Diapositiva 1 - Docenti.unina

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99999945658897899999999194755
Valentino Rossi
corridore
Harrison Ford
attore
Rita Levi Montalcini scienziata
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Informazione posizionale :
alterazioni cromosomiche, analisi di linkage,
associazione con aplotipi
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62631351737646141999999999999456
58897899999999194755
Harrison Ford attore
Rita Levi Montalcini scienziata
?
Informazione funzionale Rita Levi Montalcini scienziata: sonda
complementare 584
Identificazione posizionale
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64462631351737646141999999999999
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Clonaggio di geni
Delezione associata ad un
fenotipo malattia (sonda),
Polimorfismo associato ad un
fenotipo o ad un QTL,
Analisi di linkage
Posizione
di
mappa
Proteina mutante
Funzione
gene
Posizione
di
mappa
gene
Funzione
GENETICA DIRETTA
GENETICA INVERSA
Mappatura genetica:
“marker-marker”
mapping
usato
per
costruire reti di marcatori per la
correlazione di mappe fisiche e genetiche.
“disease-marker” mapping per localizzare
geni malattia
La costruzione di fitte mappe genetiche
“marcatore-marcatore”
sono
un
utile
strumento per la mappatura genetica di
geni d’interesse.
Come si fa l’analisi di “linkage”
nella popolazione umana?
La situazione ideale per l’analisi di “linkage”
A3A3
A2A4
A1 A4
A2 A3(allele
A3 o aplotipo A3
associato al gene malattia)
A1A2
A1A2
A3A1
A4A2
A4A2
A1A2
A4A3
A1A3 A3A1
R
Domanda: Il locus A con i quattro alleli polimorfici A1, A2,
A3 ed A4 è associato al gene malattia? Se sì quanto?
A1 A4
A1A3
A1A3
A2A1
A2 A3
A4A2
A4A2
A1A2
A4A3
A1A3 A2A1
Possiamo prendere in considerazione una serie di loci polimorfici
distribuiti su tutto il genoma e domandarci a quale di questi loci è
associato il gene malattia?
Il locus A con i quattro alleli polimorfici A1, A2, A3 ed A4 è
associato al gene malattia?
L’allele che segrega con il gene
malattia può essere differente
nelle diverse famiglie
LOD SCORE
Si definisce LOD SCORE
il logaritmo in
base 10 del rapporto fra la probabilità che
si ottenga una data distribuzione di genotipi
in caso di associazione (ad una data
Frequenza di Ricombinazione) rispetto alla
situazione di indipendenza (Frequenza di
ricombinazione 0.5)
Analisi di linkage
Supponiamo che A rappresenti il locus per il gene malattia e B il
marcatore genetico associato.
Se A e B fossero indipendenti nella progenie dovrei trovare i gameti
AB, Ab, aB e ab equi-rappresentati (ossia 0.25)
Quindi il gene malattia dovrebbe segregare indifferentemente con B o b
Analisi di linkage
A e B potrebbero essere associati in CIS
5 Parentali
2 Ricombinanti
oppure A e B potrebbero essere associati in TRANS
5 Ricombinanti
2 Parentali
Se la fase non è nota il calcolo del LOD SCORE comprende ambedue i
casi e li somma perché si escludono a vicenda.
Analisi di linkage (Morton 1995)
Si definisce LOD SCORE il logaritmo in base 10 del rapporto fra la
probabilità che si ottenga una data distribuzione di genotipi in caso di
associazione (ad una data Frequenza di Ricombinazione) rispetto alla
situazione di indipendenza (Frequenza di ricombinazione 0.5)
Il LOD SCORE (Z) può essere calcolato per diversi valori di FR.
Se la fase è nota:
Z = log10[ (1-FR)P (FR)R / (1/2)Totale ]
Se la fase è ignota:
Z = log10[ ½ (1-FR)P (FR)R / (1/2)Totale + ½ (1-FR)R (FR)P / (1/2)Totale ]
Impostiamo il calcolo ponendo che la fase sia nota :
5 Parentali
2 Ricombinanti
Totale 7
Il calcolo del LOD SCORE si fa per varie distanze di mappa. Da dove
cominciamo? Dalla distanza di mappa presunta? 28.6 um o cM
Z = log10[ (1-FR)P (FR)R / (1/2)Totale ]
2/7= 0.286 p (ricombinanti) = 0.286
p (parentale) = (1- 0.286) = 0.714
Z = log10[ ½ (1-FR)P (FR)R / (1/2)Totale + ½ (1-FR)R (FR)P / (1/2)Totale ]
Impostiamo il calcolo ponendo che la fase sia nota :
5 Parentali
2 Ricombinanti
Totale 7
p (ricombinante) = 0.286 p (parentale) = (1- 0.286) = 0.714
Z = log10[ (1-FR)P (FR)R / (1/2)Totale]
Z = log10[(1-0.286)5 (0.286)2 /(1/2)7]
Z = log10[(0.714)5 (0.286)2 /(1/2)7 ] applicando le proprietà dei logaritmi:
Z = 7 log10(2)* + 5 log10 (0.714) + 2 log10(0.286) =
7 (0.30) + 5 (-0.146) + 2 (-0.540) = 2.1 -0.73 -1.08 = 2.1 – 1.81 = 0.29
Se la fase fosse ignota:
Z = log10[ ½ (1-FR)P (FR)R / (1/2)Totale + ½ (1-FR)R (FR)P / (1/2)Totale ]
* - log10 (1/2)7 = -7 log10 1 – (-7 log10 2) = 0 + 7 log10 2
Fase nota: sono noti i genotipi dei nonni
Fase ignota
Al variare del valore della FR otteniamo una curva.
Il valore del LOD score varia
al variare della distanza di
mappa e possiamo
rappresentarlo come una
funzione.
inconclusiva
Il lod score è max a FR= 0. Se si ottiene una
curva come la 1 c’è chiara evidenza di
associazione stretta associazione.
1
2
Se si ottiene una curva come la 2 c’è
evidenza di associazione, ed il valore di Z
punta ad un massimo alla distanza fra i
marcatori più probabile.
Se si ottiene una curva come la 3,
l’associazione è esclusa per le distanze che
rendono Z inferiore a -2.
4
3
Esclusione
di
associazione per
distanze inferiori
a 10 um
Se ottenete una curva come la 4, cioè con i
valori di Z compresi fra -2 e 3, l’analisi è
inconclusiva.
Al valore di FR = 0.5, il valore del LOD
SCORE si azzera sempre.
Linkage analysis with a biochemical marker (ABO system and Nailpatella syndrome)
Totale individui analizzati = 18
Presunti Ricombinanti = 3
Parentali = 15
FR = 3/18 = 0.16 presunta distanza 16 cM
Z = log10[ (1-FR)P (FR)R / (1/2)Totale ]
Z = log10[ (1-0.16)15 (0.16)3 / (1/2)18 ]
Z= 18 log10 2 + 15 log10 (0.84) + 3 log10 (0.16)
Z= 18 x 0.30 + 15 (- 0.075) + 3 (- 0.79)
Z = 5.4 – 1.125 – 2.37 = 1.9 (è il valore di Lod Score alla distanza di 16 um)
Linkage analysis with a DNA marker (Neurofibromatosi and a RFLP
located on chrmosome 17)
http://www.orpha.net
Sindrome di Sjogren
unknown
Sindrome cat-eye
duplicazione invertita del 22
Sindrome “buccia di mela” unknown
………………………………..
Vision problems
Gut atresia
Linkage analysis is much more
efficient and accurate if data from
more than 2 loci are analyzed
simultaneously (Multipoint linkage
analysis)
Disease-marker mapping
• Starting point:
• a lod score value from a 2-point (markers)
lod score analysis showing that the disease
maps near one particular genetic marker.
• A marker map locating this marker within a
framework of other polymorfic markers.
The final aim is to locate the “disease
gene” in one of the intervals of the
marker map.
• “marker-marker” mapping usato per costruire reti di
marcatori per la correlazione di mappe fisiche e
genetiche.
• “disease-marker”
malattia
mapping
per
localizzare
geni
Multipoint linkage analysis:
- useful to establish the chromosomal order
of a set of linked loci
- useful to overcome problems caused by
the limited informativeness of markers
La curva indica le posizioni di mappa del gene malattia più verosimili.
I valori più elevati dei picchi di LOD SCORE rispetto ad una serie di
marcatori indicano la localizzazione più probabile del gene rispetto ad
essi.
Valori di lod score inferiori a -2 ci escludono la regione come
potenziale sito di localizzazione del gene malattia.
L’analisi di linkage “multipoint”
marker-marker non soffre della
necessità di dover reperire
necessariamente molte famiglie
informative in cui segreghi la
malattia.
Le famiglie CEPH hanno strutture ideali per l’analisi di linkage e sono
raccolte in una bio-banca:
- tre generazioni
- genitori e nonni disponibili
- almeno otto individui nella progenie
- Sample mixing e non-paternità sono state ampiamente verificate
Nel laboratorio si assegna la regione cromosomica
del gene ignoto mediante una sonda e una tecnica
di localizzazione fisica
Identificata la regione
candidata si analizzano i
DNA
di
individui
appartenenti alle famiglie
CEPH che presentano
ricombinazione in quella
regione.
La mappatura “Multipoint” colloca il gene
in una posizione precisa nel reticolo di
marcatori polimorfici.
TAPPE DEL CLONAGGIO POSIZIONALE
1 TAPPA
associazione tra fenotipo e regione del genoma
2 TAPPA
I marcatori genetici polimorfici che mappano in quella
regione vengono analizzati per identificare quelli che
mostrano una elevata associazione con il fenotipo
malattia (lod score superiore a 3)
3 TAPPA
Si cerca di restringere la regione a un intervallo di 2-1
cM o meno che corrisponde al massimo a 2-1 Megabasi.
4 TAPPA
Si identificano tutte le “open reading frames” presenti
in quella regione.
5 TAPPA
Nei soggetti affetti dalla malattia, si esegue l’analisi
mutazionale nelle “open reading frame” e sequenze
regolative associate per identificare il gene appartenente
alla regione genomica identificata che presenta mutazioni
4 TAPPA
Genomica funzionale: verifica in vivo attraverso la
modificazione del fenotipo in modelli animali transgenici
(knock out, knock-in, overexpressione)
END OF TOPIC