Diapositiva 1

•La carenza idrica è probabilmente il più importante
stress abiotico che limita la crescita della pianta e la
sua produttività.
Dovuto a:
• Condizioni saline eccessive dei terreni agricoli
(globalmente, circa il 22%, FAO, 2004)
• Riduzione della disponibilità d’acqua per l’irrigazione
• Cambiamenti climatici globali dovuti
-all’aumento della temperatura
-modifica delle modalità delle precipitazioni
• Aumento della scarsità d’acqua nelle zone aride e semiaride
Meccanismi di resistenza
Evitamento e tolleranza alla disidradazione
Evitamento: capacità della pianta di mantenere un adeguato
stato idrico in un suolo con deficit idrico (es. Modifica della
conduttanza stomatica, modifica area fogliare).
Tolleranza: capacità della pianta di rimanere in vita e crescere
dopo un ciclo di disidradazione-idradazione (es.
aggiustamento osmotico)
Water Use Efficiency (WUE): rapporto tra la biomassa
totale (o produttività della granella) e l’acqua utilizzata
durante la crescita della pianta
Queste caratteristiche sono sotto il controllo di
caratteri complessi (QTL, Quantitative Trait Loci)
Possono contenere:
• proteine con una specifica funzione
• fattori di trascrizione
• fattori di segnalazione
Incremento della
tolleranza alla siccità
mediante l’uso di
proteine con una
specifica funzione
Incremento della
tolleranza alla siccità
mediante l’uso di
fattori di trascrizione
Incremento della tolleranza alla siccità mediante l’uso di fattori di segnalazione
Membrana
plasmatica
Stress idrico
Percezione
dello stress
geni
Parete cellulare
1. Percezione del segnale
Fattori di Trascrizione
2. Trasduzione del segnale (es. proteine kinasi)
3. Attivazione genica (fattori di trascrizione, geni)
CDPK
MAPKKK
Gene specifico
Incremento della tolleranza alla siccità
mediante l’uso di proteine con una
specifica funzione:
•uso del gene MtlD di E. coli che
codifica per la mannitolo-1-fosfato
deidrogenasi
Plant Physiology, April 2003, Vol. 131, pp. 1748–1755
Mannitolo è normalmente sintetizzato in numerose piante
ma non in frumento
MtlD (da E. coli) codifica per la mannitolo-1-fosfato
deidrogenasi che catalizza la conversione reversibile del
Fru-6-fosfato a Mannitolo-1-fosfato.
Nelle piante transgeniche il Mannitolo-1-fosfato è
convertito a mannitolo attraverso fosfatasi non
specifiche.
Costrutti genici (plasmidi) usati per la
trasformazione
Fig. 1. Plasmids used for wheat transformation. Plasmid pAHC20 contains only
the selectable marker bar. Plasmid pTA2 contains bar and the E. coli mtlD gene
for biosynthesis of mannitol-1-phosphate. Both genes were under the control of
the maize (Zea mays) ubi-1 promoter. Calli and plants transformed with pTA2
were used as mannitol-accumulating lines (+mtlD), and those transformed with
pAHC20 served as negative controls (−mtlD).
Incremento di tolleranza allo stress idrico a livello
cellulare: calli di frumento transgenico e di controllo
Figure 2
Effect of osmotic stress on the growth of transgenic wheat calli. The mannitolaccumulating callus line C2-20 (+mtlD) and the nonaccumulating line C1-11
(−mtlD) were grown in Murashige and Skoog medium containing PEG 8,000 (−1.0
MPa) or 100 mm NaCl for 60 d.
Incremento di tolleranza allo stress idrico a livello
cellulare: calli di frumento transgenico e di controllo
Misura del peso fresco
Contenuto in zuccheri solubili e mannitolo
in calli e pianta
Potenziale idrico (Yw) e Potenziale dei soluti (Ys)
Caratteristiche fenotipiche in condizioni di
stress idrico
Figure 3
Effect of water stress and salinity on the growth of +mtlD and −mtlD plants. The mannitol-accumulating
transgenic wheat line P2-19-1 (+mtlD) and the nonaccumulating P1-13-1 (−mtlD) were stressed by withholding
water (A) or by supplementing the nutrient solution with 150 mm NaCl (B) for 30 d. Pictures were taken 30 d
after the imposition of water stress and 20 d after NaCl stress. In the absence of stress, −mtlD and +mtlD
plants were similar in size; thus, for unstressed controls, only the −mtlD plants are shown.
Caratteristiche fenotipiche in condizioni di
stress salino
Figure 3
Effect of water stress and salinity on the growth of +mtlD and −mtlD plants. The mannitol-accumulating
transgenic wheat line P2-19-1 (+mtlD) and the nonaccumulating P1-13-1 (−mtlD) were stressed by withholding
water (A) or by supplementing the nutrient solution with 150 mm NaCl (B) for 30 d. Pictures were taken 30 d
after the imposition of water stress and 20 d after NaCl stress. In the absence of stress, −mtlD and +mtlD
plants were similar in size; thus, for unstressed controls, only the −mtlD plants are shown.
Variabilità del fenotipo delle piante transgeniche che
accumulano mannitolo
Figure 4
Phenotypes observed in transgenic wheat plants. Lines P2-16-1 and P2-19-1 were transformed with plasmid
pTA2 for accumulation of mannitol in the cytosol (+mtlD). Line P1-13-1 was transformed with pAHC20 (−mtlD)
and did not accumulate mannitol. Most +mtlD plants were short and sterile and had twisted leaves and heads
similar to P2-16-1. In addition, the sterile plants had high mannitol (more than 1.5 μmol g−1 fresh weight) and
low Suc content (less than 2 μmol g−1 fresh weight). In the fertile +mtlD plants, mannitol content ranged from
0.4 to 0.7 μmol g−1 fresh weight.
Conclusioni
Manipolazioni genetiche che utilizzano fattori di
trascrizione che controllano numerosi geni coinvolti
nella risposta allo stress
Fattori di trascrizione DREB (Dehydration-responsive
element binding transcription factors) che si legano agli
elementi di risposta alla disidradazione (Dehydrationresponsive element, DRE)
DREB1A migliora la WUE nella pianta di arachide,
principalmente grazie ad una ampia modifica del rapporto
radice/germoglio in condizione di stress idrico (Vadez et
al., 2007).
Pellegrineschi et al. (2004) hanno usato il DREB1A di
Arabidopsis thaliana sotto il controllo di un promotore
inducibile da stress, del gene rd29A, per produrre piante
transgeniche di frumento.
Diversi geni indotti da stress, tra cui il gene rd29A di A.
thaliana, sono indotti dalla siccità attraverso la via ABAindependente (Chak et al. 2000).
I fattori di trascrizione DREB (es. DREB1 e DREB2) si
legano a promotori (DRE) come quello del gene rd29A,
quindi inducono l’espressione in risposta alla siccità, salinità
e freddo.
Genome 47: 493–500 (2004)
Costrutti
rd29A:DREB1A
1)
2)
Metodo
PDS-100 He biolistic bombardment
Tessuto
Immature embryos of Triticum aestivum cv Bobwhite26
Fig. 2. RT–PCR analysis of DREB1A gene expression in control and transgenic plants before and after water
stress. Lane 1, lambda molecular mass ladder; lanes 2–13, RNA isolated from plants grown under nonstress
conditions; lanes 14–25, RNA isolated from plants after 2 days of stress; lane 26, PCR amplification of the
plasmid used in the transformation; lane 28, PhiX174/HaeIII molecular mass ladder.
Fig. 3. (A) Phenotype of the
DREB1A line containing event
8424 (left) and control plants
(right) after 15 days of water
stress and one
watering (8 h). (B) Root
phenotype of event 8424 (left)
and control (right).
Conclusioni
In esperimenti condotti in serra in condizioni controllate le
piante transgeniche hanno mostrato un ritardo nei sintomi
di avvizzimento rispetto al controllo, a 10 giorni dopo
l’ultima innaffiatura.
I risultati ottenuti in condizioni controllate non
sempre si riproducono in condizioni di campo
Utilizzate 14 linee transgeniche di frumento selezionate
per la sopravvivenza in condizioni di forte siccità (9 linee
SL, valutate in serra in condizioni controllate) e elevato
WUE (5 linee, valutate in campo).
SL: Sopravvivenza delle piante per ogni evento di
trasformazione è stato registrato come il numero di piante che
recuperano la crescita dopo lo stress sul numero totale di
piante esposte allo stress
Le 14 linee selezionate sono state valutate rispetto al controllo
per WU, WUE in condizioni di irrigazione o deficit idrico
Le 14 linee selezionate sono state valutate rispetto al controllo per la
biomassa (BMA) e la produttività (YLD) in differenti condizioni di irrigazione
in campo
Conclusioni
•Dagli esperimenti in serra si conferma che DREB1A di
Arabidopsis sotto il controllo del promotore rd29A stressinducibile, aumenta il tasso di sopravvivenza delle piante
transgeniche in condizioni di stress idrico senza ritardo
della crescita.
•Tuttavia, gli esperimenti in campo dimostrano che ciò non
comporta un aumento della resa di granella in condizioni di
irrigazione o di stress idrico
Dal punto di vista della manipolazione Biotech……
Il sistema DRE-DREB è stato utilizzato anche per
amplificare il segnale di risposta allo stress da
siccità
DREB genes, which are induced by cold and water stress, encode transcription factors that bind to the DRE
promoter element of stress related genes, and turn on their expression. Shinozaki and coworkers have
amplified this signaling pathway by overexpressing a fusion of a DRE-containing promoter with a DREB
gene. This induced further DREB1A expression in response to stress1, which led to strong induction of DREcontaining target genes. The early steps of this signaling pathway are poorly understood, but genetic
analysis of Arabidopsis mutants suggest that HOS1 functions as a negative regulator9 of stress-related
genes. Nicholas Smirnoff & John A. Bryant, Nature Biotechnology 17, 229 - 230 (1999)
Risultati più promettenti derivano da esperimenti della
Monsanto
PNAS 2007 vol. 104 no. 42: 16450–16455
In questi esperimenti è stato usato, in Arabidopsis,
il fattore di trascrizione AtNF-YB1
.
•Questi fattori si legano alla CCAAT-box come eterotrimeri
Struttura dei geni che codificano
per le tre subunità NF-Y
Nelle piante esistono diversi geni
che codificano per ciascuna
subunità NF-Y
Il trascritto AtNF-YB1 è indotto in condizioni di
stress severo
Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455
©2007 by National Academy of Sciences
L’espressione costitutiva di AtNF-YB1 conferisce
tolleranza alla siccità in Arabidopsis
©2007 by National Academy of Sciences
Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455
Arabidopsis transgenic lines have improved drought
physiology
©2007 by National Academy of Sciences
Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455
HEATMAP: Agglomerative cluster of all genes (minus hybridization controls) that are
differentially expressed in the seedling profiles from 35S::CBF4 plants or 35S::AtNF-YB1 (vs.
wild-type) plants, as well as the regulation of those genes at 4 h after treatment with ...
Questo risultato indica che AtNF-YB1 induce geni che non vengono
indotti da ABA e il fattore di trascrizione CBF4 (che si lega ad
elementi-cis DRE)
Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455
©2007 by National Academy of Sciences
Sulla base di questi risultati si è proceduto con
questo approccio a modificare una pianta coltivata
• Isolamento in mais dell’ortologo ZmNF-YB2
Trasformazione in mais
ZmNF-YB2
Enhanced 35S
nptII
(Resistenza alla canamicina)
NOS
Piante transgeniche di mais cresciute in condizioni
controllate in serra o in campo hanno un chiaro aspetto
fenotipico di tolleranza della siccità.
©2007 by National Academy of Sciences
Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455
Tre linee transgeniche di mais hanno dimostrato un miglioramento
della produttività nei 2 anni di esperimenti. I valori rappresentano la
percentuale di aumento rispetto al controllo. Nel primo anno (in
nero) lo stress fu molto maggiore del secondo anno (in grigio)
Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455
©2007 by National Academy of Sciences
Conclusioni
• AtNF-YB1 e ZmNF-YB2 sono coinvolti nello stress da siccità,
regolando un set di geni della famiglia CCAAT conservati nelle
mono- e dicotiledoni
• I meccanismi di tolleranza alla siccità attivati dall’espressione
costitutiva dei fattori NF-YB sono componenti della normale
risposta alla siccità (attivati costitutivamente nelle piante
transgeniche anzichè indotti come nella condizione normale)
• L’applicazione di questo approccio conferisce un vantaggio
produttivo al mais cresciuto in ambienti siccitosi (Miglioramento
della capacità fotosintetica e della produttività in granella).
• Questo approccio può essere migliorato con un più efficace
sistema di controllo dell’espressione genica per estendere la sua
applicazione anche in ambienti che subiscono stress idrici meno
severi.
L’approccio biotecnologico facilita la nostra capacità di
Identificare e valorizzare l’estesa diversità genetica
che esiste in natura per migliorare quelle funzioni
fisiologiche importanti per l'adattamento allo stress
ambientale.
Plant Physiology, June 2008, Vol. 147, pp. 446–455
I risultati riportati dimstrano che l’espressione di proteine
correlate con lo shock da freddo -“cold shock proteins”- (CSPs) ,
da Escherichia coli, il CspA, o da Bacillus subtilis, il CspB,
favoriscono l’adattamento allo stress in più specie di piante, incluso
il mais, senza causare effetti pleiotropici negativi in condizioni di
normale irrigazione.
In E. coli CspA agisce da RNA chaperone
Modello del trasferimento dell’entropia per il meccanismo
d’azione dell’ RNA “chaperone”. RNA “chaperone” in arancio.
Role of RNA chaperones in virus replication
Sonia Ziga , Isabel Sola , Jazmina L.G. Cruz , Luis Enjuanes
http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2008.06.015
Virus Research Volume 139, Issue 2 2009 253 - 266
• La funzione del chaperone CspA, come anche di altre
proteine CSP, si ritiene importante per stimolare la
crescita in condizioni di stress da acclimatazione e
durante periodi di elevata attività metabolica.
• In E. coli CspA agisce da RNA chaperone, che lega
l’RNA e quando necessario favorisce la conversione di
strutture a doppia elica in singola elica.
• E’ stato proposto un modello dove CspB coopera con
una DEAD box elicasi per recuperare molecole di
mRNA che hanno perso il corretto folding e rendere
disponibile il corretto codone di inizio della
traduzione.
La regolazione mediata da RNA chaperoni è presente in
tutti gli organismi .
Per esempio, AtCSP2 è associato con la transizione
fiorale e lo sviluppo del seme.
Osservazione: in mais la transizione fiorale e lo stadio di
sviluppo riproduttivo sono le fasi più sensibili allo stress
idrico per ciò che riguarda l’impatto sulla produttività
Sulla base della considerazione che i CSP sono coinvolti
nell’adattamento allo stress, nello sviluppo e nella
protezione delle strutture riproduttive, gli autori hanno
ritenuto utile esplorare la funzione dei CSP per
l’adattamento allo stress idrico in mais.
Transgenic Arabidopsis seedlings expressing CspA (B) or
CspB (D) demonstrate improved growth under constant
light conditions at 8°C for 6 weeks. At 25°C there was no
growth effect
CspA-negative control
CspB-negative control
Castiglioni P et al. Plantphysiol 2008;147:446-455
©2008 by American Society of Plant Biologists
CspA-positive transgenic
CspB-positive transgenic
Prove di produttività in condizioni di carenza idrica. Tre different ibridi
recanti un singolo evento transgenico esprimente CspB sono stati valutati in
prove di produttività nelle regioni aride del Midwest negli USA.
Castiglioni P et al. Plantphysiol 2008;147:446-455
©2008 by American Society of Plant Biologists
Conclusioni generali
1. E’ possibile migliorare la resistenza alla siccità
mediante l’uso di piante transgeniche
2. La possibilità di controllare l’attività di più geni
conivolti nella risposta allo stress rappresenta una
opzione migliore che non il controllo di un singolo gene
3. E’ importante valutare il “costo energetico” del
transgene e il suo effetto sulla produttività
4. E’ importante valutare le piante transgeniche in
condizioni di campo
5. La migliore conoscenze delle vie di regolazione potrà
consentire l’applicazione di strategie più efficaci