•La carenza idrica è probabilmente il più importante stress abiotico che limita la crescita della pianta e la sua produttività. Dovuto a: • Condizioni saline eccessive dei terreni agricoli (globalmente, circa il 22%, FAO, 2004) • Riduzione della disponibilità d’acqua per l’irrigazione • Cambiamenti climatici globali dovuti -all’aumento della temperatura -modifica delle modalità delle precipitazioni • Aumento della scarsità d’acqua nelle zone aride e semiaride Meccanismi di resistenza Evitamento e tolleranza alla disidradazione Evitamento: capacità della pianta di mantenere un adeguato stato idrico in un suolo con deficit idrico (es. Modifica della conduttanza stomatica, modifica area fogliare). Tolleranza: capacità della pianta di rimanere in vita e crescere dopo un ciclo di disidradazione-idradazione (es. aggiustamento osmotico) Water Use Efficiency (WUE): rapporto tra la biomassa totale (o produttività della granella) e l’acqua utilizzata durante la crescita della pianta Queste caratteristiche sono sotto il controllo di caratteri complessi (QTL, Quantitative Trait Loci) Possono contenere: • proteine con una specifica funzione • fattori di trascrizione • fattori di segnalazione Incremento della tolleranza alla siccità mediante l’uso di proteine con una specifica funzione Incremento della tolleranza alla siccità mediante l’uso di fattori di trascrizione Incremento della tolleranza alla siccità mediante l’uso di fattori di segnalazione Membrana plasmatica Stress idrico Percezione dello stress geni Parete cellulare 1. Percezione del segnale Fattori di Trascrizione 2. Trasduzione del segnale (es. proteine kinasi) 3. Attivazione genica (fattori di trascrizione, geni) CDPK MAPKKK Gene specifico Incremento della tolleranza alla siccità mediante l’uso di proteine con una specifica funzione: •uso del gene MtlD di E. coli che codifica per la mannitolo-1-fosfato deidrogenasi Plant Physiology, April 2003, Vol. 131, pp. 1748–1755 Mannitolo è normalmente sintetizzato in numerose piante ma non in frumento MtlD (da E. coli) codifica per la mannitolo-1-fosfato deidrogenasi che catalizza la conversione reversibile del Fru-6-fosfato a Mannitolo-1-fosfato. Nelle piante transgeniche il Mannitolo-1-fosfato è convertito a mannitolo attraverso fosfatasi non specifiche. Costrutti genici (plasmidi) usati per la trasformazione Fig. 1. Plasmids used for wheat transformation. Plasmid pAHC20 contains only the selectable marker bar. Plasmid pTA2 contains bar and the E. coli mtlD gene for biosynthesis of mannitol-1-phosphate. Both genes were under the control of the maize (Zea mays) ubi-1 promoter. Calli and plants transformed with pTA2 were used as mannitol-accumulating lines (+mtlD), and those transformed with pAHC20 served as negative controls (−mtlD). Incremento di tolleranza allo stress idrico a livello cellulare: calli di frumento transgenico e di controllo Figure 2 Effect of osmotic stress on the growth of transgenic wheat calli. The mannitolaccumulating callus line C2-20 (+mtlD) and the nonaccumulating line C1-11 (−mtlD) were grown in Murashige and Skoog medium containing PEG 8,000 (−1.0 MPa) or 100 mm NaCl for 60 d. Incremento di tolleranza allo stress idrico a livello cellulare: calli di frumento transgenico e di controllo Misura del peso fresco Contenuto in zuccheri solubili e mannitolo in calli e pianta Potenziale idrico (Yw) e Potenziale dei soluti (Ys) Caratteristiche fenotipiche in condizioni di stress idrico Figure 3 Effect of water stress and salinity on the growth of +mtlD and −mtlD plants. The mannitol-accumulating transgenic wheat line P2-19-1 (+mtlD) and the nonaccumulating P1-13-1 (−mtlD) were stressed by withholding water (A) or by supplementing the nutrient solution with 150 mm NaCl (B) for 30 d. Pictures were taken 30 d after the imposition of water stress and 20 d after NaCl stress. In the absence of stress, −mtlD and +mtlD plants were similar in size; thus, for unstressed controls, only the −mtlD plants are shown. Caratteristiche fenotipiche in condizioni di stress salino Figure 3 Effect of water stress and salinity on the growth of +mtlD and −mtlD plants. The mannitol-accumulating transgenic wheat line P2-19-1 (+mtlD) and the nonaccumulating P1-13-1 (−mtlD) were stressed by withholding water (A) or by supplementing the nutrient solution with 150 mm NaCl (B) for 30 d. Pictures were taken 30 d after the imposition of water stress and 20 d after NaCl stress. In the absence of stress, −mtlD and +mtlD plants were similar in size; thus, for unstressed controls, only the −mtlD plants are shown. Variabilità del fenotipo delle piante transgeniche che accumulano mannitolo Figure 4 Phenotypes observed in transgenic wheat plants. Lines P2-16-1 and P2-19-1 were transformed with plasmid pTA2 for accumulation of mannitol in the cytosol (+mtlD). Line P1-13-1 was transformed with pAHC20 (−mtlD) and did not accumulate mannitol. Most +mtlD plants were short and sterile and had twisted leaves and heads similar to P2-16-1. In addition, the sterile plants had high mannitol (more than 1.5 μmol g−1 fresh weight) and low Suc content (less than 2 μmol g−1 fresh weight). In the fertile +mtlD plants, mannitol content ranged from 0.4 to 0.7 μmol g−1 fresh weight. Conclusioni Manipolazioni genetiche che utilizzano fattori di trascrizione che controllano numerosi geni coinvolti nella risposta allo stress Fattori di trascrizione DREB (Dehydration-responsive element binding transcription factors) che si legano agli elementi di risposta alla disidradazione (Dehydrationresponsive element, DRE) DREB1A migliora la WUE nella pianta di arachide, principalmente grazie ad una ampia modifica del rapporto radice/germoglio in condizione di stress idrico (Vadez et al., 2007). Pellegrineschi et al. (2004) hanno usato il DREB1A di Arabidopsis thaliana sotto il controllo di un promotore inducibile da stress, del gene rd29A, per produrre piante transgeniche di frumento. Diversi geni indotti da stress, tra cui il gene rd29A di A. thaliana, sono indotti dalla siccità attraverso la via ABAindependente (Chak et al. 2000). I fattori di trascrizione DREB (es. DREB1 e DREB2) si legano a promotori (DRE) come quello del gene rd29A, quindi inducono l’espressione in risposta alla siccità, salinità e freddo. Genome 47: 493–500 (2004) Costrutti rd29A:DREB1A 1) 2) Metodo PDS-100 He biolistic bombardment Tessuto Immature embryos of Triticum aestivum cv Bobwhite26 Fig. 2. RT–PCR analysis of DREB1A gene expression in control and transgenic plants before and after water stress. Lane 1, lambda molecular mass ladder; lanes 2–13, RNA isolated from plants grown under nonstress conditions; lanes 14–25, RNA isolated from plants after 2 days of stress; lane 26, PCR amplification of the plasmid used in the transformation; lane 28, PhiX174/HaeIII molecular mass ladder. Fig. 3. (A) Phenotype of the DREB1A line containing event 8424 (left) and control plants (right) after 15 days of water stress and one watering (8 h). (B) Root phenotype of event 8424 (left) and control (right). Conclusioni In esperimenti condotti in serra in condizioni controllate le piante transgeniche hanno mostrato un ritardo nei sintomi di avvizzimento rispetto al controllo, a 10 giorni dopo l’ultima innaffiatura. I risultati ottenuti in condizioni controllate non sempre si riproducono in condizioni di campo Utilizzate 14 linee transgeniche di frumento selezionate per la sopravvivenza in condizioni di forte siccità (9 linee SL, valutate in serra in condizioni controllate) e elevato WUE (5 linee, valutate in campo). SL: Sopravvivenza delle piante per ogni evento di trasformazione è stato registrato come il numero di piante che recuperano la crescita dopo lo stress sul numero totale di piante esposte allo stress Le 14 linee selezionate sono state valutate rispetto al controllo per WU, WUE in condizioni di irrigazione o deficit idrico Le 14 linee selezionate sono state valutate rispetto al controllo per la biomassa (BMA) e la produttività (YLD) in differenti condizioni di irrigazione in campo Conclusioni •Dagli esperimenti in serra si conferma che DREB1A di Arabidopsis sotto il controllo del promotore rd29A stressinducibile, aumenta il tasso di sopravvivenza delle piante transgeniche in condizioni di stress idrico senza ritardo della crescita. •Tuttavia, gli esperimenti in campo dimostrano che ciò non comporta un aumento della resa di granella in condizioni di irrigazione o di stress idrico Dal punto di vista della manipolazione Biotech…… Il sistema DRE-DREB è stato utilizzato anche per amplificare il segnale di risposta allo stress da siccità DREB genes, which are induced by cold and water stress, encode transcription factors that bind to the DRE promoter element of stress related genes, and turn on their expression. Shinozaki and coworkers have amplified this signaling pathway by overexpressing a fusion of a DRE-containing promoter with a DREB gene. This induced further DREB1A expression in response to stress1, which led to strong induction of DREcontaining target genes. The early steps of this signaling pathway are poorly understood, but genetic analysis of Arabidopsis mutants suggest that HOS1 functions as a negative regulator9 of stress-related genes. Nicholas Smirnoff & John A. Bryant, Nature Biotechnology 17, 229 - 230 (1999) Risultati più promettenti derivano da esperimenti della Monsanto PNAS 2007 vol. 104 no. 42: 16450–16455 In questi esperimenti è stato usato, in Arabidopsis, il fattore di trascrizione AtNF-YB1 . •Questi fattori si legano alla CCAAT-box come eterotrimeri Struttura dei geni che codificano per le tre subunità NF-Y Nelle piante esistono diversi geni che codificano per ciascuna subunità NF-Y Il trascritto AtNF-YB1 è indotto in condizioni di stress severo Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455 ©2007 by National Academy of Sciences L’espressione costitutiva di AtNF-YB1 conferisce tolleranza alla siccità in Arabidopsis ©2007 by National Academy of Sciences Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455 Arabidopsis transgenic lines have improved drought physiology ©2007 by National Academy of Sciences Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455 HEATMAP: Agglomerative cluster of all genes (minus hybridization controls) that are differentially expressed in the seedling profiles from 35S::CBF4 plants or 35S::AtNF-YB1 (vs. wild-type) plants, as well as the regulation of those genes at 4 h after treatment with ... Questo risultato indica che AtNF-YB1 induce geni che non vengono indotti da ABA e il fattore di trascrizione CBF4 (che si lega ad elementi-cis DRE) Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455 ©2007 by National Academy of Sciences Sulla base di questi risultati si è proceduto con questo approccio a modificare una pianta coltivata • Isolamento in mais dell’ortologo ZmNF-YB2 Trasformazione in mais ZmNF-YB2 Enhanced 35S nptII (Resistenza alla canamicina) NOS Piante transgeniche di mais cresciute in condizioni controllate in serra o in campo hanno un chiaro aspetto fenotipico di tolleranza della siccità. ©2007 by National Academy of Sciences Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455 Tre linee transgeniche di mais hanno dimostrato un miglioramento della produttività nei 2 anni di esperimenti. I valori rappresentano la percentuale di aumento rispetto al controllo. Nel primo anno (in nero) lo stress fu molto maggiore del secondo anno (in grigio) Nelson D E et al. PNAS 2007;104:16450-16455 ©2007 by National Academy of Sciences Conclusioni • AtNF-YB1 e ZmNF-YB2 sono coinvolti nello stress da siccità, regolando un set di geni della famiglia CCAAT conservati nelle mono- e dicotiledoni • I meccanismi di tolleranza alla siccità attivati dall’espressione costitutiva dei fattori NF-YB sono componenti della normale risposta alla siccità (attivati costitutivamente nelle piante transgeniche anzichè indotti come nella condizione normale) • L’applicazione di questo approccio conferisce un vantaggio produttivo al mais cresciuto in ambienti siccitosi (Miglioramento della capacità fotosintetica e della produttività in granella). • Questo approccio può essere migliorato con un più efficace sistema di controllo dell’espressione genica per estendere la sua applicazione anche in ambienti che subiscono stress idrici meno severi. L’approccio biotecnologico facilita la nostra capacità di Identificare e valorizzare l’estesa diversità genetica che esiste in natura per migliorare quelle funzioni fisiologiche importanti per l'adattamento allo stress ambientale. Plant Physiology, June 2008, Vol. 147, pp. 446–455 I risultati riportati dimstrano che l’espressione di proteine correlate con lo shock da freddo -“cold shock proteins”- (CSPs) , da Escherichia coli, il CspA, o da Bacillus subtilis, il CspB, favoriscono l’adattamento allo stress in più specie di piante, incluso il mais, senza causare effetti pleiotropici negativi in condizioni di normale irrigazione. In E. coli CspA agisce da RNA chaperone Modello del trasferimento dell’entropia per il meccanismo d’azione dell’ RNA “chaperone”. RNA “chaperone” in arancio. Role of RNA chaperones in virus replication Sonia Ziga , Isabel Sola , Jazmina L.G. Cruz , Luis Enjuanes http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2008.06.015 Virus Research Volume 139, Issue 2 2009 253 - 266 • La funzione del chaperone CspA, come anche di altre proteine CSP, si ritiene importante per stimolare la crescita in condizioni di stress da acclimatazione e durante periodi di elevata attività metabolica. • In E. coli CspA agisce da RNA chaperone, che lega l’RNA e quando necessario favorisce la conversione di strutture a doppia elica in singola elica. • E’ stato proposto un modello dove CspB coopera con una DEAD box elicasi per recuperare molecole di mRNA che hanno perso il corretto folding e rendere disponibile il corretto codone di inizio della traduzione. La regolazione mediata da RNA chaperoni è presente in tutti gli organismi . Per esempio, AtCSP2 è associato con la transizione fiorale e lo sviluppo del seme. Osservazione: in mais la transizione fiorale e lo stadio di sviluppo riproduttivo sono le fasi più sensibili allo stress idrico per ciò che riguarda l’impatto sulla produttività Sulla base della considerazione che i CSP sono coinvolti nell’adattamento allo stress, nello sviluppo e nella protezione delle strutture riproduttive, gli autori hanno ritenuto utile esplorare la funzione dei CSP per l’adattamento allo stress idrico in mais. Transgenic Arabidopsis seedlings expressing CspA (B) or CspB (D) demonstrate improved growth under constant light conditions at 8°C for 6 weeks. At 25°C there was no growth effect CspA-negative control CspB-negative control Castiglioni P et al. Plantphysiol 2008;147:446-455 ©2008 by American Society of Plant Biologists CspA-positive transgenic CspB-positive transgenic Prove di produttività in condizioni di carenza idrica. Tre different ibridi recanti un singolo evento transgenico esprimente CspB sono stati valutati in prove di produttività nelle regioni aride del Midwest negli USA. Castiglioni P et al. Plantphysiol 2008;147:446-455 ©2008 by American Society of Plant Biologists Conclusioni generali 1. E’ possibile migliorare la resistenza alla siccità mediante l’uso di piante transgeniche 2. La possibilità di controllare l’attività di più geni conivolti nella risposta allo stress rappresenta una opzione migliore che non il controllo di un singolo gene 3. E’ importante valutare il “costo energetico” del transgene e il suo effetto sulla produttività 4. E’ importante valutare le piante transgeniche in condizioni di campo 5. La migliore conoscenze delle vie di regolazione potrà consentire l’applicazione di strategie più efficaci