web
www.appliedbiosystems.com/techsupp
b. fare clic su MSDSs
Se si possiede...
Fare così…
il numero della MSDS o il
suo numero all’interno
dell’indice del servizio
Document on Demand
(Documenti su richiesta)
digitare uno di questi
numeri nel campo
apposito su questa pagina
il numero di catalogo del
prodotto
selezionare Click Here
(Fare clic qui), quindi
digitare il numero di
catalogo o le parole chiave
nel campo apposito della
pagina visualizzata
una parola/e chiave
c. è possibile aprire e scaricare una versione in formato PDF
(utilizzando Adobe® Acrobat® Reader™) del documento
desiderato; in alternativa, è possibile richiede che il
documento venga consegnato via fax o per posta elettronica.
via servizio telefonico
automatizzato
consultare il paragrafo “Documenti su richiesta” della sezione
“Come contattare il servizio di assistenza tecnica”.
per telefono negli Stati
Uniti
comporre il numero 1-800-327-3002, quindi premere 1.
per telefono in Canada
per telefono in qualsiasi
altro Paese
Per ordinare in
lingua...
Comporre il numero
1-800-668-6913 e...
inglese
premere 1, quindi 2, quindi
nuovamente 1
francese
premere 2, quindi 2, quindi 1
vedere la regione specifica nel paragrafo “Per contattare il
servizio di assistenza tecnica per telefono o fax” nella sezione
“Come contattare il servizio di assistenza tecnica”.
Per le sostanze chimiche non prodotte o distribuite dalla Applied Biosystems,
rivolgersi alle rispettive ditte produttrici.
1-10 Introduzione
Etichette relative Lo strumento è dotato di etichette contenenti informazioni di sicurezza. Ciascuna
alla sicurezza dello etichetta si articola in tre sezioni.
strumento ♦ Una sezione contenente una segnalazione verbale, che presuppone un
particolare livello di osservanza o l’esecuzione di una particolare operazione da
parte dell’operatore (ad esempio, ATTENZIONE o AVVERTENZA). Se l’etichetta
è relativa a più pericoli, la segnalazione verbale del livello di pericolo riportata
corrisponde al pericolo maggiore.
♦
Una sezione contenente un messaggio di spiegazione del pericolo e gli interventi
necessari da parte dell’operatore.
♦
Un simbolo di sicurezza che indica un potenziale pericolo per l’incolumità della
persona. Per ottenere la definizione di tutti i simboli di sicurezza nelle varie lingue
in cui vengono forniti, consultare la Guida per la preparazione del sito di
installazione e per la sicurezza dell’analizzatore genetico ABI PRISM 3100.
Informazioni sullo Poiché l’uso dello strumento genera scorie potenzialmente pericolose, è
smaltimento delle responsabilità dell’operatore eseguire le operazioni descritte qui di seguito.
scorie ♦ Caratterizzare (se necessario, anche tramite analisi) le scorie generate dalle
applicazioni, dai reagenti e dai substrati utilizzati nel laboratorio.
♦
Tutelare la salute e la sicurezza di tutto il personale di laboratorio.
♦
Verificare che le scorie generate dallo strumento vengano conservate, trasferite,
trasportate e smaltite in conformità a tutte le norme locali, regionali/provinciali e
statali vigenti.
Nota I materiali radioattivi o biologicamente pericolosi possono richiedere speciali tecniche di
manipolazione ed essere soggetti a limitazioni relative allo smaltimento.
Prima di utilizzare Verificare che tutto il personale che utilizza lo strumento abbia:
lo strumento ♦ ricevuto la necessaria formazione riguardante le prassi di sicurezza nell’ambito
dei laboratori
♦
ricevuto la necessaria formazione riguardante le prassi di sicurezza specifiche per
lo strumento
♦
letto e compreso tutte le MSDS pertinenti
! ATTENZIONE Evitare di utilizzare il presente strumento in un modo non espressamente
indicato dalla Applied Biosystems. Sebbene lo strumento sia stato progettato in modo da
proteggere l’operatore, l’uso improprio dello stesso rischia di comprometterne il grado di
protezione.
Introduzione 1-11
Uso del computer Il corretto utilizzo del computer evita i potenziali effetti da sforzo, come l’affaticamento,
nel rispetto il dolore e la tensione.
dell’ergonomia Per ridurre al minimo questi effetti sulla schiena, gli arti inferiori, gli occhi e le estremità
superiori (collo, spalle, braccia, polsi, mani e dita), disporre la propria stazione di
lavoro in modo da garantire una posizione di lavoro naturale e rilassata. A questo
scopo è necessario prendere anche in considerazione l’adeguatezza di fattori quali il
riscaldamento, il condizionamento dell’aria, la ventilazione e l’illuminazione
dell’ambiente. Attenersi alle indicazioni riportate qui di seguito.
! ATTENZIONE PERICOLO PER IL SISTEMA MUSCOLOSCHELETRICO DOVUTO A
MOVIMENTI RIPETITIVI. Questi pericoli sono causati dai seguenti potenziali fattori di rischio
che includono, in modo non esclusivo, il movimento ripetitivo, una posizione scorretta, sforzi
accentuati, il mantenimento di posizioni statiche non salutari, la pressione da contatto e altri
fattori ambientali correlati alla stazione di lavoro.
♦
♦
–
In questa posizione, la maggior parte del peso corporeo dell’individuo deve
essere sostenuto dai glutei, non dalle cosce.
–
I piedi devono poggiare piatti sul pavimento e il peso delle gambe deve
gravare sul pavimento, non sulle cosce.
–
Al fine di mantenere la corretta posizione concava della spina dorsale, è
necessario disporre di un adeguato supporto lombare.
Collocare la tastiera su una superficie dotata delle seguenti caratteristiche.
–
L’altezza della superficie deve essere tale da consentire di posizionare gli
avambracci orizzontalmente e le braccia verticalmente.
–
La superficie deve supportare gli avambracci e le mani per evitare
l’affaticamento muscolare delle braccia.
♦
Posizionare lo schermo ad un’altezza che consenta di mantenere una posizione
naturale del corpo e del capo. Tale altezza dipende dalla taglia corporea
dell’operatore.
♦
Regolare le caratteristiche di visualizzazione in modo da ottimizzare il comfort e
l’efficienza.
♦
1-12 Introduzione
Adottare una posizione da seduti che garantisca il massimo equilibrio tra comfort,
facilità di accesso alla tastiera e assenza di pressioni e sollecitazioni in grado di
indurre affaticamento.
–
Regolare le variabili dello schermo, come la luminosità, il contrasto e il colore
in base alle preferenze personali e all’illuminazione dell’ambiente.
–
Posizionare lo schermo in modo da ridurre al minimo i riflessi dovuti a sorgenti
luminose presenti nell’ambiente.
–
Posizionare lo schermo ad una distanza che prenda in considerazione
l’eventuale miopia, presbiopia, astigmatismo e gli effetti delle lenti correttive
indossate dall’operatore.
Nel considerare la distanza dell’operatore dallo schermo, attenersi alle seguenti
indicazioni.
–
La distanza tra gli occhi dell’operatore e lo schermo deve essere circa uguale
alla distanza tra i suoi occhi e la tastiera.
–
Per la maggior parte delle persone, la distanza di lettura più comoda è di circa
50 cm.
–
Per consentire un’adeguata regolazione della distanza, la superficie della
stazione di lavoro deve avere una profondità minima di 91,5 cm.
–
Regolare l’inclinazione dello schermo in modo da ridurre al minimo i riflessi e
il riverbero ed evitare di utilizzare una stazione di lavoro dotata di superfici
altamente riflettenti.
♦
Usare un leggio di forma adatta, regolabile sia orizzontalmente che verticalmente,
che consenta il posizionamento del materiale cartaceo di consultazione alla
medesima distanza dagli occhi dello schermo e della tastiera.
♦
Disporre i cavi e i fili in modo che non intralcino gli operatori e il resto del
personale.
♦
Selezionare una stazione di lavoro dotata di una superficie sufficientemente
ampia da consentire l’esecuzione di altre operazioni e che fornisca inoltre uno
spazio adeguato per garantire la libertà di movimento delle gambe dell’operatore
seduto.
Avvertenze relative ! AVVERTENZA PERICOLO DI FOLGORAZIONE. Lavorando su uno strumento
al pericolo di alimentato da una fonte di alimentazione ad alta tensione è possibile subire forti scosse
folgorazione elettriche, che possono causare lesioni o decesso. Per evitare il pericolo di folgorazione, prima
di intervenire sullo strumento, scollegarlo dalla rete di alimentazione, disinserire il cavo di
alimentazione e attendere almeno 1 minuto.
! AVVERTENZA PERICOLO DI FOLGORAZIONE. Per ridurre il rischio di folgorazione,
non rimuovere i pannelli di copertura che richiedono l’impiego di particolari utensili per la
rimozione. Lo strumento non contiene alcun componente riparabile o sostituibile dall’operatore.
Affidare tali interventi al personale qualificato della Applied Biosystems.
Avvertenza relativa ! AVVERTENZA PERICOLO DI USTIONI DOVUTE AL LASER. Un laser surriscaldato, se
al laser viene a contatto con la pelle, può provocare gravi ustioni. NON usare il laser se non è possibile
raffreddarlo mediante la sua ventola di raffreddamento. Indossare sempre occhiali di protezione
laser.
Introduzione 1-13
Esecuzione di una corsa
per l’analisi di frammenti2
2
Dati generali
Questo capitolo Il presente capitolo tratta i seguenti argomenti.
Vedere
pagina
Argomento
Prima di cominciare
2-2
Preparazione dei campioni
2-3
Avvio del software 3100 Data Collection
2-5
Impostazione delle preferenze del software
2-7
Uso del gruppo piastra
2-10
Controllo e aggiunta dei fluidi
2-12
Posizionamento della piastra sull’autocampionatore
2-16
Creazione di un record della piastra
2-17
Collegamento di una piastra
2-23
Avvio e monitoraggio della corsa
2-26
Arresto di una corsa e recupero dei dati
2-27
Visualizzazione, modifica o creazione di un modulo di corsa
2-28
Visualizzazione e modifica di un modulo di analisi
2-30
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-1
Prima di cominciare
Premessa Le procedure descritte nel presente capitolo presuppongono che:
♦
il computer e lo strumento siano stati correttamente configurati;
♦
lo strumento sia stato sottoposto alle calibrazioni spaziale e spettrale con esito
positivo. Se necessario, consultare il Capitolo 4 del presente manuale;
♦
lo spazio disponibile sul disco fisso del computer sia sufficiente per la
memorizzazione dei dati che verranno generati. Se necessario, consultare il
Capitolo 5 del presente manuale.
2-2 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Preparazione dei campioni
Set di fluorocromi Il software ABI PRISM® 3100 Data Collection versione 1.0.1 supporta i set di
fluorocromi Dye Set DS-30 e ABI PRISM® Linkage Mapping Set-LD20, -MD10 e -HD5.
I fluorocromi nel set Dye Set DS-30 sono 6-FAM (blu), HEX (verde), NED (giallo) e
ROX (rosso).
Rapporto tra Il grado dell’efficienza di rilevamento dei fluorocromi varia da molecola a molecola. Il
fluorocromi rapporto tra fluorocromi (la quantità aggiunta di ciascun prodotto marcato rispetto alla
quantità degli altri prodotti presenti) va regolato per garantire l’opportuno rilevamento
di tutti i loci.
Rapporto tra fluorocromi per i set di fluorocromi ABI PRISM Linkage Mapping Set
Per i set di fluorocromi Linkage Mapping Set-LD20, -MD10 e -HD5, un rapporto di
1:1:1 (dei prodotti marcati con 6-FAM:HEX:NED) genera un equilibrio accettabile per
la maggior parte dei loci. Per ciascun pannello Linkage Mapping Set, dosare 1 µl di
ciascun prodotto PCR in una provetta per microcentrifuga. Se necessario, portare il
volume totale a 10–20 µl con acqua deionizzata.
Dispensare un’aliquota di 10 µl di prodotto PCR diluito in una piastra ottica MicroAmp
da 96 o 384 pozzetti.
Volumi di ! AVVERTENZA SOSTANZE CHIMICHE PERICOLOSE. La formammide è nociva se
caricamento assorbita attraverso la cute e può irritare gli occhi, la pelle e le vie respiratorie. Può danneggiare
consigliati il sistema nervoso centrale, i sistemi riproduttivi maschile e femminile e costituisce un rischio
potenziale per difetti congeniti. Leggere le MSDS e attenersi rigorosamente alle istruzioni
relative alla manipolazione di questa sostanza. Indossare adeguata protezione oculare,
indumenti e guanti di protezione.
Per una piastra da 96 pozzetti, preparare la miscela formammide:size standard
usando:
♦
1000 µl di formammide Hi-Di® (P.N. 4311320) o una formammide di qualità
analoga
♦
50 µl di GeneScan®-400HD ROX o 50 µl di GeneScan®-500 ROX
Nota Si consiglia di usare formammide Hi-Di; se si preferisce usare una formammide di
preparazione propria, consultare l’Appendice A, “Preparazione della formammide,” per
importanti informazioni in merito.
Nota Utilizzare questi rapporti di prodotti PCR combinati e size standard solo come punto di
partenza. Ottimizzare questi rapporti secondo le necessità, in base ai risultati sperimentali.
Per il caricamento, miscelare 1µl di prodotti PCR combinati con 10 µl di miscela
formammide:size standard.
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-3
Denaturazione dei Per denaturare i campioni, procedere come segue.
campioni
Passa
1
Procedura
Riscaldare i campioni a 95 °C per 3–5 minuti.
Per coprire i campioni durante la denaturazione, è possibile utilizzare uno dei
seguenti prodotti.
♦ Pellicole adesive trasparenti MicroAmp® (P.N. 4306311)
♦ Cappucci MicroAmp® (striscia da 12, P.N. 801-0534)
♦ Cappucci MicroAmp® (striscia da 8, P.N. 801-0535)
♦ Strisce di setti copripiastra
2
Collocare immediatamente i campioni su ghiaccio per almeno 5 minuti prima di
caricarli.
2-4 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Avvio del software 3100 Data Collection
Prima di cominciare Prima di avviare il software Data Collection, eseguire le seguenti operazioni.
Passa
1
Procedura
Accertarsi che il computer e il monitor siano accesi.
IMPORTANTE Il computer deve essere sempre acceso prima dello strumento.
Il nome utente predefinito è “3100User” e la password non è impostata.
2
Verificare che l’analizzatore genetico ABI PRISM® 3100 sia acceso e che l’indicatore
luminoso di stato verde sia acceso (non lampeggiante).
3
Verificare che OrbixWeb Daemon sia attivo individuando il pulsante corrispondente
sulla barra delle applicazioni di Windows NT.
Se OrbixWeb Daemon non è in attivo, accedere al menu Start, fare clic su Applied
Biosystems, quindi selezionare OrbixWeb Daemon.
Nota Per creare un collegamento a tale programma: (a) individuare il file
orbixd.exe nella directory D:\dbtools\iona\orbixweb3.2\bin; (b) fare clic con il
pulsante destro del mouse su tale file; (c) fare clic su Create Shortcut (Crea
collegamento). Ciò crea un collegamento denominato Shortcut to orbixd.exe;
(d) trascinare tale collegamento sul desktop.
IMPORTANTE OrbixWeb Daemon deve essere avviato per rendere possibile
l’esecuzione del software 3100 Data Collection.
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-5
Avvio del software Per avviare il software Data Collection, procedere come segue.
Data Collection
Passa
1
Procedura
Nel menu Start, selezionare Applied Biosystems, quindi 3100 Data Collection.
Nota Per creare un collegamento a tale programma: (a) individuare il file
3100Collection.bat nella directory D:\AppliedBio\3100\Bin; (b) fare clic con il
pulsante destro del mouse su tale file; (c) fare clic su Create Shortcut. Ciò crea un
collegamento denominato Shortcut to 3100 Collection Software; (d) trascinare tale
collegamento sul desktop.
Si lancia il software 3100 Data Collection e viene visualizzata la seguente finestra.
2-6 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Impostazione delle preferenze del software
Introduzione Le preferenze del software Data Collection vengono impostate durante l’installazione
dello strumento; in seguito è tuttavia possibile visualizzarle o modificarle dalla finestra
di dialogo Setting Preferences (Impostazione preferenze).
Visualizzazione della Per visualizzare la finestra di dialogo Setting Preferences, procedere come segue.
finestra di dialogo
Setting Preferences Passa Procedura
1
Nel menu View, selezionare Preferences o fare clic su Preferences.
La finestra di dialogo è composta da due schede, come descritto qui di seguito.
Finestra Data
Collection
Preferenza
Descrizione
Instrument Name
In questo campo viene automaticamente inserito il nome demo_3100.
È possibile inserirvi un nome qualsiasi (ad esempio, il numero di serie
dello strumento).
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-7
Finestra Data
Analysis
Preferenza
Descrizione
AutoAnalysis On
Selezionare questa casella per far analizzare automaticamente i
campioni dal software di analisi alla conclusione della corsa.
Nota La selezione di questa opzione non impedisce di ripetere
l’analisi dei dati dei campioni.
BioLIMS
2-8 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Utilizzare queste impostazioni per esportare i dati in un database
BioLIMS invece che nei file dei campioni.
Preferenza
Descrizione
Sample File Name
Prefix Format
Specificare il formato da utilizzare per i nomi dei file dei campioni
usando i menu.
Identificatore
Origine
Run ID
Generato dal software Data
Collection
Sample Name
Tratto dai dati immessi nel
foglio elettronico del Plate
Editor
Well Position
Ottenuta dalla posizione del
campione sulla piastra (le
lettere designano le colonne, i
numeri designano le righe: ad
esempio, C3)
Plate Name
Tratto dai dati immessi nella
finestra di dialogo del Plate
Editor
Instrument ID
Tratto dai dati immessi nella
finestra Data Collection delle
preferenze
Array ID
Tratto dai dati immessi nel
programma guidato Install
Capillary Array (Installa set di
capillari)
Nota Oltre ai quattro identificatori impostati nei menu a discesa, a
tutti i nomi vengono automaticamente accodati il numero del capillare
e un’estensione di file. Quindi, nell’esempio della finestra Data
Analysis mostrato qui sopra, il nome del campione diventa:
Sample Name_Well Position_Capillary number.ab1
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-9
Uso del gruppo piastra
Componenti del I componenti del gruppo piastra sono i seguenti.
gruppo piastra
Fermapiastra
Setti
copripiastra
1
2
3
Piastra per
campioni
Base della
piastra
Preparazione del Per preparare un gruppo piastra, procedere come segue.
gruppo piastra
Passa
1
Procedura
Fissare i setti copripiastra puliti e asciutti sulla piastra dei campioni.
IMPORTANTE Non utilizzare mai piastre deformate.
IMPORTANTE Accertarsi che i setti copripiastra siano ben piatti sulla piastra.
2
Collocare la piastra per campioni sulla base della piastra.
3
Fare scattare il fermapiastra sulla piastra per campioni e sulla base della piastra.
2-10 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Per preparare un gruppo piastra, procedere come segue.
Passa
4
(Continua)
Procedura
Verificare che i fori del fermapiastra siano allineati ai setti copripiastra.
IMPORTANTE L’inadeguato allineamento dei fori del fermapiastra e dei setti
copripiastra danneggia le estremità dei capillari.
I fori del fermapiastra
devono essere allineati a
quelli dei setti copripiastra.
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-11
Controllo e aggiunta dei fluidi
Aggiunta o Prima di procedere alla preparazione dello strumento, determinare se aggiungere o
sostituzione sostituire il polimero.
del polimero
Se il polimero sullo strumento...
Allora…
ha meno di una settimana ed
Verificare che non vi siano bolle d’aria, quindi
procedere con la preparazione dello strumento.
è in quantità sufficiente per
completare le corsea
ha più di una settimana, oppure
è in quantità insufficiente per
completare le corse
Nota Per la rimozione delle bolle d’aria, vedere
pagina 5-4.
Riempire di polimero le siringhe e la camera superiore
del polimero in base alle istruzioni fornite dal
programma guidato Change Polymer (Cambia
polimero). Per le istruzioni, vedere pagina 5-12.
! ATTENZIONE SOSTANZE CHIMICHE
PERICOLOSE. Il polimero POP può irritare gli occhi,
la cute e le vie respiratorie. Leggere le MSDS e
attenersi rigorosamente alle istruzioni relative alla
manipolazione di questa sostanza. Indossare
adeguata protezione oculare, indumenti e guanti di
protezione. Il presente prodotto va usato
esclusivamente a scopi di ricerca e sviluppo.
a. Sono necessari >0,5 ml di polimero. Una corsa utilizza 50–80 µl di polimero: ciò equivale a 60–100 corse
da una siringa da 5 ml.
IMPORTANTE Se ha più di una settimana, il polimero va sostituito.
IMPORTANTE Prima di procedere, verificare che non vi siano bolle d’aria nella camera
superiore del polimero. Per la rimozione delle bolle d’aria, vedere pagina 5-4.
Quando sostituire Il tampone di corsa 1X nei serbatoi per anodo e catodo va sostituito giornalmente o
il tampone prima di ciascuna corsa.
IMPORTANTE La mancata sostituzione del tampone può dare luogo a un calo della risoluzione
e della qualità dei dati.
IMPORTANTE Per le operazioni di aggiunta del tampone e di posizionamento della piastra,
l’autocampionatore deve essere in posizione estesa, con le estremità dei capillari fuori dalla
soluzione tampone. Per evitare l’essiccamento dei capillari, non lasciare l’autocampionatore in
questa posizione per più di 30 minuti.
2-12 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Preparazione del Per preparare 30 ml di tampone di corsa 1X, procedere come segue.
tampone per una
singola corsa Passa Procedura
1
Dosare 3,0 ml di tampone di corsa 10X in un cilindro graduato.
2
Aggiungere una quantità sufficiente di acqua deionizzata per portare il volume
complessivo a 30 ml.
3
Miscelare bene.
Riempimento dei Per riempire i serbatoi dell’acqua e del tampone catodico, procedere come segue.
serbatoi dell’acqua e
del tampone catodico
Passa
Procedura
1
Chiudere gli sportelli dello strumento.
2
Premere il pulsante Tray (Vassoio) dello strumento per portare l’autocampionatore
in posizione estesa.
Pulsante
Tray
3
Attendere l’arresto dell’autocampionatore, quindi aprire gli sportelli dello strumento.
4
Estrarre dallo strumento il serbatoio del tampone catodico e i serbatoi dell’acqua.
5
Eliminare i fluidi residui e sciacquare i serbatoi con acqua deionizzata.
Nota I fluidi di scarto sono alquanto diluiti; tuttavia, è necessario attenersi a
quanto previsto dall’azienda di appartenenza in merito alle procedure di
smaltimento.
6
Sciacquare il serbatoio del tampone catodico con tampone di corsa 1X, quindi
riempirlo con lo stesso tampone fino alla linea di riempimento (circa 17 ml).
7
Riempire i serbatoi dell’acqua fino alla linea di riempimento con acqua deionizzata
di qualità (circa 17 ml).
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-13
Per riempire i serbatoi dell’acqua e del tampone catodico, procedere come
segue. (Continua)
Passa
8
Procedura
Collocare una striscia di setti copripiastra pulita su ciascun serbatoio e asciugare la
superficie esterna.
Nota Per evitare di confonderli tra loro, si consiglia di etichettare opportunamente
i serbatoi.
! ATTENZIONE Per evitare di danneggiare le estremità dei capillari, accertarsi
che le strisce di setti copripiastra siano fissate saldamente e siano aderenti alle
sommità dei serbatoi.
Striscia di setti copripiastra ben piatta
serbatoio
Linea di riempimento
9
Posizionare nuovamente i serbatoi sull’autocampionatore come mostrato qui di
seguito.
Serbatoio dell’acqua
(risciacquo)
2
1
Serbatoio del tampone
catodico
(tampone di corsa 1X)
4
Serbatoio dell’acqua
(scarto)
3
Serbatoio
dell’acqua
Riempimento del Sostituire il tampone anodico:
serbatoio del ♦ prima di ciascuna corsa, o almeno ogni 24 ore
tampone anodico
♦
ogni volta che si riempie la camera del polimero con nuovo polimero
Per riempire il serbatoio del tampone anodico fino alla linea di riempimento con
tampone di corsa 1X, procedere come segue.
Passa
Procedura
1
Estrarre il serbatoio del tampone anodico tirandolo con decisione verso il basso e
svitandolo lentamente.
2
Gettare il tampone usato in base alle prassi previste.
3
Pulire e sciacquare il serbatoio con acqua deionizzata, quindi sciacquarlo con il
tampone.
2-14 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Per riempire il serbatoio del tampone anodico fino alla linea di riempimento con
tampone di corsa 1X, procedere come segue. (Continua)
Passa
4
Procedura
Riempire il serbatoio fino alla linea di riempimento con tampone di corsa 1X fresco
(circa 8 ml).
Linea di
riempimento
5
Inserire il serbatoio.
Nota
6
Il menisco deve essere allineato alla linea di riempimento.
Se il serbatoio si riempie di polimero, ripetere questa procedura per eliminare e
sostituire il tampone di corsa.
Nota
È possibile che questo serbatoio si riempia durante lo spurgo delle bolle.
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-15
Posizionamento della piastra sull’autocampionatore
Posizionamento della Per posizionare la piastra sull’autocampionatore, procedere come segue.
piastra
sull’autocampionatore Passa Procedura
1
Posizionare il gruppo della piastra sull’autocampionatore come mostrato qui sotto.
Nota La piastra può essere orientata solo in una direzione: con la tacca
sull’estremità della base rivolta in direzione opposta rispetto all’operatore.
IMPORTANTE Verificare che il gruppo piastra sia posizionato in piano
sull’autocampionatore. In caso contrario le estremità dei capillari potrebbero
sollevare il gruppo piastra dall’autocampionatore.
2
Quando la piastra è correttamente posizionata, il colore dell’apposito indicatore
sulla pagina Plate View (Visualizzazione piastra) cambia dal grigio al giallo.
Verificare che ciò sia accaduto.
Piastra collocata nella posizione A
Nessuna piastra
collocata nella
posizione B
3
Chiudere gli sportelli dello strumento.
Nota La chiusura degli sportelli riporta l’autocampionatore alla posizione in cui si
trovava immediatamente prima dell’apertura degli sportelli.
2-16 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Creazione di un record della piastra
Informazioni sui I record delle piastre sono tabelle di dati nel database dello strumento che
record delle piastre memorizzano le informazioni relative alle piastre e ai campioni in esse contenuti.
Nota Un record della piastra è simile a un sample sheet o a un injection list probabilmente
usato in precedenza con altri strumenti ABI PRISM.
Uso del Plate Editor
per la creazione di
un record della
piastra
Per creare un record della piastra mediante il Plate Editor, utilizzare una delle due
procedure delineate qui di seguito.
Per ottenere ulteriori informazioni sull’importazione e l’esportazione dei record delle
piastre e altri metodi per la loro creazione, consultare il Manuale d’uso dell’ABI PRISM
analizzatore genetico 3100 (P.N. 4315834).
Immissione delle Nota Durante una corsa, non è possibile creare alcun record della piastra.
informazioni del
Per immettere le informazioni del record della piastra, procedere come
record della piastra segue.
Passa
1
Procedura
Fare clic sulla scheda Plate View (Visualizzazione piastra) nella finestra del
3100 Data Collection Software per aprire la pagina Plate View.
Scheda Plate
View
2
Fare clic sul pulsante Plate Editor della barra degli strumenti.
Viene visualizzata la finestra di dialogo Plate Editor.
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-17
Per immettere le informazioni del record della piastra, procedere come
segue. (Continua)
Passa
3
Procedura
Nella finestra di dialogo Plate Editor:
♦ assegnare un nome alla piastra
♦ specificare l’applicazione
♦ selezionare il tipo di piastra
♦ digitare eventuali commenti (facoltativo)
IMPORTANTE Quando si assegna un nome alla piastra, è possibile utilizzare i
caratteri alfanumerici e i seguenti segni di punteggiatura: -_(){}#.+. Non utilizzare
spazi.
4
A operazione completata, fare clic su Finish (Finito).
Viene visualizzato il foglio elettronico del Plate Editor.
2-18 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Immissione delle Per immettere le informazioni relative al campione e salvare il record della piastra,
informazioni relative procedere come segue.
al campione
Passa
1
Procedura
Nel foglio elettronico del Plate Editor, digitare i nomi di tutti i campioni nella colonna
Sample Name (Nome campione).
Nota Il formato predefinito utilizzato per la denominazione dei campioni prevede
l’incorporamento del nome del campione digitato dall’operatore nel nome del file
del campione. Ad esempio:
campione_A01.fsa
Posizione del pozzetto
Nome del campione
\
Il formato utilizzato per la denominazione dei file dei campioni può essere
modificato nella finestra di dialogo Preferences (Preferenze). Per informazioni
particolareggiate, vedere pagina 2-8.
IMPORTANTE Per l’assegnazione di un nome al campione, è possibile utilizzare i
caratteri alfanumerici e i seguenti segni di punteggiatura: -_(){}#.+. Non utilizzare
spazi.
IMPORTANTE I nomi dei file dei campioni non devono superare i 59 caratteri. Il
sistema non prevede il controllo automatico degli errori nel caso di nomi dei
campioni composti da un numero maggiore di caratteri. Il software di analisi non è
in grado di aprire i file dei campioni con nomi eccessivamente lunghi.
2
Facoltativo
Per ciascun campione, immettere del testo nei campi Color Info (Informazioni colori)
e Color Comment (Commento colori).
3
Immettere un progetto BioLIMS.
IMPORTANTE Un progetto BioLIMS è richiesto per ciascun campione, anche se il
database BioLIMS non viene utilizzato.
a. Fare clic nella cella BioLIMS Project (Progetto BioLIMS) per il pozzetto A1.
b. Selezionare un nome di progetto nel menu a discesa.
IMPORTANTE È necessario immettere un
progetto BioLIMS.
Nota Per ottenere ulteriori informazioni sull’impostazione di un progetto BioLIMS,
consultare il Manuale d’uso dell’analizzatore genetico ABI PRISM 3100.
c. Per assegnare lo stesso nome di progetto a ciascun campione presente nel
record della piastra, procedere come segue.
– Fare clic sull’intestazione di colonna per selezionare l’intera colonna.
– Premere CTRL+D.
Nota Premere CTRL+D ogni volta che un campo è identico per tutti i campioni
presenti nel record della piastra.
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-19
Per immettere le informazioni relative al campione e salvare il record della piastra,
procedere come segue. (Continua)
Passa
4
Procedura
Per ciascun campione, selezionare il Dye Set (Set di fluorocromi) opportuno nel
menu a discesa. Per il software ABI PRISM® GeneScan Analysis®, selezionare il set
di fluorocromi D.
IMPORTANTE Accertarsi di selezionare il set di fluorocromi adatto per la corsa. Se
i dati vengono raccolti utilizzando un set di fluorocromi sbagliato, occorre ripetere la
corsa.
5
Per ciascun campione, selezionare il Run Module (Modulo di corsa) opportuno nel
menu a discesa.
La seguente tabella riporta il modulo di corsa da selezionare in base al tipo di
corsa.
Tipo di analisi
Modulo di corsa
GeneScan
GeneScan36_POP4DefaultModule
Nota Qualora fosse necessario visualizzare o modificare un file di modulo di
corsa, vedere pagina 2-28.
Nota Se si selezionano differenti moduli per i diversi campioni, i campioni
vengono automaticamente raggruppati in modo che tutti i campioni con il medesimo
modulo di corsa vengano analizzati contemporaneamente. Le corse vengono
programmate alfanumericamente in base al nome del modulo di corsa, non in base
all’ordine indicato sul record della piastra, né in base ai nomi dei campioni.
2-20 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Per immettere le informazioni relative al campione e salvare il record della piastra,
procedere come segue. (Continua)
Passa
6
Procedura
Per ciascun campione, selezionare l’opportuno Analysis Module (Modulo di analisi)
dal menu a discesa.
IMPORTANTE Per effettuare automaticamente l’analisi dopo la corsa, la preferenza
AutoAnalysis (Autoanalisi) deve essere selezionata (vedere pagina 2-8).
La seguente tabella riporta il modulo di analisi da selezionare in base al tipo di size
standard utilizzato.
Se si usa il size standard...
Selezionare il modulo di analisi...
400HD
GS400HDAnalysis.gsp
GS350
GS350Analysis.gsp
GS500
GS500Analysis.gsp
—
GS400CubicAnalysis.gspa
GS400Ord2Analysis.gspa
a. Questi moduli sono per gli operatori esperti con specifiche esigenze di sizing. Vedere il
manuale d’uso del software ABI PRISM GeneScan Analysis.
Nota È possibile esaminare le impostazioni di tutti questi file mediante il software
GeneScan Analysis. I significati delle varie impostazioni sono descritti nel manuale
d’uso del software ABI PRISM GeneScan Analysis.
7
Per rianalizzare il medesimo campione, selezionare un secondo modulo di corsa e
un secondo modulo di analisi. È possibile analizzare un campione fino a cinque
volte.
I campioni vengono automaticamente raggruppati in modo da analizzare in
sequenza tutti quelli con lo stesso modulo di corsa.
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-21
Per immettere le informazioni relative al campione e salvare il record della piastra,
procedere come segue. (Continua)
Passa
8
Procedura
Verificare che il record della piastra sia corretto, quindi fare clic su OK.
Nota Occorre qualche istante per salvare il nuovo record della piastra nel
database e aggiungerlo alla tabella Pending Plate Records (Record delle piastre in
attesa) mostrata qui sotto.
Nota Prima di poter utilizzare lo stesso nome per un altro record della piastra,
occorre eliminare dal database il record originale.
2-22 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Collegamento di una piastra
Introduzione La seguente procedura descrive come collegare una piastra presente
sull’autocampionatore al record della piastra creato dall’operatore. Eseguire questa
operazione prima di avviare la corsa sulla piastra.
IMPORTANTE Il collegamento di una piastra è possibile anche se non vi è alcun modulo di
corsa selezionato per i rispettivi campioni. In questo caso, non viene visualizzato alcun
messaggio di errore, ma le analisi dei campioni presenti nella piastra non vengono
programmate.
Collegamento di una Per collegare una piastra a un record della piastra, procedere come segue.
piastra a un record
della piastra Passa Procedura
1
Fare clic sulla scheda Plate View (Visualizzazione piastra) nella finestra del
3100 Data Collection Software per aprire la pagina Plate View.
Scheda Plate
View
2
Nella pagina Plate View, eseguire le seguenti operazioni.
a. Nella tabella Pending Plate Records, fare clic sul record della piastra
corrispondente alla piastra da collegare.
b. Fare clic sull’indicatore di posizione della piastra corrispondente alla piastra da
collegare.
Fare clic sul record
della piastra
Fare clic sull’indicatore di
posizione della piastra
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-23
Per collegare una piastra a un record della piastra, procedere come segue.
Passa
3
(Continua)
Procedura
Verificare l’avvenuto collegamento della piastra.
Dopo il collegamento della piastra:
♦ il pulsante Run Instrument (Avvia strumento) della barra degli strumenti è abilitato
e lo strumento è pronto a partire;
♦ l’indicatore di posizione della piastra corrispondente alla piastra collegata diventa
verde;
♦ il record della piastra si sposta dalla tabella Pending Plate Records (Record delle
piastre in attesa) alla tabella Linked Plate Records (Record delle piastre
collegate).
Il pulsante Run
Instrument è abilitato
L’indicatore di
posizione della
piastra è verde
Il record della piastra passa alla tabella Linked Plate Records
4
Per collegare una seconda piastra, se necessario, ripetere i passas da 1 a 3.
2-24 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Per collegare una piastra a un record della piastra, procedere come segue.
Passa
5
(Continua)
Procedura
Fare clic sulla scheda Run View (Visualizzazione corsa) per visualizzare la
programmazione della corsa.
Nota Sebbene sia possibile eliminare singole corse, l’ordine in base al quale le
corse sono programmate non può essere modificato. La programmazione delle
corse dipende da vari fattori; per ottenere informazioni in merito, consultare il
Manuale d’uso dell’analizzatore genetico ABI PRISM 3100.
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-25
Avvio e monitoraggio della corsa
Avvio di una corsa Per avviare una corsa, procedere come segue.
Passa
1
Procedura
Fare clic sul pulsante verde Run Instrument per avviare le corse programmate.
Pulsante Run Instrument
Una corsa basata sul GeneScan_POP4DefaultModule richiede circa 45 minuti.
Monitoraggio di Per monitorare una corsa, procedere come segue.
una corsa
Passa
Procedura
1
Fare clic sulla scheda Status View (Visualizzazione stato) per monitorare lo stato
dello strumento durante la corsa.
2
Durante la corsa, è possibile visualizzare i dati usando le pagine Array View
(Visualizzazione set) e Capillary View (Visualizzazione capillari).
IMPORTANTE Le finestre Array View e Capillary View vanno sempre richiuse: per
evitare irrimediabili problemi legati all’aggiornamento dello schermo, non lasciarle
mai aperte per lunghi periodi di tempo durante l’esecuzione di una corsa. Lasciare
aperta la finestra Status View.
Per ottenere ulteriori informazioni sulle finestre Array View e Capillary View,
consultare la sezione “Visualizzazione dei dati grezzi” a pagina 3-2.
2-26 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Arresto di una corsa e recupero dei dati
Arresto o salto Quando una corsa è in esecuzione, sono visibili i pulsanti Skip to Next Run (Salta alla
di una corsa corsa successiva), Pause (Pausa) e Stop (Arresta) della barra degli strumenti.
Pulsante Stop
Pulsante Pause
Pulsante Skip to Next Run
Per arrestare la corsa in atto e...
Fare clic...
continuare con le altre corse
programmate
sul pulsante Skip.
arrestare le altre corse programmate
a. sul pulsante Stop;
b. sul pulsante Now (Adesso) nella finestra di
dialogo Question (Domanda).
Se l’autoestrazione L’autoestrazione dei dati di una corsa arrestata dovrebbe avvenire automaticamente.
non riesce In caso contrario, usare il comando Extract data into sample files (Estrai dati in file
campioni) in base a quanto descritto qui sotto.
Per recuperare i dati da una corsa arrestata, procedere come segue.
Passa
1
Procedura
Nel menu Instrument (Strumento), selezionare Data Acquisition (Acquisizione dati)
e quindi Extract data into sample files (Estrai dati in file campioni).
Osservare la comparsa del messaggio “Sample Files Successfully Extracted”
(Estrazione file campioni riuscita) nella barra di stato.
Nota I dati estratti non sono stati analizzati. Per analizzare i file dei campioni,
servirsi del software GeneScan Analysis.
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-27
Visualizzazione, modifica o creazione di un modulo di corsa
Introduzione Il modulo di corsa specifica le informazioni relative alle modalità di corsa del campione
(ad esempio, la durata della corsa, la temperatura e il tempo di iniezione).
Visualizzazione di un Per visualizzare un modulo di corsa, procedere come segue.
modulo di corsa
Passa
1
Procedura
Fare clic sul pulsante Module Editor della barra degli strumenti.
Viene visualizzata la finestra di dialogo del Module Editor.
2
Nella casella Modules (Moduli), fare clic sulla scheda GeneScan.
3
Per visualizzare i parametri di un modulo specifico, selezionare il nome del modulo
desiderato nel menu. Vengono così visualizzati tutti i parametri del modulo di corsa
selezionato.
2-28 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Modifica o creazione Per modificare un modulo di corsa esistente o per crearne uno nuovo, procedere
di un modulo come segue.
di corsa
Passa
1
Procedura
Fare clic sul pulsante Module Editor della barra degli strumenti.
Viene visualizzata la finestra di dialogo del Module Editor.
2
Selezionare il modulo di corsa da usare come modello.
3
Modificare i valori dei parametri desiderati.
IMPORTANTE Vengono accettati solo numeri interi.
IMPORTANTE Accertarsi che tutti i valori immessi siano visualizzati in rosso: i valori
in nero non vengono salvati.
4
Se si desidera...
Allora…
salvare le modifiche apportate al
modulo corrente
fare clic su Save (Salva).
creare un nuovo modulo di corsa
Nota Il comando Save non funziona con i
moduli di corsa predefiniti.
a. fare clic su Save As (Salva con nome);
b. immettere un nome descrittivo esclusivo
e fare clic su OK.
5
Alla fine di queste operazioni, care clic sul pulsante Close (Chiudi,
dal Module Editor.
) per uscire
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-29
Visualizzazione e modifica di un modulo di analisi
Introduzione Il modulo di analisi specifica come viene analizzato il dato grezzo alla fine della corsa
(ad esempio, i parametri relativi all’intervallo di analisi e al size standard).
Visualizzazione e Per visualizzare o modificare un modulo di analisi GeneScan (file .gsp), procedere
modifica dei moduli come segue.
di analisi
Passa
1
Procedura
Avviare il software GeneScan Analysis.
È possibile che un’icona di programma del software GeneScan Analysis sia situata
nel menu Start o che un collegamento ad esso corrispondente sia situato sul
desktop. In caso contrario, è possibile reperire il file di programma dell’applicazione
(GeneScan.exe) nella seguente directory:
D:\AppliedBio\GeneScan\Bin
2
Nel menu File, selezionare Open (Apri).
3
Selezionare l’icona Analysis Parameters (Parametri di analisi).
4
Selezionare il modulo di analisi da visualizzare o modificare. I moduli di analisi sono
memorizzati nella seguente directory:
D:\AppliedBio\Shared\Analysis\Sizecaller\Params
5
Fare clic su Open. Questa operazione apre il modulo di analisi selezionato.
2-30 Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti
Per visualizzare o modificare un modulo di analisi GeneScan (file .gsp), procedere
come segue. (Continua)
Passa
6
Procedura
Volendo, è possibile modificare il modulo di analisi. Per ottenere ulteriori informazioni
sui parametri, consultare il Manuale d’uso del software ABI PRISM GeneScan
Analysis.
7
Se è stato modificato il
modulo di analisi e si
desidera…
salvare le modifiche in un
nuovo modulo di analisi
Allora…
a. nel menu File, selezionare Save As;
b. immettere un nome descrittivo esclusivo e
fare clic su OK.
IMPORTANTE I moduli di analisi devono
essere memorizzati nella seguente directory:
D:\AppliedBio\Shared\Analysis\
Sizecaller\Params
salvare le modifiche apportate
al modulo di analisi corrente
nel menu File, selezionare Save.
eliminare le modifiche
apportate
fare clic sul pulsante Close per chiudere la
finestra.
Esecuzione di una corsa per l’analisi di frammenti 2-31
Visualizzazione e analisi
dei dati
3
3
Dati generali
Questo capitolo Il presente capitolo tratta i seguenti argomenti.
Vedere
pagina
Argomento
Visualizzazione nel software Data Collection dei dati grezzi di una corsa
completata
3-2
Visualizzazione dei dati analizzati
3-5
Analisi o rianalisi dei dati
3-12
Nota Il presente capitolo presuppone che i dati della corsa siano stati estratti in file di
campioni. Se si sta utilizzando l’ABI PRISM® analizzatore genetico 3100 unitamente al sistema
di database BioLIMS®, è consigliabile consultare il Manuale d’uso del software ABI PRISM
GeneScan Analysis (P.N. 4308923) per ottenere informazioni su come accedere al database
mediante il programma di analisi.
Visualizzazione e analisi dei dati 3-1
Visualizzazione nel software Data Collection dei dati grezzi di una corsa
completata
Introduzione I dati grezzi sono dati suddivisi in componenti multipli (corretti per la sovrapposizione
spettrale) ma non corretti per la mobilità. Nel software 3100 Data Collection, esistono
due formati per la visualizzazione dei dati grezzi.
♦
Sulla pagina Array View (Visualizzazione set), allo stesso modo in cui si
visualizzano gli output dei file dei gel da uno strumento slab-gel ABI PRISM®.
♦
Sulla pagina Capillary View (Visualizzazione capillari), capillare per capillare.
IMPORTANTE Le finestre Array View e Capillary View vanno sempre richiuse: durante una
corsa, non lasciarle aperte per lunghi periodi di tempo, in quanto ciò può provocare irrimediabili
problemi di aggiornamento dello schermo. Lasciare aperta la finestra Status View.
Visualizzazione Per visualizzare i dati grezzi da una corsa completata, procedere come segue.
dei dati grezzi
Passa
Procedura
1
Nel software 3100 Data Collection, fare clic sulla scheda Array View per
visualizzare la pagina Array View.
2
Nel menu Instrument (Strumento), selezionare Data Acquisition (Acquisizione dati)
e quindi Display Run Data (Visualizza dati corsa).
Viene visualizzata la finestra di dialogo Select the run to display (Seleziona corsa
da visualizzare).
3
Nel menu a discesa, selezionare la corsa da visualizzare e fare clic su OK.
Nota È possibile visualizzare qualsiasi corsa completata presente nel database
dello strumento.
Nota
3-2 Visualizzazione e analisi dei dati
Il richiamo dei dati richiede alcuni istanti.
Per visualizzare i dati grezzi da una corsa completata, procedere come segue.
Passa
4
(Continua)
Procedura
Per visualizzare tutti i dati, servirsi delle funzioni di scorrimento della pagina Array
View.
IMPORTANTE Le finestre Array View e Capillary View vanno sempre richiuse:
durante una corsa, non lasciarle aperte per lunghi periodi di tempo, in quanto ciò
può provocare irrimediabili problemi di aggiornamento dello schermo. Lasciare
aperta la finestra Status View.
Visualizzazione dei
dati dei capillari/colori
Visualizzazione dell’elettroferogramma non elaborato per il
capillare selezionato
Utilizzare questa
barra di
scorrimento per
visualizzare i dati
blocco per blocco
Il capillare
selezionato viene
visualizzato al
centro del
tracciato
Visualizzazione e analisi dei dati 3-3
Per visualizzare i dati grezzi da una corsa completata, procedere come segue.
Passa
5
(Continua)
Procedura
In alternativa, per visualizzare i dati dell’elettroferogramma per più capillari
contemporaneamente, fare clic sulla scheda Capillary View (Visualizzazione
capillari) per visualizzare la pagina Capillary View.
IMPORTANTE Le finestre Array View e Capillary View vanno sempre richiuse:
durante una corsa, non lasciarle aperte per lunghi periodi di tempo, in quanto ciò
può provocare irrimediabili problemi di aggiornamento dello schermo. Lasciare
aperta la finestra Status View.
Selezionare le
caselle
corrispondenti
ai capillari da
visualizzare
3-4 Visualizzazione e analisi dei dati
Visualizzazione dei dati analizzati
Introduzione Dopo l’estrazione di una corsa nei file dei campioni, è possibile usare il software ABI
PRISM® GeneScan® Analysis per visualizzare i dati dell’elettroferogramma, sia grezzi
che analizzati.
Per ottenere informazioni particolareggiate sulla visualizzazione e l’analisi dei dati
GeneScan, consultare il Manuale d’uso del software ABI PRISM GeneScan Analysis.
Individuazione dei Al completamento di una corsa, i file dei campioni analizzati vengono esportati nella
file dei campioni cartella della corsa situata, insieme al registro della corsa, nella seguente directory:
D:\AppliedBio\3100\DataExtractor\ExtractedRuns
Qui di seguito è mostrato un esempio di cartella della corsa.
Nome predefinito Il nome predefinito della cartella della corsa è:
della cartella di Run_<Nome strumento>_<data>_<ID corsa>.
corsa Qui di seguito è mostrato un esempio di nome della cartella della corsa.
Numero della corsa nella giornata
Nome
dello strumento
Anno-mese-giorno
Visualizzazione e analisi dei dati 3-5
Visualizzazione Nota Tutte le funzioni del software sono descritte nel Manuale d’uso del software ABI PRISM
dei singoli file GeneScan Analysis.
dei campioni Per creare un nuovo progetto e aggiungervi e visualizzare i file dei campioni,
procedere come segue.
Passa Procedura
1
Avviare il software GeneScan Analysis.
È possibile che vi sia un’icona di programma del software GeneScan Analysis nel
menu Start o un’icona di collegamento sul desktop. In caso contrario, è possibile
reperire il file di programma dell’applicazione (GeneScan.exe) nella seguente
directory:
D:\AppliedBio\GeneScan\Bin
2
Nel menu File, selezionare New (Nuovo).
3
Fare clic sull’icona Project (Progetto) per creare un nuovo progetto.
Questa operazione apre una finestra Analysis Control (Controllo analisi) priva di
nome.
4
3-6 Visualizzazione e analisi dei dati
Nel menu Project, selezionare Add Sample Files (Aggiungi file campioni) per aprire la
finestra di dialogo Add Sample Files.
Per creare un nuovo progetto e aggiungervi e visualizzare i file dei campioni,
procedere come segue. (Continua)
Passa Procedura
5
Nella finestra di dialogo Add Sample Files, eseguire le seguenti operazioni.
a. Selezionare la cartella contenente i file dei campioni desiderati.
b. Fare clic su Add All (Aggiungi tutti) per aggiungere tutti i file presenti nella cartella
all’elenco del progetto, o su Add (Aggiungi) per aggiungere solo i file selezionati.
Selezionare la
cartella
contenente i file
dei campioni
Aggiungere i file
selezionati alla
casella di elenco
6
Fare clic su Finish (Finito) per chiudere la finestra di dialogo Add Sample Files.
I file dei campioni vengono aggiunti alla finestra Analysis Control.
Nota Nella finestra Analysis Control vengono visualizzati solo i primi 20 caratteri dei
nomi dei file dei campioni.
7
Salvare il progetto come segue.
a. Nel menu File, selezionare Save Project (Salva progetto).
b. Immettere un nome di file per il progetto e fare clic su Save (Salva).
Visualizzazione e analisi dei dati 3-7
Per creare un nuovo progetto e aggiungervi e visualizzare i file dei campioni,
procedere come segue. (Continua)
Passa Procedura
8
Per visualizzare un file del campione, fare doppio clic sul suo nome nella finestra
Analysis Control.
Pulsanti di visualizzazione
9
Se la finestra visualizzata somiglia a quella illustrata qui di seguito, i file dei campioni
non sono stati analizzati. Per ottenere informazioni sull’analisi dei dati, consultare la
sezione “Analisi o rianalisi dei dati” a pagina 3-12.
10
Se la finestra visualizzata non somiglia né a quella al step 8, né a quella al step 9 qui
sopra, fare clic sul pulsante Risultati del campione situato nell’angolo inferiore sinistro
della finestra.
Risultati del campione
Informazioni file campione
Dati non analizzati
3-8 Visualizzazione e analisi dei dati
Per creare un nuovo progetto e aggiungervi e visualizzare i file dei campioni,
procedere come segue. (Continua)
Passa Procedura
11
Usare lo zoom per modificare la scala di visualizzazione del tracciato.
a. Fare clic sullo zoom per selezionarlo (
).
b. Fare clic sul tracciato per ingrandirlo o farvi clic premendo ALT per rimpicciolirlo.
In alternativa, utilizzare i comandi del menu View (Visualizza) per regolare la scala di
visualizzazione del tracciato.
12
Per identificare un picco, farvi clic.
La riga corrispondente a tale picco nella tabella GeneScan viene evidenziata.
Visualizzazione di La seguente procedura illustra la finestra Results Control (Controllo risultati). Una
più file esauriente descrizione della finestra Results Control viene fornita nel Manuale d’uso
del software ABI PRISM GeneScan Analysis.
Per visualizzare più gruppi di dati mediante la finestra Results Control, procedere
come segue.
Passa Procedura
1
Se non è già in esecuzione, lanciare il software GeneScan Analysis.
2
Creare un progetto come descritto nei punti da 2 a 6 a partire da pagina 3-6. In
alternativa, aprire un progetto esistente selezionando Open nel menu File.
3
Nel menu Windows (Finestre), selezionare Results Control.
4
Nel menu # of Panels (N. di pannelli), selezionare 8.
Visualizzazione e analisi dei dati 3-9
Per visualizzare più gruppi di dati mediante la finestra Results Control, procedere
come segue. (Continua)
Passa Procedura
5
Fare clic sul numero del campione del progetto per selezionare tutti i colori per tale
campione.
Numero del campione del progetto
Colore dei fluorocromi
Pulsante elettroferogramma
Pulsante tabella
Numero di
pannelli
Numero del
pannello
6
Configurare il pannello successivo facendo clic sul pulsante Panel Number per il
pannello 2 e ripetendo il Passa 5 sopra descritto.
7
Fare clic sul pulsante Display per visualizzare i pannelli e la tabella.
3-10 Visualizzazione e analisi dei dati
Per visualizzare più gruppi di dati mediante la finestra Results Control, procedere
come segue. (Continua)
Passa Procedura
8
Per stampare la visualizzazione, nel menu File, selezionare Print (Stampa).
9
Utilizzare i pulsanti Clear Panel (Cancella pannello) o Clear All (Cancella tutti) della
finestra Results Control per eliminare i pannelli dalla visualizzazione.
Visualizzazione e analisi dei dati 3-11
Analisi o rianalisi dei dati
Introduzione Nota Per ottenere ulteriori informazioni sull’analisi dei dati mediante il software GeneScan
Analysis, consultare il Manuale d’uso del software ABI PRISM GeneScan Analysis.
Quando analizzare i dati con il software GeneScan
Se non è stato specificato un modulo di analisi nel record della piastra, i dati contenuti
nel file del campione non sono analizzati.
Se il file del campione non contiene dati analizzati, è necessario analizzarlo come
descritto qui di seguito.
Quando rianalizzare i dati con il software GeneScan
Rianalizzare i file dei campioni con il software GeneScan:
♦
se è stato selezionato il modulo di analisi sbagliato nel record della piastra
♦
per vedere l’effetto della variazione dei parametri di analisi sui dati
Analisi o rianalisi Per analizzare o rianalizzare i file dei campioni, procedere come segue.
dei file dei campioni
Passa Procedura
1
Se non è già in esecuzione, lanciare il software GeneScan Analysis.
2
Creare un progetto come descritto nei punti da 2 a 6 a partire da pagina 3-6. In
alternativa, aprire un progetto esistente selezionando Open nel menu File.
3
Nell’elenco a comparsa Size Standard, selezionare il file (.szs) corrispondente al size
standard corretto per i file dei campioni inclusi nella tabella.
4
Premere CTRL e fare clic sul campo del colore del fluorocromo per impostare il colore
del size standard.
Il rombo nel campo del colore rosso indica che il size standard rosso verrà usato per
l’analisi.
3-12 Visualizzazione e analisi dei dati
Per analizzare o rianalizzare i file dei campioni, procedere come segue.
(Continua)
Passa Procedura
5
Nell’elenco a comparsa Parameters (Parametri), selezionare il file (.gsp)
corrispondente ai parametri di analisi corretti per i file dei campioni inclusi nella
tabella.
6
Per riesaminare o modificare i parametri di analisi, fare doppio clic sul nome del file
dei parametri.
Viene visualizzata la finestra di dialogo Analysis Parameters (Parametri di analisi). I
valori consigliati per i parametri sono mostrati qui di seguito.
7
Se si apportano modifiche ai parametri di analisi, procedere come segue.
a. Selezionare Save As nel menu File.
b. Selezionare un nuovo nome per il file dei parametri di analisi (.gsp).
Visualizzazione e analisi dei dati 3-13
Per analizzare o rianalizzare i file dei campioni, procedere come segue.
(Continua)
Passa Procedura
8
Selezionare tutte le corsie dei fluorocromi facendo clic sull’angolo superiore sinistro
della barra dei campi dei colori dei fluorocromi.
Fare clic qui per selezionare tutte le corsie e tutti i colori.
Prima di fare clic
9
Dopo aver fatto
Fare clic sul pulsante Analyze (Analizza).
I dati analizzati vengono automaticamente salvati nei file dei campioni. Se i file dei
campioni contengono dati già analizzati, questi vengono sovrascritti con i nuovi dati.
Man mano che vengono analizzate, le corsie dei colori vengono deselezionate nei
campi dei colori dei fluorocromi.
3-14 Visualizzazione e analisi dei dati
Calibrazioni spaziale e
spettrale
4
4
Dati generali
Questo capitolo Il presente capitolo tratta i seguenti argomenti.
Argomento
Vedere
pagina
Esecuzione di una calibrazione spaziale
4-2
Esecuzione di una calibrazione spettrale
4-6
Calibrazioni spaziale e spettrale 4-1
Esecuzione di una calibrazione spaziale
Quando eseguire una Una calibrazione spaziale va eseguita ogni volta che:
calibrazione spaziale ♦ si installa o si sostituisce il set di capillari
♦
si rimuove temporaneamente il set di capillari dalla camera del rivelatore
Esecuzione di una Per eseguire una calibrazione spaziale, procedere come segue.
calibrazione spaziale
Passa
1
Procedura
Nel menu Tools (Strumenti), selezionare Perform Spatial Calibration (Esegui
calibrazione spaziale).
Viene visualizzata la seguente finestra di dialogo.
2
Selezionare la casella di controllo Fill capillaries (Riempi capillari) se:
♦ i capillari non contengono polimero (cioè, se si tratta di un nuovo set di
capillari), o
♦ il polimero nei capillari è stato utilizzato in una corsa
Note Non è necessario riempire i capillari ogni volta che si esegue una
calibrazione spaziale.
3
Fare clic su Start (Avvia). La calibrazione dura approssimativamente:
♦ 2 minuti senza il riempimento dei capillari
♦ 8,5 minuti con il riempimento dei capillari
4-2 Calibrazioni spaziale e spettrale
Per eseguire una calibrazione spaziale, procedere come segue.
Passa
4
(Continua)
Procedura
Se la calibrazione...
Allora…
riesce
viene visualizzata la seguente finestra di dialogo.
a. Fare clic su Details (Dettagli) per visualizzare la
finestra Spatial Calibration Profile (Profilo
calibrazione spaziale).
b. Passare alla sezione “Visualizzazione dei risultati
e salvataggio dei dati” riportata più avanti.
non riesce
viene visualizzata una finestra riportante un
messaggio di errore e informazioni sulla ragione
dell’insuccesso della calibrazione.
a. Fare clic su Details per visualizzare la finestra
Spatial Calibration Profile.
b. Eseguire una delle seguenti operazioni.
– Fare clic su Cancel (Annulla), quindi fare clic su
Start per ripetere la calibrazione.
– Intraprendere le opportune azioni correttive
come delineato a pagina 4-5.
Calibrazioni spaziale e spettrale 4-3
Visualizzazione dei Per visualizzare i risultati della calibrazione spaziale e salvare i dati, procedere come
risultati e segue.
salvataggio dei dati
Passa
1
Procedura
Valutare il profilo della calibrazione spaziale.
Nota Per ottenere informazioni sulla valutazione del profilo della calibrazione,
consultare il Manuale d’uso dell’analizzatore genetico ABI PRISM 3100 (P.N.
4315834).
Una volta terminata questa operazione, fare clic su OK per chiudere la finestra
Spatial Calibration Profile.
2
Se il profilo della
calibrazione spaziale
è…
Allora…
soddisfacente
proseguire con il passa 3.
insoddisfacente
a. fare clic su Cancel per chiudere la finestra
Details, quindi fare clic su Start per ripetere la
calibrazione, oppure
b. riposizionare una o più delle crocette rosse. Per
spostare una crocetta, modificare il valore nella
casella Capillary Position (Posizione capillare),
quindi fare clic all’esterno di tale casella.
Se la calibrazione continua a fornire risultati
insoddisfacenti, consultare la sezione “Se la
calibrazione non riesce” a pagina 4-5.
4-4 Calibrazioni spaziale e spettrale
Per visualizzare i risultati della calibrazione spaziale e salvare i dati, procedere come
segue. (Continua)
Passa
3
Procedura
Fare clic su OK per chiudere la finestra Perform Spatial Calibration e inviare la
calibrazione riuscita allo strumento.
Viene visualizzata la finestra di dialogo Question (Domanda).
4
Per…
Fare così…
salvare i dati di calibrazione nel
database del software 3100 Data
Collection
fare clic su Yes (Sì).
cancellare questi dati e usare i dati
di una corsa precedente
a. fare clic su No;
b. Sostituire la mappa di calibrazione
spaziale corrente.
Se la calibrazione Se la calibrazione ha esito negativo, o se il profilo della calibrazione riuscita non è
non riesce convincente, attuare una o più delle seguenti azioni correttive.
♦
Ripetere la calibrazione.
♦
Riempire i capillari di polimero, quindi ripetere la calibrazione.
♦
Pulire la finestra del set, quindi ripetere la calibrazione.
♦
Riposizionare la finestra del set nella cella del rivelatore, quindi ripetere la
calibrazione.
Calibrazioni spaziale e spettrale 4-5
Esecuzione di una calibrazione spettrale
Introduzione L’esecuzione di una calibrazione spettrale si articola in tre fasi principali:
♦
l’impostazione degli standard
♦
l’avvio della calibrazione spettrale
♦
il controllo della calibrazione spettrale
Nota La presente sezione descrive l’esecuzione della calibrazione spettrale mediante
standard matrice Matrix Standard Set DS-30. Per informazioni sull’esecuzione della
calibrazione spettrale per un altro set di fluorocromi, consultare il Manuale d’uso
dell’analizzatore genetico ABI PRISM 3100.
La calibrazione spettrale viene eseguita allo scopo di creare una matrice per la
correzione della sovrapposizione degli spettri delle emissioni in fluorescenza dei
fluorocromi. L’applicazione di questa matrice ai dati grezzi è denominata
multicomponenting. Per una spiegazione più dettagliata della calibrazione spettrale,
consultare il Manuale d’uso dell’analizzatore genetico ABI PRISM 3100.
Quando eseguire La calibrazione spettrale va eseguita:
una calibrazione ♦ quando si usa un nuovo set di fluorocromi sullo strumento
spettrale
♦
dopo il riallineamento del laser o della telecamera CCD da parte di un tecnico
qualificato
♦
se si comincia a notare una riduzione nella separazione degli spettri (picchi
pull-up e/o pull-down)
Preparazione degli Per preparare gli standard matrice per le matrici del Dye Set D, procedere come
standard matrice per segue.
le matrici del
Passa
Procedura
Dye Set D
1
Scongelare e mescolare bene su vortex le provette dei quattro standard matrice
DS-30 (P.N. 4316100).
2
Centrifugare le provette.
4-6 Calibrazioni spaziale e spettrale
Per preparare gli standard matrice per le matrici del Dye Set D, procedere come
segue. (Continua)
Passa
3
Procedura
Preparare il Matrix Standard Set DS-30 per il set di fluorocromi D combinando i
seguenti componenti in una provetta per microcentrifuga da 1,5-ml
opportunamente etichettata.
Reagente
Volume (µl)
6FAM
1,25
HEX
1,25
NED
1,25
ROX
Formammide Hi-Di
1,25
TM
(P.N. 4311320)
195
Volume finale
200
! AVVERTENZA SOSTANZE CHIMICHE PERICOLOSE. La formammide è
nociva se assorbita attraverso la cute e può irritare gli occhi, la pelle e le vie
respiratorie. Può danneggiare il sistema nervoso centrale, i sistemi riproduttivi
maschile e femminile e costituisce un rischio potenziale di difetti congeniti.
Leggere le MSDS e attenersi rigorosamente alle istruzioni relative alla
manipolazione di questa sostanza. Indossare adeguata protezione oculare,
indumenti e guanti di protezione.
4
Agitare bene con Vortex.
5
Centrifugare la miscela.
6
Riscaldare la miscela a 95 °C per 3–5 minuti per denaturare il DNA.
7
Mettere la miscela in ghiaccio per 2 minuti.
Calibrazioni spaziale e spettrale 4-7
Caricamento degli Per caricare gli standard, procedere come segue.
standard
Passa
1
Procedura
Dosare 10 µl dello standard matrice denaturato in:
♦ una piastra a 96 pozzetti, nei pozzetti da A1 a H2, come illustrato
♦ una piastra a 384 pozzetti, nei pozzetti A1, A3, C1, C3, E1, E3 e così via, come
illustrato
2
Centrifugare la piastra in modo che ciascuno standard vada a depositarsi sul
fondo del rispettivo pozzetto. I campioni devono:
avere questo
aspetto...
non avere questo
aspetto...
non avere questo
aspetto...
Il campione è
depositato
correttamente sul fondo
del pozzetto.
Il campione si trova
sulla parete del pozzetto
perché la piastra non è
stata centrifugata.
Una bolla d’aria si trova
in fondo al pozzetto
perché la piastra non è
stata:
♦ centrifugata con
forza sufficiente,
oppure
♦ centrifugata per un
periodo di tempo
sufficiente
4-8 Calibrazioni spaziale e spettrale
Preparazione della Attenersi alle istruzioni da pagina 2-10 a pagina 2-16 per:
piastra e dello ♦ assemblare le piastre
strumento
♦
controllare e aggiungere i fluidi sullo strumento
♦
posizionare la piastra sull’autocampionatore
Creazione di un Per creare un record della piastra per gli standard matrice denaturati, procedere come
record della piastra segue.
Passa
1
Procedura
Sulla pagina Plate View (Visualizzazione piastra) del software 3100 Data Collection,
fare clic su New (Nuovo).
Viene visualizzata la finestra di dialogo del Plate Editor.
2
Nella finestra di dialogo del Plate Editor:
a. assegnare un nome alla piastra
b. selezionare Spectral Calibration (Calibrazione spettrale)
c. accertarsi che siano state selezionate le dimensioni corrette della piastra
d. Fare clic su Finish (Finito).
Questa operazione apre il foglio elettronico del Plate Editor.
3
Completare il foglio elettronico del Plate Editor per i pozzetti caricati.
a. Digitare il nome da attribuire ai campioni.
b. Selezionare Dye Set D (Set di fluorocromi D).
c. Selezionare il modulo di corsa Spect36_POP4DefaultModule.
d. Selezionare il parametro spettrale MtxStd{GeneScan-SetD}.par.
Fare clic su OK.
IMPORTANTE Verificare che sia stato selezionato il file dei parametri spettrali
corretto per il tipo di fluorocromi utilizzati. La selezione del file di parametri sbagliato
impedisce la riuscita della calibrazione spettrale.
Ciò crea un record della piastra nel database per la corsa di calibrazione. Dopo
pochi secondi, il nome del record della piastra compare nella tabella Pending Plate
Records (Record delle piastre in attesa) della pagina Plate Setup (Impostazione
piastra).
Calibrazioni spaziale e spettrale 4-9
Collegamento di Per collegare una piastra al record della piastra, procedere come segue.
una piastra
Passa
Procedura
1
Nella tabella Pending Plate Records, fare clic sul record della piastra appena
creato.
2
Fare clic sull’immagine grafica della piastra corrispondente alla piastra
sull’autocampionatore.
Nota
Dopo il collegamento della piastra:
– il colore dell’immagine grafica della piastra cambia dal giallo al verde
– il record della piastra si sposta dalla tabella Pending Plate Records alla
tabella Linked Plate Records (Record delle piastre collegate) (questa
operazione può richiedere fino a 30 secondi)
– il pulsante Run Instrument (Avvia strumento) della barra degli strumenti è
attivato. Lo strumento è cioè pronto a partire.
Avvio della Per avviare la calibrazione, procedere come segue.
calibrazione
Passa
Procedura
1
Se si desidera riesaminare la programmazione della corsa prima di avviarla, fare
clic sulla scheda Run View (Visualizzazione corsa).
2
Fare clic sul pulsante Run Instrument della barra degli strumenti per avviare la
corsa.
La corsa di calibrazione spettrale dura approssimativamente 30 minuti.
4-10 Calibrazioni spaziale e spettrale
Finestra Spectral Alla fine della corsa, durante l’analisi dei dati, viene visualizzata la finestra Spectral
Calibration Result Calibration Result che indica i capillari che hanno avuto esito positivo e quelli che
(Risultato hanno avuto esito negativo.
calibrazione
Capillare con esito positivo (.)
spettrale)
Capillare con esito negativo (X)
Per prendere atto del completamento della corsa di calibrazione, procedere come
segue.
Passa
1
Procedura
Nella finestra Spectral Calibration Result, fare clic su OK.
IMPORTANTE Riesaminare e valutare il profilo di calibrazione spettrale per ciascun capillare,
anche se la casella Spectral Calibration Result ha indicato la riuscita della calibrazione per tutti
i capillari. Vedere il Manuale d’uso dell’analizzatore genetico ABI PRISM 3100.
Quando la
calibrazione di un
capillare ha esito
negativo
Al capillare con esito negativo viene automaticamente assegnato il profilo spettrale
del più vicino capillare con esito positivo situato alla sua sinistra. Se a sinistra non vi è
alcun capillare con esito positivo, al capillare viene assegnato il profilo del più vicino
capillare con esito positivo situato alla sua destra. I capillari sono contrassegnati in
giallo invece che in verde nella finestra Array View (vedere pagina 3-3).
IMPORTANTE Per le applicazioni in cui i pull-up e i pull-down causano errori critici, si consiglia
di ripetere la calibrazione spettrale e di usare una spettrale unica per ciascun capillare.
Calibrazioni spaziale e spettrale 4-11
Esame di un profilo Dopo aver completato la calibrazione spettrale, è bene controllare sempre la qualità
di calibrazione dei dati spettrali relativi a ciascun capillare.
spettrale per il set
di fluorocromi D Per visualizzare un profilo di calibrazione spettrale corrente per un set di fluorocromi,
procedere come segue.
Passa
1
Procedura
Nel menu Tools (Strumenti), selezionare Display Spectral Calibration (Visualizza
calibrazione spettrale).
Viene visualizzata la finestra di dialogo Question (Domanda).
2
Fare clic su Dye set (Set di fluorocromi).
Viene visualizzata la finestra di dialogo Select the source to display (Seleziona
origine da visualizzare).
Menu a discesa
dei set di
fluorocromi
4-12 Calibrazioni spaziale e spettrale
Per visualizzare un profilo di calibrazione spettrale corrente per un set di fluorocromi,
procedere come segue. (Continua)
Passa
3
Procedura
Selezionare il set di fluorocromi D e fare clic su OK.
Questa operazione visualizza la finestra Matrices for dye set D (Matrici per set di
fluorocromi D).
4
Usare i tasti freccia o il cursore a scorrimento per riesaminare i dati relativi a
ciascun capillare.
Per una calibrazione di buona qualità, la calibrazione di ciascun capillare deve
avere:
♦ un valore Q superiore a 0,95
♦ un numero di condizione da 4 a 7
5
Fare clic su Cancel per chiudere la finestra.
Nota Il software sostituisce automaticamente i capillari con esito negativo.
Tuttavia, se l’operatore non è soddisfatto di un profilo particolare, lo può sostituire
con un profilo prescelto. Per ulteriori informazioni, consultare il Manuale d’uso
dell’analizzatore genetico ABI PRISM 3100.
Calibrazioni spaziale e spettrale 4-13
Manutenzione dello
strumento
5
5
Dati generali
Questo capitolo Il presente capitolo contiene informazioni sulle operazioni volte alla manutenzione
dell’analizzatore genetico ABI PRISM® 3100.
Vedere
pagina
Argomento
Elenco delle operazioni di manutenzione
5-2
Rimozione della bolle d’aria dalla camera superiore del polimero
5-4
Controllo dello spazio disponibile
5-6
Pulizia e controllo delle siringhe
5-8
Rimozione delle camere del polimero
5-10
Pulizia delle camere del polimero
5-11
Aggiunta di polimero fresco allo strumento
5-12
Prima di installare un set di capillari precedentemente utilizzato
5-13
Installazione e rimozione del set di capillari
5-14
Conservazione di un set di capillari
5-16
Arresto dello strumento
5-17
Manutenzione dello strumento 5-1
Elenco delle operazioni di manutenzione
Dati generali La presente sezione elenca le operazioni ordinarie necessarie per mantenere
l’analizzatore genetico 3100 in condizioni di esercizio ottimali. Gli elenchi sono
articolati in base alla frequenza con la quale è necessario eseguire ciascuna
operazione.
Operazioni Le seguenti operazioni vanno eseguite almeno una volta al giorno.
quotidiane
Operazione di manutenzione
Frequenza
Vedere...
Accertarsi che le strisce di setti copripiastra sui serbatoi
siano ben salde e piatte.
Prima di
ciascuna corsa
—
Verificare che i gruppi piastra siano stati correttamente
assemblati.
Prima di
ciascuna corsa
pagina 2-10
Prima di
ciascuna corsa
—
Rabboccare i serbatoi dell’acqua e del tampone di corsa
1X 3100 dello strumento.
Quotidianamente
o prima di
ciascuna corsa
pagina 2-12
Verificare che non vi siano bolle nella camera del
polimero e nei rispettivi canali; le eventuali bolle presenti
vanno eliminate.
Quotidianamente
o prima di
ciascuna corsa
pagina 5-4
Controllare la testata dell’estremità di caricamento per
verificare che le estremità dei capillari non siano
schiacciate o danneggiate.
Quotidianamente
o prima di
ciascuna corsa
—
Controllare che il livello del polimero nella siringa della
riserva del polimero sia almeno 1 ml.
Quotidianamente
o prima di
ciascuna corsa
—
Controllare la camera del polimero per verificare che sia
saldamente inserita sullo strumento.
Quotidianamente
—
Pulire le superfici dello strumento.
Quotidianamente
—
Verificare che non vi siano residui di polimero essiccato
attorno alla camera del polimero; gli eventuali residui
presenti vanno asportati.
Quotidianamente
—
Verificare l’assenza di perdite attorno alle siringhe e ai
dadi.
Quotidianamente
—
Controllare la quantità di spazio libero sul disco fisso.
Eliminare i record delle piastre dal database dello
strumento e archiviare i file dei campioni.
Quotidianamente
pagina 5-6
IMPORTANTE Per evitare di danneggiare le estremità
dei capillari, i fori del fermapiastra devono essere
allineati a quelli della striscia di setti copripiastra.
Accertarsi che i gruppi piastra siano posizionati
correttamente sul portapiastre. Le piastre devono
inserirsi saldamente sul portapiastre.
IMPORTANTE Non utilizzare mai piastre deformate.
5-2 Manutenzione dello strumento
Operazioni Le seguenti operazioni vanno eseguite almeno una volta alla settimana.
settimanali
Operazione di manutenzione
Frequenza
Vedere...
Pulire le siringhe.
Settimanalmente
o secondo le
necessità
pagina 5-8
Pulire i serbatoi dell’acqua e dei tamponi con acqua
tiepida.
Settimanalmente
—
Pulire le camere superiore e inferiore del polimero.
Settimanalmente
pagina 5-11
Sostituire il polimero nelle siringhe, nella camera
superiore del polimero e nel set di capillari.
Settimanalmente
o secondo le
necessità
pagina 5-12
Controllare le condizioni di conservazione dei set
utilizzati.
Settimanalmente
—
Operazioni da Le seguenti operazioni vanno eseguite quando necessario.
eseguire quando
Frequenza
necessario Operazione di manutenzione
Vedere...
Pulire le vaschette di gocciolamento.
Quando
necessario
—
Sostituire il set.
Quando
necessario
pagina 5-14
Rimuovere il polimero residuo dalle estremità dei
capillari. Usare una salvietta priva di lanugine inumidita
con acqua deionizzata.
Quando
necessario
—
Calibrare l’autocampionatore.
Molto
raramente
Manuale
d’uso
Manutenzione dello strumento 5-3
Rimozione della bolle d’aria dalla camera superiore del polimero
Rimozione delle Per ottenere informazioni sul programma guidato Change Polymer (Cambia polimero),
bolle d’aria consultare il Manuale d’uso dell’analizzatore genetico ABI PRISM.
Per rimuovere le bolle d’aria dalla camera superiore del polimero utilizzando il programma
guidato Change Polymer (Cambia polimero), procedere come segue.
Passa
Procedura
1
Abbassare la siringa della riserva del polimero per convogliare le bolle d’aria verso
la parte inferiore destra della camera. Spingere lentamente (o picchiettare) per
ridurre al minimo lo spreco di polimero.
2
Abbassare lentamente la siringa di riempimento del set per convogliare le bolle
d’aria nel canale. Le bolle si raccolgono nel punto di giunzione dei canali.
Le bolle si
raccolgono qui
Tubo della camera del polimero
5-4 Manutenzione dello strumento
Per rimuovere le bolle d’aria dalla camera superiore del polimero utilizzando il programma
guidato Change Polymer (Cambia polimero), procedere come segue. (Continua)
Passa
3
Procedura
a. Tenere premuta la valvola a perno del tampone anodico e abbassare
simultaneamente la siringa di riempimento del set per creare pressione
all’interno dei canali.
b. Rilasciare la valvola a perno del tampone (continuando ad abbassare la siringa
di riempimento del set) per convogliare le bolle nel tubo della camera del
polimero.
4
Ripetere lo step 3 secondo la necessità.
Manutenzione dello strumento 5-5
Controllo dello spazio disponibile
Introduzione Ogni settimana, controllare lo spazio disponibile su disco fisso per verificare che sia
sufficiente per la memorizzazione dei dati che verranno generati.
Le seguenti procedure indicano come controllare lo spazio disponibile:
♦
sul disco fisso (generalmente D:) per i file dei campioni estratti
♦
nel database dello strumento (generalmente sull’unità E:) per i dati grezzi
Controllo dello Per controllare lo spazio libero sul disco fisso per i file dei campioni, procedere come
spazio libero sul segue.
disco fisso
Passa
Procedura
1
Fare doppio clic sull’icona My Computer del desktop per visualizzare le unità
disponibili.
2
Fare clic con il pulsante destro del mouse sull’unità D: e selezionare Properties
(Proprietà).
Viene visualizzata la finestra di dialogo Properties, che riporta lo spazio utilizzato e
lo spazio libero.
5-6 Manutenzione dello strumento
Per controllare lo spazio libero sul disco fisso per i file dei campioni, procedere come
segue. (Continua)
Passa
3
Procedura
Stimare la quantità di spazio libero necessaria utilizzando le informazioni fornite
qui di seguito.
Tipo di file
Spazio libero approssimativo richiesto per file (KB)a
File dei campioni analizzati per l’analisi dei
frammenti
300
File dei campioni non analizzati
100
a. I valori forniti sono stime approssimative. Le dimensioni reali dei file dipendono dal modulo
di corsa selezionato.
4
Se lo spazio disponibile è insufficiente, procedere come segue.
a. Archiviare i file dei campioni su un altro volume.
b. Eliminare i file originali dall’unità.
Controllo dello Nota Le dimensioni del database dello strumento variano automaticamente da 2 a 9 GB, a
spazio libero nel seconda dei dati da memorizzare.
database Per controllare lo spazio disponibile nel database, procedere come segue.
Passa
1
Procedura
Eseguire l’utilità Diskspace.
Per istruzioni in proposito, consultare il Manuale d’uso dell’analizzatore genetico
ABI PRISM 3100 (P.N. 4315834).
2
Se lo spazio utilizzato è superiore a 8 GB, cancellare alcuni o tutti i record delle
piastre memorizzati.
Per istruzioni in proposito, consultare il Manuale d’uso dell’analizzatore genetico
ABI PRISM 3100.
Manutenzione dello strumento 5-7
Pulizia e controllo delle siringhe
Quando pulire Pulire accuratamente le siringhe:
le siringhe ♦ ogni volta che vengono rimosse dallo strumento, o almeno una volta alla
settimana
♦
ad ogni sostituzione del polimero, anche quando si tratta di un nuovo tipo o lotto di
polimero
s
Rimozione delle Per rimuovere le siringhe dallo strumento, procedere come segue.
siringhe
Passa
1
Procedura
Tenere la siringa della riserva del polimero appena sopra il raccordo o alla base e
ruotarla in senso antiorario.
Nel rimuovere la siringa,
non allentare questo
raccordo.
IMPORTANTE Fare attenzione a non rimuovere il raccordo per evitare la
fuoriuscita dei diversi anelli e delle valvole di ritenzione.
2
Afferrare la siringa di riempimento del set e ruotarla in senso antiorario.
3
Eliminare a norma l’eventuale polimero residuo.
4
Passare alla sezione “Pulizia delle siringhe” riportata qui di seguito.
Pulizia delle siringhe Per pulire a fondo le siringhe, procedere come segue.
Passa
1
Procedura
Pulire bene la siringa sciacquandone l’interno, l’esterno e la punta con acqua
tiepida.
Per ottenere maggiori informazioni sulla pulizia delle siringhe, consultare il Manuale
d’uso dell'analizzatore genetico ABI PRISM.
! ATTENZIONE Non usare acqua bollente. L’acqua troppo calda può deformare
il Teflon presente nella punta della siringa.
IMPORTANTE Accertarsi che non vi sia alcun residuo di polimero essiccato
all’interno della siringa.
2
Sciacquare il cilindro e la punta della siringa con acqua deionizzata.
3
Asciugare con aria compressa.
4
Riassemblare la siringa e ispezionarla come descritto a pagina 5-9.
5-8 Manutenzione dello strumento
Controllo delle IMPORTANTE Dopo la pulizia, per evitare perdite durante le corse, le siringhe vanno sempre
siringhe esaminate per determinare l’eventuale assenza di O-ring.
Per controllare le siringhe, procedere come segue.
Passa
1
Procedura
Accertarsi che la siringa sia dotata di due O-ring (P.N. 221102): uno dietro il
puntale e uno attorno al puntale.
O-ring
2
Verificare che il puntale sia saldamente in posizione nell’estremità della siringa.
Manutenzione dello strumento 5-9
Rimozione delle camere del polimero
Rimozione della Per rimuovere la camera superiore del polimero, procedere come segue.
camera superiore del
Passa
Procedura
polimero
1
Rimuovere le siringhe come descritto a pagina 5-8.
2
Scollegare il set di capillari dalla camera del polimero come segue.
a. Premere il pulsante Tray (Vassoio).
b. Aprire gli sportelli dello strumento, del forno e della camera del rivelatore.
c. Allentare il dado del set di capillari.
d. Estrarre parzialmente la camera del polimero.
e. Rimuovere la cella del rivelatore dalla camera del rivelatore.
f. Rimuovere il manicotto del set di capillari dalla camera del polimero.
g. Se si prevede di riutilizzare il set di capillari, riporlo come descritto a
pagina 5-16.
3
Scollegare la camera inferiore del polimero svitando il raccordo del tubo della
camera del polimetro situato sotto il lato destro della camera del polimero
superiore.
4
Afferrare con due mani la camera superiore del polimero ed estrarla.
5
La camera superiore del polimero scorre su due perni in acciaio e si estrae
facilmente una volta che la molla supera il punto di arresto.
Rimozione della Per rimuovere la camera inferiore del polimero, procedere come segue.
camera inferiore
Passa Procedura
del polimero
1
Rimuovere il serbatoio dell’anodo ed eliminare correttamente il tampone residuo.
2
Afferrare la camera inferiore del polimero ed estrarla.
3
Scollegare il raccordo del tubo della camera del polimero.
5-10 Manutenzione dello strumento
Pulizia delle camere del polimero
Quando pulire le Pulire le camere superiore e inferiore del polimero:
camere del polimero ♦ prima di sostituire il polimero nello strumento.
♦
quando il polimero è nello strumento da più di una settimana.
Nota Un polimero caricato da più di una settimana può provocare un aumento transitorio della
corrente durante l’elettroforesi a causa della decomposizione dell’urea.
Pulizia delle camere IMPORTANTE Non esporre le camere del polimero all’azione di solventi organici.
del polimero
Lavare le camere superiore e inferiore del polimero come segue.
Passa
Procedura
1
Rimuovere le camere del polimero dallo strumento come descritto a pagina 5-10.
2
Usare acqua corrente o un contenitore a spruzzo per sciacquare bene con acqua
tiepida la camera superiore del polimero.
3
Esaminare a vista i canali per determinare l’eventuale presenza di residui bianchi
(polimero essiccato). Continuare a lavare i canali fino ad eliminare completamente
gli eventuali residui.
4
Sciacquare la camera e i rispettivi canali con acqua deionizzata.
5
Eliminare l’acqua residua dalla camera del polimero e dai raccordi per evitare la
diluizione del polimero di corsa. Usando una bomboletta di aria compressa, forzare
un getto d’aria attraverso i canali fino ad asciugarli completamente.
Pulizia del serbatoio Lavare il serbatoio all’anodo e il tubo del polimero come segue.
all’anodo e del tubo
Passa
Procedura
del polimero
1
Usare un contenitore a spruzzo per irrigare il tubo della camera del polimero con
acqua deionizzata.
2
Lavare il serbatoio all’anodo con acqua tiepida, quindi sciacquarlo con acqua
deionizzata.
3
Asciugare entrambi i componenti con aria compressa.
Manutenzione dello strumento 5-11
Aggiunta di polimero fresco allo strumento
Quando sostituire il Si consiglia di sostituire il polimero settimanalmente. Il polimero mantiene invariate le
polimero sue proprietà alla temperatura di 25 °C per circa 7 giorni.
Aggiunta o ! ATTENZIONE SOSTANZE CHIMICHE PERICOLOSE. POP può irritare gli occhi, la pelle
sostituzione del e le vie respiratorie. Leggere le MSDS e attenersi rigorosamente alle istruzioni relative alla
polimero manipolazione di questa sostanza. Indossare adeguata protezione oculare, indumenti e guanti
di protezione. Il presente prodotto va usato esclusivamente a scopi di ricerca e sviluppo.
Per aggiungere polimero fresco allo strumento, procedere come segue.
Passa
Procedura
1
Nel menu Tools (Strumenti), selezionare Change Polymer Wizard (Programma
guidato Cambia polimero).
2
Viene visualizzato un messaggio di avvertenza.
Se la lunghezza del set sullo strumento è uguale alla lunghezza riportata nel
messaggio di avvertenza, fare clic su OK per avviare il programma guidato
Change Polymer.
3
5-12 Manutenzione dello strumento
Attenersi alle istruzioni fornite dal programma guidato in merito all’aggiunta di
polimero fresco allo strumento.
Prima di installare un set di capillari precedentemente utilizzato
Introduzione Prima di reinstallare il set di capillari, si consiglia di:
♦
pulire la parte anteriore della cella del rivelatore
♦
verificare che la barra del catodo sia asciutta
Pulizia della cella La presente procedura non è necessaria per i set nuovi, a meno che la cella del
del rivelatore rivelatore non sia stata accidentalmente toccata.
Per pulire la cella del rivelatore, procedere come segue.
Passa
1
Procedura
Dispensare una goccia di metanolo sulla superficie anteriore della cella del
rivelatore.
Superficie anteriore della cella del rivelatore
! AVVERTENZA SOSTANZE CHIMICHE PERICOLOSE. Il metanolo è una
sostanza liquida o un vapore infiammabile. L’esposizione a questa sostanza può
causare irritazione degli occhi, della cute e delle vie respiratorie, depressione del
sistema nervoso centrale e cecità. Leggere le MSDS e attenersi rigorosamente
alle istruzioni relative alla manipolazione di questa sostanza. Indossare adeguata
protezione oculare, indumenti e guanti di protezione.
2
Asciugare la cella con un getto di aria compressa pulita.
Controllo della Durante il collocamento di un set usato nello strumento, accertarsi che la barra del
barra del catodo catodo sia asciutta. Una barra umida può provocare la formazione di archi elettrici.
! AVVERTENZA PERICOLO DI FOLGORAZIONE/INCENDIO. Non lasciare alcun residuo
di sostanza liquida sulla barra del catodo. Ciò può provocare scosse elettriche o incendi.
Verificare che la
barra del catodo
sia asciutta,
specialmente al
centro
Manutenzione dello strumento 5-13
Installazione e rimozione del set di capillari
Quando sostituire il Il set di capillari va sostituito dopo circa 100 corse.
set di capillari
I seguenti problemi possono indicare la necessità di sostituzione del set di capillari.
♦
una scarsa precisione di sizing o un inadeguato rilevamento di alleli
♦
una scarsa risoluzione e/o un calo dell’intensità del segnale
Installazione o ! ATTENZIONE SOSTANZE CHIMICHE PERICOLOSE. POP può irritare gli occhi, la pelle
rimozione del set di e le vie respiratorie. Leggere le MSDS e attenersi rigorosamente alle istruzioni relative alla
capillari mediante il manipolazione di questa sostanza. Indossare adeguata protezione oculare, indumenti e guanti
di protezione. Il presente prodotto va usato esclusivamente a scopi di ricerca e sviluppo.
programma guidato
Per sostituire o installare il set di capillari nello strumento, procedere come segue.
Passa
Procedura
1
Chiudere gli sportelli del forno e dello strumento, quindi premere il pulsante Tray.
2
Nel menu Tools, selezionare Install Capillary Array Wizard (Programma guidato
Installa set di capillari).
Questa operazione apre il programma guidato in questione.
5-14 Manutenzione dello strumento
Per sostituire o installare il set di capillari nello strumento, procedere come
segue. (Continua)
Passa
Procedura
3
Attenersi alle istruzioni fornite dal programma guidato in merito alla sostituzione o
all’installazione di un set.
4
Passare alla sezione “Sostituzione del tampone” riportata qui di seguito.
Sostituzione del Dopo avere installato un nuovo set di capillari, è necessario sostituire il tampone. Una
tampone volta completata questa operazione, sostituire il tampone e l’acqua nei serbatoi dopo
12 ore di funzionamento.
Per istruzioni in merito, consultare la sezione “Controllo e aggiunta dei fluidi” a pagina 2-12.
Manutenzione dello strumento 5-15
Conservazione di un set di capillari
Quando conservare Conservare il set di capillari fuori dallo strumento quando si prevede che resterà
il set fuori dallo inutilizzato per più di una settimana.
strumento Prima di riporre il set di capillari per lunghi periodi di tempo, si consiglia di riempire i
capillari con polimero fresco.
Conservazione del IMPORTANTE Se si intende riutilizzare il set di capillari, non lasciare che i capillari si
set di capillari fuori asciughino. Conservare il set di capillari con entrambe le estremità immerse in tampone di
dallo strumento corsa 1X.
Per conservare il set di capillari fuori dallo strumento, procedere come segue.
Passa
Procedura
1
Riempire il set di capillari con polimero fresco mediante il programma guidato
Change Polymer (Cambia polimero).
2
Rimuovere la protezione della siringa.
3
Rimuovere entrambe le siringhe dalla camera superiore del polimero e smaltire
correttamente l’eventuale polimero residuo.
4
Lavare le siringhe.
5
Rimuovere il set di capillari dallo strumento mediante il programma guidato Install
Capillary Array (Installa set di capillari).
Per istruzioni in merito, consultare la sezione “Installazione e rimozione del set di
capillari” a pagina 5-14.
6
Ricollocare il pannello di copertura sulla cella del rivelatore.
7
Riempire un serbatoio di tampone con tampone di corsa 1X e coprirlo con una
striscia di setti copripiastra. Immergere le estremità dei capillari nel tampone.
8
Riempire una provetta conica da 1,5 ml con acqua deionizzata e inserirvi l’estremità
del rivelatore del set di capillari.
9
Avvolgere la provetta con pellicola da laboratorio (come Parafilm) per impedire
l’evaporazione dell’acqua deionizzata.
10
Riporre il set di capillari in posizione verticale.
11
Il livello del tampone di corsa 1X nel serbatoio e nella provetta va controllato
settimanalmente.
5-16 Manutenzione dello strumento
Arresto dello strumento
Quando eseguire le Eseguire le seguenti procedure di arresto nella situazione opportuna.
opportune
procedure di arresto Se lo strumento verrà
lasciato non sorvegliato per...
Eseguire questa procedura di arresto...
non più di una settimana con
un serbatoio di tampone pieno
a breve termine
per più di una settimana
a lungo termine
IMPORTANTE Per la riuscita di un arresto a breve termine
è necessario mantenere i capillari nel tampone. Ciò evita
l’essiccamento del polimero nei capillari.
Esecuzione di un Eseguire un arresto a breve termine come segue.
arresto a breve
termine Passa Procedura
1
Riempire i capillari con polimero fresco mediante gli appositi comandi manuali.
2
Premere il pulsante Tray per portare l’autocampionatore in posizione estesa.
3
Riempire con tampone di corsa 1X il serbatoio del tampone appena sotto la sommità.
4
Fissare una striscia di setti copripiastra sul serbatoio e collocarlo nella posizione 1
dell’autocampionatore.
5
Con gli sportelli dello strumento aperti, premere il pulsante Tray.
6
Chiudere gli sportelli dello strumento. L’autocampionatore si sposta alla posizione
1, lasciando le estremità dei capillari all’interno del serbatoio del tampone.
7
Spegnere il computer e lo strumento.
Esecuzione di un Eseguire un arresto a lungo termine come segue.
arresto a lungo
Passa
Procedura
termine
1
Per la rimozione e la conservazione del set di capillari fuori dallo strumento,
vedere la procedura a pagina 5-16.
2
Rimuovere i seguenti componenti dallo strumento.
♦ Le siringhe dalla camera superiore del polimero. Per istruzioni in merito, vedere
pagina 5-8.
♦ La camera superiore del polimero. Per istruzioni in merito, vedere pagina 5-10.
♦ La camera inferiore del polimero. Per istruzioni in merito, vedere pagina 5-10.
3
Rimuovere i seguenti componenti dall’autocampionatore.
♦ I gruppi piastra.
♦ I serbatoi.
4
Pulire l’autocampionatore e le vaschette di gocciolamento con salviette in carta
prive di lanugine imbevute d’acqua.
5
Chiudere gli sportelli dello strumento.
6
Spegnere il computer e lo strumento.
7
Lavare con acqua tiepida le siringhe, le camere del polimero e i serbatoi.
Risciacquare con acqua deionizzata.
Manutenzione dello strumento 5-17
Preparazione della
formammide
A
A
Deionizzazione e conservazione della formammide
Informazioni sulla La formammide viene utilizzata per denaturare i campioni di DNA prima di caricarli
formammide: agente sull'’analizzatore genetico ABI PRISM® 3100.
denaturante IMPORTANTE Una formammide di alta qualità è essenziale ai fini della riproducibilità dei dati.
Problemi associati
alla formammide
disponibile in
commercio
La formammide disponibile presso i fornitori commerciali è spesso contaminata con
quantità variabili di acqua e ioni organici e inorganici indesiderati. Inoltre, la
formammide è spesso fornita in flaconi di vetro che, una volta aperti la espongono
all’aria e le consentono di assorbire acqua.
L’acqua reagisce lentamente con la formammide dando luogo alla formazione di acido
formico (acido metanoico) e ammoniaca. I prodotti ionici di questa reazione causano
due problemi:
♦
competono significativamente con gli ioni di DNA di dimensioni maggiori per
l’iniezione nel capillare, generando segnali più deboli;
♦
reagiscono con il DNA, degradando il campione.
L’illustrazione seguente mostra l’effetto dei derivati ionici della formammide
sull’iniezione elettrocinetica.
Campioni preparati conformammide deionizzata di alta qualità
Campioni preparati con
formammide commerciale
Preparazione della formammide A-1
La formammide deionizzata contenente uno stabilizzante alcalino evita questi problemi.
Materiali necessari Per la procedura, procurarsi i seguenti materiali.
Materiale
Descrizione
Formammide
La formammide grezza (prima della deionizzazione) deve:
♦ essere pura al 99,5% o più, e avere un basso contenuto idrico
♦ essere confezionata sotto gas inerte
♦ avere una conduttività di circa 100 µsiemens/cm o meno
Nota I siemens, precedentemente denominati mho (1/ohm), sono
le unità di misura di conduttanza specifica o conduttività.
Resina a scambio
ionico
♦ Resina a letto misto contenente i seguenti forti gruppi funzionali
per lo scambio ionico.
+
R-SO3- (in forma H ) (catione)
-
R-CH2N+(CH3)3, (in forma OH ) (anione)
– Questi gruppi sono legati ad una matrice di
stirene-divinilbenzene con un cross linkage dell’8%.
♦ La capacità di idratazione minima è di 1,5 meq/ml con
dimensione del reticolo asciutto pari a 20–50 (AG501 X8, resina
a letto misto per applicazioni di biologia molecolare)
♦ Disponibile presso Bio-Rad Laboratories (P.N. 143-6424) o un
prodotto equivalente
Conduttivimetro
Un conduttivimetro commerciale, o misuratore di pH con cella
esterna per il rilevamento della conduttività, è sufficiente per
misurare la conduttività della formammide se dotato di costante di
cella pari a 1,0.
Na2EDTA
♦ Diidrato (Mr 372.2)
♦ Reagente ACS, puro al 99% o più
♦ Disponibile presso Sigma (P.N. E4884) o un prodotto equivalente
Contenitore per la
conservazione della
formammide
Usare un contenitore in polipropilene con tappo a vite
Nota I contenitori in vetro sono sconsigliati a causa della
potenziale contaminazione da minerali.
Resina a scambio La formammide grezza viene deionizzata mediante resine miste cationiche e
ionico anioniche allo scopo di rimuovere impurità come ioni di ammonio e di formiato. La
deionizzazione avviene a bassa velocità di trasferimento di massa nella cinetica dello
scambio ionico di equilibrio grazie a:
♦
alterazioni fisiche della resina in presenza della formammide
♦
differenze
nelle -dimensioni molecolari e nella selettività tra gli ioni delle impurità e
+
gli ioni H e OH
Quindi, la conduttività della formammide va monitorata nel tempo per determinare il
grado di deionizzazione da parte della resina.
A-2 Preparazione della formammide
Calibrazione del Per misurare l’efficacia del processo di deionizzazione, sono necessari un misuratore
conduttivimetro e una cella di conduttività. Quanto più la formammide è deionizzata, tanto più bassa è
la conduttività.
Il conduttivimetro deve essere preventivamente calibrato (entro il range di misurazione
a 10 µsiemens/cm o meno). Calibrare il conduttivimetro utilizzando soluzioni di cloruro
di potassio standard in base al National Institute of Standards and Technology (NIST).
Poiché la temperatura influisce sulla conduttività, i campioni vanno portati a
temperatura ambiente prima di misurarne la conduttività.
Preparazione L’EDTA alcalino (acido etilendiamminotetracetico) viene aggiunto alla formammide
dell’EDTA deionizzata per stabilizzarla e per agevolare l’iniezione elettrocinetica del DNA. Per
ridurre al minimo la quantità di acqua aggiunta alla formammide, utilizzare una
soluzione concentrata a 200-mM di EDTA.
Per preparare la soluzione di 200-mM di EDTA, procedere come segue.
Passa
Procedura
1
Aggiungere 7,44 g di Na2EDTA a 70 ml di acqua deionizzata e mescolare.
2
Mentre si mescola, regolare lentamente il pH tra 8,0 e 8,8 dispensando delle gocce
di soluzione concentrata di idrossido di sodio.
Nota Questo agevola lo scioglimento dell’EDTA nel tempo, poiché l’EDTA ha una
solubilità limitata fino a quando non viene aumentato il pH.
3
Diluire a 100 ml con acqua deionizzata.
4
Conservare a 4 °C.
Preparazione della ! AVVERTENZA SOSTANZE CHIMICHE PERICOLOSE. La formammide è nociva se
formammide assorbita attraverso la cute e può irritare gli occhi, la pelle e le vie respiratorie. Può danneggiare
il sistema nervoso centrale, i sistemi riproduttivi maschile e femminile, ed costituisce un
potenziale rischio per difetti congeniti. Leggere le MSDS e attenersi rigorosamente alle
istruzioni relative alla manipolazione di questa sostanza. Indossare adeguata protezione
oculare, indumenti e guanti di protezione.
Per purificare e misurare la conduttività, procedere come segue.
Passa
Procedura
1
Calibrare la cella del conduttivimetro e sciacquarla con acqua distillata.
2
In un contenitore in polipropilene con tappo a vite, lavare 10 g di resina a scambio
ionico Bio-Rad AG501 X8 agitando per 1 minuto il campione con 10–20 ml di
formammide.
3
Lasciare decantare o filtrare attraverso un filtro rado in nylon o teflon, quindi
eliminare la formammide.
4
Ripetere gli step 2 e 3 due volte.
5
Aggiungere 100 ml di formammide alla resina lavata.
6
Chiudere il contenitore della miscela in modo ermetico.
7
Mescolare rapidamente la miscela con un agitatore magnetico o elettrico,
verificando che la resina sia in sospensione. Mescolare a temperatura ambiente
per circa 2 ore.
8
Prelevare una piccola aliquota della miscela e misurarne la conduttività a
temperatura ambiente.
Preparazione della formammide A-3
Per purificare e misurare la conduttività, procedere come segue.
Passa
9
(Continua)
Procedura
Risciacquare la cella di conduttività con acqua distillata.
10
Se la conduttività è…
Allora…
>5 µsiemens/cm
Tornare allo step 7 e mescolare per altri
30 minuti.
<5 µsiemens/cm
Passare alla sezione “Per completare la
purificazione della formammide deionizzata,
procedere come segue.” qui di seguito.
Nota Se la conduttività non è <5 µsiemens/cm dopo circa 4,5 ore di miscelazione,
ripetere l’intera procedura usando un nuovo lotto di formammide e della nuova
resina.
Nota Partendo da una formammide di maggiore purezza e minore conduttività si
ottiene una deionizzazione più efficace.
Per completare la purificazione della formammide deionizzata, procedere come segue.
Passa
Procedura
1
Filtrare sotto vuoto la formammide deionizzata usando un filtro in nylon o teflon da
0,2 o 0,4 µm.
2
Misurare il volume finale della formammide deionizzata.
3
Aggiungere il volume richiesto di 200-mM di EDTA alla formammide deionizzata
per ottenere una concentrazione finale di circa 0,3-mM di EDTA.
Nota Dopo l’aggiunta dell’EDTA, la conduttività finale della formulazione
aumenta a circa 30 µsiemens/cm. Per calcolare il volume di EDTA da aggiungere,
usare l’equazione riportata qui sotto.
VEDTA (µl) = 1,5 V Form(ml)
Dove:
VEDTA(µL) =
volume di EDTA da aggiungere (in microlitri)
VFORM(ml)= volume misurato di formammide (in millilitri)
Calcolo dimostrativo con un volume finale pari a 90-ml di formammide:
VEDTA(µl) = 1,5 ↔ 90 = 135 µl
4
Suddividere immediatamente la formammide in aliquote in piccole provette di
polipropiletilene e conservarle a una temperatura compresa tra -15 e -20 °C per un
massimo di 6 mesi.
Uso della Immediatamente prima dell’uso, scongelare e utilizzare l’intero contenuto di una
formammide provetta prima di aprire ed esporre all'aria un’altra provetta. Durante il giorno, nei
periodi di inutilizzo, conservare la provetta a 4 °C. Altrimenti ricongelarla.
A-4 Preparazione della formammide
Indice analitico
A
assistenza clienti. Vedere assistenza tecnica 1-3
assistenza tecnica 1-3 a 1-7
indirizzo di posta elettronica 1-3
indirizzo Internet 1-6
telefono/fax (in tutti gli altri Paesi) 1-4
telefono/fax (Nord America) 1-3
uffici regionali di vendita 1-4 a 1-5
assistenza. Vedere assistenza tecnica 1-3
autocampionatore
posizionamento delle piastre 2-16
posizioni dei serbatoi 2-14
autoestrazione, non riuscita 2-27
avvertenza relativa al laser 1-13
avvertenze relative al pericolo di folgorazione 1-13
avvio del software GeneScan Analysis 3-6
B
bolle d’aria, rimozione dalla camera superiore del
polimero 5-4
C
calibrazione spaziale, trattazione 4-2 a 4-5
calibrazione spettrale, trattazione 4-6 a 4-13
camera superiore del polimero, rimozione delle bolle
d’aria 5-4
camere del polimero
pulizia 5-11
rimozione dallo strumento 5-10
rimozione delle bolle d’aria 5-4
campo BioLIMS Project (nel record della piastra) 2-19
capillare giallo nella finestra Array View 4-11
cella del rivelatore, pulizia 5-13
collegamento di una piastra 2-23
comando Display Run Data 3-2
comando Fill Down 2-19
computer
controllo dello spazio libero nel database 5-7
controllo dello spazio libero sul disco fisso 5-6
corsa
avvio 2-26
monitoraggio 2-26
salto, pausa, arresto 2-27
creazione di progetti nel software GeneScan Analysis 3-6
D
dati
analisi o rianalisi 3-12
estrazione 2-27
visualizzazione dei dati analizzati 3-5
visualizzazione del dati grezzi 3-2
dati grezzi (colore), visualizzazione nel software Data
Collection 3-2 a 3-3
denaturazione dei campioni 2-4
documenti su richiesta 1-6
E
EDTA, preparazione A-3
F
file dei campioni
formato predefinito di denominazione 2-19
numero massimo di caratteri 2-19
visualizzazione 3-6
visualizzazione nel software GeneScan Analysis 3-9 a
3-11
file del size standard (.szs), selezione 3-12
finestra di dialogo Analysis Parameters 3-13
finestra Results Control (software GeneScan Analysis) 3-9
a 3-11
formammide
deionizzazione e conservazione A-1 a A-4
preparazione dei campioni 2-3
formammide Hi-Di 2-3
formato di denominazione per i file dei campioni 2-19
G
gruppo piastra, posizionamento
sull’autocampionatore 2-16
I
identificazione di un picco (software GeneScan
Analysis) 3-9
indirizzo Web
Applied Biosystems 1-6
documenti su richiesta 1-6
L
Linkage Mapping Set, rapporto tra fluorocromi 2-3
M
manuali, set 3100 1-2
manutenzione, trattazione 5-2 a 5-17
modulo di analisi
selezione 2-21
visualizzazione e modifica 2-30
modulo di corsa
selezione 2-20
visualizzazione, modifica e creazione 2-28
MSDS, ordinazione 1-10
O
OrbixWeb, avvio 2-5
Indice analitico-1
P
T
pagina Array View 3-3
pannelli di dati, visualizzazione 3-10
part number (P.N.)
manuali 1-2
parti di ricambio e materiali consumabili. Vedere
manuale d’uso 3100
polimero, aggiunta o sostituzione 5-12
posta elettronica, indirizzo dell’assistenza tecnica 1-3
preferenze 2-7
preferenze del software 2-7
preparazione dei campioni 2-3
pulsante Dati non analizzati (software GeneScan
Analysis) 3-8
pulsante Informazioni file campione (software GeneScan
Analysis) 3-8
pulsante Pause 2-27
pulsante Risultati del campione (software GeneScan
Analysis) 3-8
pulsante Skip to Next Run 2-27
pulsante Stop 2-27
R
rapporto tra fluorocromi 2-3
record della piastra
collegamento di una piastra 2-23
creazione 2-17 a 2-22
creazione per la calibrazione spettrale 4-9
rianalisi dei dati. Vedere analisi e rianalisi dei dati
S
scheda Plate View 2-17, 2-23
finestra di dialogo "Select the run to display"
serbatoi
posizioni sull’autocampionatore 2-14
riempimento 2-12 a 2-15
serbatoi dell’acqua e del tampone catodico,
riempimento 2-12 a 2-15
set di capillari, installazione, rimozione,
conservazione 5-13 a 5-16
set di fluorocromi
selezione 2-20
sicurezza
manuale 1-2
trattazione 1-8 a 1-13
sicurezza delle scorie 1-9
sicurezza delle sostanze chimiche 1-8
siringhe, trattazione 5-8
software Data Collection, avvio 2-5
software GeneScan Analysis 3-12 a 3-14
avvio 2-30
spazio libero sul disco fisso, controllo 5-6
standard matrice, preparazione 4-6
strumento
arresto 5-17
utilizzo 2-26
Indice analitico-2
3-2
tampone di corsa 1X, preparazione per una singola
corsa 2-13
tampone, preparazione per una singola corsa 2-13
V
visualizzazione
dati grezzi (colore) nel software Data Collection
3-2 a 3-3
file dei campioni nel software GeneScan Analysis
3-9 a 3-11
volume di campione richiesto per una corsa 2-3
volumi di campione richiesti per una corsa 2-3
volumi di caricamento. Vedere volumi di campione
Sede centrale
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404 USA
Telefono: +1 650.638.5800
Linea verde U.S.A.: +1 800.345.5224
Fax: +1 650.638.5884
Uffici di vendita nel mondo
La vasta rete di distribuzione ed assistenza della
Applied Biosystems raggiunge 150 Paesi in sei
continenti e si avvale di personale di supporto e
applicativo altamente qualificato. Per le
ubicazioni degli uffici internazionali, rivolgersi alla
sede centrale o visitare il sito Web
www.appliedbiosystems.com.
www.appliedbiosystems.com
Applera Corporation si impegna a mettere a
disposizione dei ricercatori di life science le
tecnologie e le informazioni più avanzate.
Applera Corporation comprende le ditte Applied
Biosystems e Celera Genomics.
Stampato negli Stati Uniti, 02/2001
an Applera business