risultati in vitro

RISULTATI IN VITRO
Il PM2.5 invernale interagisce con il citoscheletro della cellula.
Gli esperimenti in vitro condotti su cellule THP-1, rappresentative dei monociti circolanti
nel sangue, hanno evidenziato la capacità del PM2.5 di alterare la normale progressione
del ciclo cellulare, ovvero come le cellule si accrescono e si dividono. Tale alterazione
sembra dovuta ad una interazione del PM con gli elementi del citoscheletro che coordinano
e dirigono le fasi più importanti della divisione cellulare, la mitosi. E’ noto che alterazioni
della normale progressione della mitosi possono risultare nella trasformazione di cellule
sane in cellule tumorali. Questo meccanismo di danno verrà a studiato approfonditamente
in quanto potrebbe fornire un modello per spiegare l’incremento di malattie polmonari
gravi.
Alterazione del ciclo cellulare
Controllo
Immagini che evidenziano danno ai microtubuli
PM2.5 estivo
PM2.5 invernale
60
50
40
30
20
PM est
Ctrl
10
0
subG1
G0/G1
S
PM inv
G2/M
Il PM2.5 invernale provoca danno al DNA.
Il PM fine campionato a Milano attiva, in cellule rappresentative dell’epitelio alveolare, gli
enzimi coinvolti con i meccanismi di detossificazione normalmente attivati dagli idrocarburi
policiclici aromatici. I composti di trasformazione di questi composti chimici interagiscono
tuttavia con il DNA cellulare portando danni al DNA anche gravi.
Questo è anche dimostrato dall’incremento della fosforilazione della molecola istone H2AX.
La sua fosforilazione è infatti un noto marker di danno al DNA dovuto a stress ossidativo.
Incremento di citocromi in cellule esposte a PM2.5 invernale
1,8
Incremento del danno ossidativo al DNA
3,00
yH2AX (fold increase)
Espressione Cyp1B1 (fold increase)
% cellule
70
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Ctrl
PM2.5 estivo
PM2.5 invernale
Controllo
PM2.5 estivo PM2.5 invernale
Il PM fine invernale oltre a modificare la progressione del ciclo cellulare induce
anche danno al DNA con le possibili gravi conseguenze per la salute.
PM estivo in co-colture:
In sistemi composti da cellule dell’epitelio alveolare (A549) e da cellule di monociti (THP-1)
la risposta infiammatoria e maggiore rispetto all’esposizione delle singole
Summer PM10 1μg/cm²
IL-6 fold increase
6
5
4
3
2
1
0
A549
THP-1
A549/THP-1
Mac
A549/Mac
PM10 estivo
In vitro induce il rilascio di una importante proteina infiammatoria (IL-1ß), coinvolta nei
normali processi di risposta immunitaria.
IL-1ß può indurre
Effetti locali (basse quantità): attivazione linfociti T e B, aumento delle capacità adesive,
della citotossicità e della capacità fagocitica;
su cellule endoteliali induce attività pro-coagulante, induzione di NO e PGL2, chemochine,
molecole di adesione e vasodilatazione
Effetti sistemici (alte quantità): sul sistema nervoso centrale (febbre, sonnolenza), sul
fegato (ipoglicemia), sul midollo osseo, sul cuore (inibizione contrattilità), sui vasi
sanguignei (trombi) e sulla muscolatura scheletrica (aumento catabolismo proteico)
La ricerca sta indagando i meccanismi di rilascio di questa interleuchina. In particolare si
sta analizzando l’attivazione dell’inflammosoma, meccanismo che regola in modo fine il
rilascio di interleuchine. IL-1ß è la proteina infiammatoria che, dopo traslocazione ad altri
organi , può produrre effetti significativi
Macrofagi controllo
Macrofagi esposti a PM10 estivo con particelle internalizzate
IL-1ß (pg/ml)
Incremento dose dipendente di IL-1ß rilasciata da macrofagi esposti a PM10
1000
500
0
CTRL
Sum PM10
1ug/cm2
Sum PM10
2,5ug/cm2
Sum PM10
5ug/cm2
Win PM10
RISULTATI IN VIVO
Si osserva nel liquido di lavaggio dei polmoni un incremento della fosfatasi alcalina (ALP)
indice di tossicità del PM sulle cellule dell’epitelio polmonare. L’effetto è paragonabile per i
PM fini testati (estate e inverno)
ALP (IU/L)
0,2
0,16
Co
0,12
PM1w in
0,08
PM1sum
0,04
0
24h
Oltre ad indurre morte cellulare il PM fine invernale risulta indurre uno stato di lieve
infiammazione, come osservato dall’incremento delle proteine pro infiammatoria MIP-2.
MIP-2
(pg/mL)
MIP-2
(pg/mL)
140
*
120
100
Co
80
PM1win
60
PM1sum
40
20
0
24h
Le cellule presenti nel lavaggio bronco alveolare mostrano inoltre la presenza di macrofagi
con presenza di particelle fini internalizzate nelle cellule.
Controllo
PM1 invernale
PM1 estivo
L’analisi del sangue periferico dei topi esposti ha evidenziato un incremento del parametro
sP – Selectina. L’incremento di questa proteina è indice di una possibile interferenza delle
particelle col sistema della coagulazione e sembra sostenere l’ipotesi della traslocazione
delle particelle, cioè dello spostamento delle stesse nell’organismo. E’ tuttavia possibile che
gli effetti pro infiammatori, evidenziati in vitro ed in vivo, possano contribuire alla
modificazione di tale parametro. A prescindere dal meccanismo questi dati confermano la
correlazione tra esposizione a PM ed effetti sulla sistema circolatorio.
sP-Selectin(ng/mL)
(ng/mL)
sP-Selectina
160
140
*
120
100
*
Co
80
PM1win
60
PM1sum
40
20
0
24h
Di notevole interesse i risultati ottenuti su campioni di tessuto cerebrale estratto da topi
esposti a PM fine.
Su questi tessuti è stato valutato il grado di degenerazione delle membrane cellulari
dovuto a stress ossidativo. I dati ottenuti in vitro hanno dimostrato una maggiore capacità
dei PM invernali di indurre stress ossidativo. In vivo questa proprietà non solo viene
confermata ma trova applicazione anche a livello delle cellule cerebrali. L’incremento dei
livelli di malondialdeide indica infatti una danno ai lipidi delle membrane cellulari nel
tessuto cerebrale, mediato dalle specie reattive dell’ossigeno (radicali liberi) che vengono
prodotti con maggiore efficienza dai campioni di particolato invernale. Anche questi dati
suggeriscono in qualche modo la possibilità di traslocazione delle particelle più fini del PM
fino alla regione cerebrale.
MDA brain (uM)
MALONDIALDEIDE
1,4
1,2
1
Co
0,8
0,6
*
PM1win
PM1sum
0,4
0,2
0
24h
I risultati in vitro ed in vivo permettono di tracciare un quadro interessante dei possibili
effetti dovuti all’esposizione a PM.
In estate la copresenza di elementi chimici e componenti biologiche non solo attiva il
rilascio delle normali citochine infiammatorie (IL6 e IL8) ma promuove un importante
rilascio di IL-1ß, citochina in grado di promuovere risposte infiammatorie a livello tessuto
polmonare, indurre modificazione delle proprietà di coagulazione e, una volta traslocata
nel sistema circolatorio, produrre effetti in altri organi una volta immessa.
I PM invernali sono invece caratterizzati da un maggiore potenziale genotossico, come
risulta dalle analisi in vitro, e dalla capacità di indurre stress ossidativo, non solo in cellule
dell’epitelio polmonare ma anche, dopo traslocazione a livello di altri organi.