Presentazione di PowerPoint - e

DEFINIZIONE DI SPECIE:
complesso di individui con uguali caratteristiche e
che riproducendosi danno individui fertili.
Definizione di specie nei microrganismi: una specie batterica è
costituita da un gruppo di ceppi che mostra un grado elevato di
somiglianza e che si distinguono da altri gruppi di ceppi correlati per
un grande numero di caratteri indipendenti.
Ceppo: popolazione di organismi che discende da un unico microrganismo o da un
isolato in coltura pura
I «nuovi» approcci nella tassonomia
batterica:
• Composizione in basi del DNA
• Ibridazione degli acidi nucleici
• Sequenziamento genomico
(comparazione sequenze housekeeping,
e.g. MLST)
A
B
C
A
Profilo gene X
A
B
B
C
C
Profilo gene Y
TRASFERIMENTO GENICO ORIZZONTALE
Il trasferimento genico orizzontale è il fenomeno per il
quale si ha un trasferimento di materiale genetico (e
quindi di informazione genetica) tra organismi
indipendenti e non per via ereditaria.
I meccanismi che sono responsabili di questo fenomeno
sono:
•La coniugazione
•La trasformazione
•La trasduzione fagica
LA CONIUGAZIONE
Gli effetti della coniugazione
furono osservati già a partire
del 1946 da Ledenberg e
Tatum che osservarono come
due ceppi di E.coli
caratterizzati da almeno due
mutazioni auxotrofiche
potevano, se mescolate, dare
un ceppo prototrofo.
Ben presto ci si rese conto che questo fenomeno era
determinato dallo scambio di materiale genetico tra i due
batteri. Questa osservazione ha portato all’individuazione e
allo studio della coniugazione batterica
Esperimenti del tubo ad U
Esistono differenti fenomeni di coniugazione ma il più
studiato e senz’altro quello a carico del plasmide F di E.coli.
Affinché avvenga una coniugazione è necessario che siano
presenti due tipi di batteri: un donatore (caratterizzato dal
possedere il plasmide coniugativo F) e un recipiente (che
ovviamente non lo possiede).
Altra condizione è che i due batteri devono essere molto
vicini l’un l’altro.
Ciò è reso possibile da una struttura extracellulare
denominata pilo sessuale
Il pilo sessuale ha una struttura a
cilindro cavo con una sezione esterna
di 8 nm e una interna di 2 nm. La
lunghezza può arrivare anche a 20µm
Una volta che il pilo contatta la cellula
recipiente comincia ad accorciarsi in
maniera tale da avvicinare le due cellule
Il “recettore” del pilo è probabilmente identificabile in un
complesso costituito da LPS e dalla proteina di superficie
OmpA
Nonostante la cavità del pilo, il materiale genetico non passa
attraverso di esso, ma il contatto tra le due cellule determina
la formazione di un ponte citoplasmatico attraverso il quale
avviene il passaggio del DNA).
Plasmide
F
Il plasmide è divisibile in una regione contenente gli elementi
della replicazione e della incompatibilità plasmidica (inc, rep);
una regione caratterizzata dalla presenza di quattro elementi
trasponibili; una regione silente e infine la regione responsabile
del processo coniugativo …..
La regione tra è di circa 35 kb e contiene circa 36 geni la maggior
parte dei quali denominati tra ed alcuni trp. Questi geni sono
responsabili del processo di coniugazione. Ad esempio il gene traA
codifica la pilina, ovvero la proteina che compone il pilo sessuale.
I geni traQ e traX codificano proteine coinvolte nella
maturazione e nella acetilazione della pilina.
Le proteine codificate dai geni traG e traN sono responsabili
del mantenimento del contatto tra le cellule in fase di
coniugazione mentre la proteina TraD permette la formazione
del ponte citoplasmatico.
Le proteine TraT eTraS sono invece responsabili del
fenomeno della esclusione di superficie
Infine è centrale il ruolo svolto dal prodotto dei geni traI e traY.
Queste due proteine danno il via al trasferimento del materiale
genetico attraverso il ponte citoplasmatico
Il processo ha infatti inizio con il taglio,
da parte di TraI e TraY del singolo
filamento di DNA del plasmide F nella
regione oriT (all’estremità della regione
tra). Queste proteine rimangono legate
all’estremità 5’ che si forma e sono
responsabili dell’attraversamento di
questa del ponte citoplasmatico.
Il singolo filamento lineare viene sfilato
da quello circolare e
contemporaneamente avviene la sintesi
di un nuovo filamento, che lo sostituisce,
attraverso il meccanismo di replicazione
a circolo rotante.
Il filamento trasferito viene utilizzato per la replicazione
del DNA, a partire da un primer di RNA che si forma per
la trascrizione di due geni denominati ssf e psiD. Questi
due messaggeri, vengono anche tradotti per sintetizzare
due proteine importanti: la prima è un omologo delle SSB
di E.coli, ma specifiche per il DNA di F, la seconda è una
proteina che sopprime il sistema SOS della cellula
recipiente
Modello della coniugazione di F
SCHEMATIZZAZIONE DEL PROCESSO DELLA
CONIUGAZIONE
La coniugazione avviene tra ceppi F+ e ceppi F-. In verità esiste un
altro tipo di ceppi in grado di effettuare la coniugazione e vengono
definiti Hfr.
In questi microrganismi è avvenuto un evento di ricombinazione
omologa tra le sequenze IS (IS2 e IS3) o la formazione di un
cointegrato per la trasposizione replicativa di Tn1000.
Questi ceppi presentano il
plasmide F integrato nel
cromosoma batterico. La
capacità di effettuare una
coniugazione è però rimasta
inalterata.
CONIUGAZIONE DI UN Hfr
il DNA trasferito non è dotato di una propria origine di replicazione
e la presenza dell’elevata omologia con il DNA cromosomale da vita
a eventi di ricombinazione. Due eventi di ricombinazione
determinano lo scambio del materiale genetico del cromosoma del
ceppo recipiente con il DNA del ceppo donatore.
L’interruzione sperimentale delle coniugazioni è stato lo
strumento che ha permesso di determinare la posizione relativa
dei geni nel cromosoma di E.coli in epoca pre-sequenziamento e
di dimostrare che il cromosoma di questo microrganismo è
circolare .
Dato un ceppo Hfr con un fenotipo
leu + thr+ pro+ e un ceppo recipiente
leu- thr- pro- si può effettuare una
coniugazione selezionando per i
singoli prototrofi.
La frequenza di reversione di ciascun
fenotipo ci permette di risalire alla
loro posizione. Ad esempio se
avessimo frequenze del tipo leu
=30%, thr =15% e pro=50% la
sequenza esatta sarà:
pro-> leu -> thr
La regione del cromosoma del ceppo donatore che andrà ad
essere trasferita dipende dal sito di inserzione del plasmide F nel
cromosoma e dal suo orientamento
Dalla combinazione dei risultati di differenti ceppi Hfr (con il
plasmide F integrato in punti differenti) è stato possibile
concludere che ……
first
A
E
B
last
I
I
F
E
A
K
N
L
O
A
A
D
I
I
E
E
L
N
C C
D D
C
C
O
K
F
B
M
D
K
K
F
F
B
B
M
Il plasmide F, se privato della regione responsabile della
coniugazione si comporta come un plasmide qualunque e
viene definito mini-F.
Allo stesso modo si può rendere mobilizzabile un plasmide
qualunque se viene dotato delle sequenze riconosciute dalle
proteine della coniugazione che, in questo caso, devono essere
fornite dalla cellula ospite opportunamente modificata.
LA TRASFORMAZIONE
La trasformazione è il fenomeno per il quale la cellula
batterica è in grado di assorbire DNA nudo dall’ambiente e
integrarlo nel proprio cromosoma.
Questa capacità, detta competenza, è naturalmente espressa da
alcuni microrganismi ( Bacillus subtilis e Streptococcus
pneumoniae) mentre in altri può essere indotta (per esempio in
Escherichia coli).
Competenza naturale
La capacità che alcuni microrganismi hanno di prelevare del DNA
dall’ambiente è determinata dal possedere complessi proteici
deputati a questo scopo. In Bacillus subtilis un complesso di
numerose proteine è coinvolto in questo processo……
ComGC forma il canale
nella parete cellulare.
ComEA, EC ed FA sono
responsabili della
formazione del canale
citoplasmatico e del
trasporto del DNA nella
cellula.
Infine NucA (N) e la
nucleasi che trasforma il
dsDNA in ssDNA
Competenza indotta
La competenza può essere indotta mediante trattamento delle
cellule con opportuni agenti chimici o fisici.
Elettroporazione
Un altro metodo sperimentale per ottenere la trasformazione dei
microrganismi consiste nell’esporre le cellule e il DNA, nella stessa
mix, ad una rependina e elevata scarica elettrica.
Lo shock provocato da questo trattamento determina
l’internalizzazione del DNA e quindi la trasformazione.
L’elettroporazione è, sperimentalmente, sino a 100 volte più efficace
della trasformazione in CaCl2. Inoltre si propone anche come
metodo di elezione nella trasformazione dei microrganismi
unicellulari eucariotici come Saccharomyces caerevisiae
La trasduzione
Esistono due tipi di trasduzioni fagiche che
vengono distinte in :
•TRASDUZIONE GENERALIZZATA
•TRASDUZIONE SPECIALIZZATA
La prima è esercitata da batteriofagi come P1 e P22
(rispettivamente per E.coli e Salmonella), mentre la seconda è
tipica del fago .
Nella trasduzione generalizzata potenzialmente tutti i geni
contenuti nel ceppo donatore possono essere trasferiti in un
ceppo recipiente…..
Nella trasduzione specializzata solamente i geni presenti nei
pressi del sito di inserzione cromosomale del genoma di un
fago possono essere trasferiti !!!!
TRASDUZIONE GENERALIZZATA
Nella trasduzione generalizzata l’infezione da parte di un
batteriofago determina la frammentazione del genoma della
cellula ospite. La maturazione delle particelle fagiche può
determinare una errata incorporazione di DNA batterico in una
testa fagica. L’infezione da parte di questa particella fagica
determina l’inserzione di DNA batterico in una cellula batterica.
Un evento di ricombinazione può determinare uno scambio
genico
TRASDUZIONE GENERALIZZATA
TRASDUZIONE SPECIALIZZATA
Con una
frequenza di 10-6
l’excisione del
genoma di 
avviene in modo
anomalo. Il
risultato è che
parte di tale
genoma rimane
nel cromosoma di
E.coli e un
piccolo
frammento di
questo entra a far
parte di un
genoma difettivo
di 
dGal