28 - Museo naturalistico degli Alburni

Baculovirus: il "vaiolo" degli insetti!. Uso commerciale delle malattie degli insetti.
ARTICOLO DIDATTICO-DIVULGATIVO
Salvatore Vicidomini - Progetto Co.Al.Ta./2: C.R.A. - I.S.T. sede di Scafati, via
Vitiello 108 - 84018 Scafati (SA); [email protected].
Riassunto
In questo contributo didattico si delineano le caratteristiche generali dei
Baculoviridae una famiglia di virus che causa mortali malattie negli insetti, particolarmente i
Lepidotteri.
Abstract
In this didactic contribute are outlined the main traits of Baculoviridae, a virus
family that cause mortal diseases in insects, particularly in Lepidoptera species.
Cenni generali
Tra tutti i virus noti, i baculovirus (Baculoviridae) sono gli unici ad avere
effettivamente un importantissimo ruolo positivo per l'uomo, causando gravi malattie a
numerose specie di insetti economicamente dannose a diverse colture alimentari e non;
recentemente comunque sono stati individuati baculovirus causanti gravi malattie anche in
insetti utili e pertanto l'impatto sulle attività umane si è leggermente ribilanciato. Sono
diffusi in tutti gli ambienti frequentati dai loro ospiti e sono numerosissimi sia nell'aria come
sospeso che nel terreno o sulle strutture esterne delle piante. Sono pertanto particolarmente
idonei a resistere fuori dai loro ospiti ed infettano solo specie del phylum Arthropoda.
Il primo baculovirus descritto fu l'agente eziologico che causava la malattia del baco
da seta e fu descritto proprio da un italiano Marco Vida di Cremona, il quale in una sua
opera descrisse l'imputridimento ed il disfacimento corporeo cui era soggetto il baco da seta
durante gli ultimi stadi infettivi della malattia. Ovviamente non passò inosservata la spiccata
specificità verso insetti e particolarmente bruchi e nel 1975 si giunse alla prima
formulazione commerciale a base di particelle virali di baculovirus, col nome commerciale
Elcar, anche se ci vollero diversi anni per ottenere una buona efficacia di campo di tali
preparati.
I baculoviridae rappresentano una cospicua famiglia di virus "occlusi" suddivisibili
in due gruppi o generi distinti per morfologia ed ezio-patogenesi, ma tutti definiti da genoma
a DNA doppia elica. NPV o virus della nucleo-poliedrosi producono particelle virali di
grandi dimensioni, a forma di poliedro e contenenti numerose copie del genoma virale o
virioni; GV o virus della granulosi, invece sono sferoidali, infestano solo le larve di
Lepidotteri, sono molto più piccoli dei precedenti ed hanno una copia virionica per
particella. Il ciclo infettivo dei baculovirus prevede due differenti forme o stadi di particelle
virali. Il virus occluso è in pratica una particella virale protetta da una capsula proteica
formata fondamentalmente da poliedrina nei NPV e granulina nei GV; il budded-virus
invece non è incapsulato. La colonizzazione dell'ospite avviene tramite ingestione dei virus
occlusi (ma vedi oltre per altri meccanismi) i cui involucri vengono dissolti dall'ambiente
alcalino dell'ospite liberando i virioni. A questo punto verranno prodotti i budded-virus che
hanno la funzione di diffondersi a vari organi interni amplificando notevolmente l'infezione
all'interno dell'ospite e portandolo in breve alla morte per disfacimento interno. La forma
occlusa pertanto è quella che garantisce al virus di essere conservato anche fori dal corpo
dell'ospite (ambiente esterno) e di infettare il canale alimentare di questo tramite la sua
ingestione; invece il budded-virus ha la funzione di invadere il corpo dell'ospite,
moltiplicarsi e portarlo al disfacimento.
Il Naturalista Campano, [ISSN 1827-7160] http://www.museonaturalistico.it/, 2006, n.28, 1-5 pp.
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Struttura
Il genoma dei Baculoviridae è abbastanza cospicuo e può codificare fino a 150
diverse proteine; è formato da una doppia elica circolare di DNA super-avvolta su se stessa
mediante minute proteine ricche in aminoacidi positivi, con una lunghezza stimata pari a 90180 Kb. Tali proteine sono presenti sia in GV che in NPV, sono costituite da 50-60
aminoacidi e particolarmente ricche di residui ARG, THR, SER. Esso è protetto come è
stato detto, da un capside esterno (stadio occluso) proteico formato dalle due più note
proteine dei Baculoviridae ovvero la poliedrina e la granulina, costituite da circa 245 residui
aminoacidici. Esternamente al capside però vi è un ulteriore strato composto da proteine e
carboidrati che probabilmente svolge la funzione di prevenire la fusione tra diversi virus
occlusi, massimizzandone la diffusione fuori dall'ospite. Altre proteine strutturali poi
concorrono alla formazione del capside esterno ma su queste non ci si soffermerà.
Patogenesi
Sono state descritte diverse centinaia di specie di Arthropoda attaccati da tali virus,
quasi tutte appartenenti agli insetti, ma probabilmente solo per ragioni di faciltà e quantità di
studi; sono stati riportati attaccare Lepidotteri, Coleotteri, Ditteri, Imenotteri, Tricotteri,
Tisanuri, Decapodi e data la diffusione e la vastità dei taxa di Arthropoda si suppone
esistano diverse migliaia di specie di Baculoviridae. Tutti i baculovirus NPV attaccano e
permangono nelle cellule epiteliali del primo tratto del canale alimentare dell'ospite, protetto
da uno strato di cuticola noto come membrana peritrofica; solo nei Lepidotteri invece i
NPV, dopo aver infestato l'epitelio del primo tratto del canale alimentare, invadono tutti gli
altri organi interni (emolinfa e relative cellule, corpi grassi, epidermide, trachee, miociti,
ecc.); invece i GV sono stati rinvenuti solo nei Lepidotteri ma hanno lo stesso tipo di ciclo
d'infestazione dei NPV dei Lepidotteri.
Per ambedue i gruppi di baculovirus comunque sono state identificate forme
specifiche geografiche, legate all'ospite o a popolazioni locali dell'ospite, ed anche diversa
suscettibilità dell'ospite ad una stessa specie o addirittura clone di baculovirus. La naturale
evoluzione dell'infezione da Baculovirus non sempre porta alla morte dell'ospite ma in taluni
casi si verifica sopravvivenza dello stesso fino allo stadio immaginale; in tali casi di
sopravvivenza numerosi effetti subletali e/o negativi per la fitness sono stati riportati in
letteratura: riduzione della fecondità; riduzione della fertilità delle uova deposte; decremento
della quantità e della qualità degli spermi; allungamento dei tempi di sviluppo; incremento
della taglia larvale; sex-ratio alterata. Tutti questi effetti subletali sono intimamente connessi
ad un altro fenomeno dimostrato recentemente: i baculovirus in alcuni casi si trasmettono
verticalmente (per via parentale) e non solo orizzontalmente (per via infettiva), integrandosi
evidentemente nelle cellule germinali (femminili?) o addirittura nel loro genoma, passando
così alla generazione successiva in forma silente.
Numerosi casi di multipla infezione di un ospite hanno rivelato che esiste un effetto
moltiplicativo sulla mortalità dell'ospite stesso, il quale pertanto se infestato da due o più
specie di baculovirus è soggetto ad un incremento di mortalità; invece nel caso delle specie
di baculovirus è stata documentata una sorta di interferenza, in quanto la produzione di
particelle occluse è inferiore in caso di multipla infezione rispetto alla infezione singola.
Per una serie di ottime immagini dei vari stadi infettivi dei baculovirus e del loro
ciclo patogenetico si rimanda all'ottimo sito web redatto da Devauchelle & Cerutti (2000):
http://www.univ-montp1.fr/biotech/Baculovirus/BaculoContenu.htm.
NPV dei Lepidotteri. - Sono specifici degli stadi larvali e la loro virulenza è correlata
a diversi fattori quali: suscettibilità dell'ospite; specificità dell'ospite, eta larvale dell'ospite,
dose (n. di particelle ingerite); temperatura ed umidità ambientale; grado di insolazione del
suolo e della vegetazione; ecc. Gli NPV sono ugualmente letali sia per i primi stadi che per
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gli ultimi stadi larvali; la differenza sta nella velocità con la quale si ottiene la morte
dell'ospite: negli stadi I-III la morte sopraggiunge prima della settimana, solitamente entro 4
giorni dall'infezione; negli stadi post-III invece sopraggiunge dopo 10-21 giorni. Il decorso
dell'infezione però è il medesimo; dopo essere stati ingeriti, i NPV si liberano dell'involucro
esterno e del capside poliedrico all'interno dell'ambiente alcalino (pH 8-10) del canale
alimentare dell'ospite, coadiuvato dalle proteasi, passando così allo stadio di budded-virus; a
questo punto una volta liberati i virioni questi penetrano la membrana peritrofica,
attraversano il citoplasma delle cellule epiteliali, penetrano nel nucleo ed iniziano la prima
fase replicativa, determinando ipertrofia nucleare; alcuni virioni però possono anche bypassare il nucleo, arrivando sotto il primo strato di cellule epiteliali e infettare le cellule
sottostanti (tessuto tracheale, emolinfa, ecc), pluristratificando e delocalizzando il primo
attacco. Probabilmente però la maggiore entità di infestazione si verifica durante le mute tra
le età larvali, allorquando la membrana peritrofica è assente o in costruzione. Una volta
infestato il circolo emolinfatico la successiva ondata infettiva verso gli altri organi diviene
conseguenzialmente molto rapida. Nei vari organi colpiti e colonizzati dai budded-virus ha
luogo l'ultima fase infettiva portando rapidamente alla fase finale della malattia che consiste
nella mega-ipertrofia dei nuclei (anche x10 in volume) con l'assemblaggio di alcuni miliardi
di poliedri ed il collasso di tutti gli organi colpiti, portando al disfacimento interno la larva e
quindi alla sua morte; in questa fase agisce una chitinasi virale che lisa la chitina di cui è
costituita la cuticola, determinando la fuoriuscita dei visceri oramai liquefatti o quasi. Molto
interessante è il fatto che nelle ultime ore di vita attiva della larva questa solitamente si porta
in posizione sopraelevata o apicale sulla vegetazione e dopo poco rimane attaccata al
substrato con le pseudozampe penzolando invece con la parte anteriore dell'addome, il
torace e il capo rivolti verso il basso, in una tipica posizione angolata a "V". Si suppone che
tale comportamento sia causato dal baculovirus stesso il quale in tal modo massimizza la
diffusione delle particelle virali nell'ambiente in seguito alla lisi della cuticola larvale.
GV dei Lepidotteri. - Esistono tre tipi distinti di GV in base al target postpenetrazione. Nei GV-I viene attaccato l'insieme dei corpi grassi i quali portano ben presto a
gigantismo larvale, ipo-reattività, para-letargia ed infine morte del bruco, il quale non va
incontro a liquefazione del corpo a causa della mancanza di chitinasi; il corpo invece va
incontro ad un esteso inscurimento. In GV-II il decorso, i sintomi e gli organi target sono
quasi sovrapponibili coi comuni NPV, come anche la liquefazione corporea. In GV-III, noto
al momento solo per la specie Harrisina brillians, rimane confinata all'epitelio del primo
tratto alimentare, causando violenti e ripetuti eventi diarroici che disidratano
irreversibilmente la larva conducendola a morte.
NPV di altri Arthropoda. - Un numero crescente di specie di baculovirus è stato
scoperto in anni recenti attaccare molte altre specie di artropodi, anche se la massima varietà
si rinviene in seno ai Lepidotteri. I meccanismi di azione sono fondamentalmente simili
anche se il target rimane confinato al solo tratto alimentare. E' probabile che dallo studio
approfondito dei NPV non-Lepidotteri possano derivare consistenti arricchimenti nella
biodiversità del Baculoviridae.
Ricerca applicata
Oggi la produzione di Baculovirus in forma di insetticidi è soggetta ad una notevole
mole di ricerca sia di base che applicata. I fronti su cui si concentra la ricerca negli ultimi
due decenni sono brevemente esposti:
-) eliminazione dal genoma del virus dei geni non necessari alla sopravvivenza del virus
stesso e non coinvolti nella patogenesi, in modo da allegerire la particella virale durante la
fase replicativa, velocizzando quest'ultima;
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-) inserzione/duplicazione di geni potenziatori della patogenicità in modo tale da
incrementarne il potere letale, accorciare i tempi di latenza e decrementare gli effetti
subletali;
-) messa a punto di sistemi chimici e fisici protettivi contro radiazioni termiche ed UV,
deleterie alla struttura capsidica e quindi al mantenimento delle capacità patogenetiche
allorquando il virus è fuori dall'ospite;
-) inserzione di geni codificanti per tossine non-baculovirus in modo tale che i virus
agiscano da vettori di insetticidi (baculovirus ricombinanti).
Effetti sulle specie non target
Dopo numerosissime serie di prove condotte anche con mega-dosi, può essere
ragionevolmente e certamente concluso che i baculovirus non hanno alcun effetto nefasto
evidente e/o subdolo nei confronti di specie non artropode; inoltre nessuna specie di
baculovirus possiede ospiti appartenenti a ordini diversi di Arthropoda, nemmeno in
situazioni artificiali di laboratorio, mentre sono note diverse specie di baculovirus che
possono infettare ospiti appartenenti a diverse famiglie ma di un medesimo ordine. La
stragrande maggioranza delle specie è altamente specifica (una sola specie ospite); le poche
che presentano diversi ospiti solitamente esibiscono elevata patogenicità solo verso ospiti
congeneri, mentre su specie di distinte famiglie la patogenicità è elevata solo con elevati
dosaggi ed in condizioni di laboratorio. Biosaggi eseguiti con baculovirus di Lepidotteri
testati su Apis mellifera hanno dato risultati assolutamente negativi; anche larve di Polistes
nutrite di continuo con larve infettate da baculovirus non hanno dato alcun segno di effetti
letali e/o subletali. Per concludere, l'analisi delle agro-entomocenosi prima e dopo estesi
trattamenti con prodotti commerciali a base di baculovirus non ha mostrato effetti negativi
sulle specie non-target. Pertanto l'impiego dei baculovirus come insetticidi alternativi è
sicuro.
Sistematica
Un breve cenno alla sistematica dei Baculoviridae è fondamentale in quanto la
classica distinzione tra NPV e GV è stata di recente messa in discussione man mano che si
rendono disponibili studi dettagliati sul ciclo patogenetico di diversi baculovirus nonLepidotteri, che progressivamente si rendono disponibili sequenze genomiche complete. Un
problema nella comparazione delle sequenze genomiche è l'elevata variabilità dei geni dei
baculovirus; infatti su oltre 420 geni diversi individuati tra tutte le specie note solo 63 sono
effettivamente comuni a tutte le specie in questione, ovvero solo il 15%.
Comunque sia, la sistematica dei GV pare sia confermata al momento, con tre gruppi
ben separabili e che corrispondono ai tre diversi modelli di patogenesi elencati in
precedenza; essi effettivamente sono ben separati e separabili dai NPV e sono strettamente
specifici dei Lepidoptera.
Nel caso invece dei NPV la prima revisione ha portato alla proposta di individuare
ben due gruppi distinti di NPV in seno ai Lepidotteri, creando pertanto due nuovi gruppi o
generi (NPV-I; NPV-II). Successive analisi poi avrebbero dimostrato che i NPV di
Imenotteri, Ditteri sono molto più affini tra essi che non tra NPV e GV dei Lepidotteri,
proponendo lo scenario di 4 generi-gruppi distinti di NPV, uno per ogni ordine di Insetti,
con i GV molto più affini ai NPV dei Lepidotteri. Se lo scenario verrà confermato si
intravede una esplosione di taxa di Baculoviridae man mano che si espanderà l'analisi dei
baculovirus di altre classi di Arthropoda.
La revisione sistematica dei Baculoviridae però non è rimasta confinata al suo
interno ma ha iniziato l'esplorazione anche delle possibili relazioni filogenetiche con altri
gruppi di virus. Vi sono evidenze in proposito che dimostrano una profonda correlazione di
sequenza aminoacidica di proteine capsidiche dei NPV con le proteine gypsy del capside di
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alcuni retro-trasposoni di insetti; tale conclusione è stata avallata da successive indagini che
hanno addirittura espanso l'analisi di sequenze individuando un gruppo naturale di virus
degli insetti formato da Errantiviridae (Metavirus + Pseudovirus) e Baculoviridae.
Ringraziamenti
Si ringrazia il direttore della rivista per l'incarico ad eseguire la rassegna didattica
nell'ambito del progetto: l'uso commerciale delle malattie degli insetti.
Bibliografia
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