HISTO TYPE Narcolepsy

Istruzioni d’uso
HISTO TYPE Narcolepsy
0123
Kit per la tipizzazione tissutale degli alleli HLA
(II Classe: HLA-DR, DQA, DQB)
in biologia molecolare
IVD
20 tipizzazioni
pronte all’uso prealiquotate
REF 70716: HISTO TYPE Narcolepsy
(8 mix, rosse)
Indice
1.
2.
Introduzione ............................................................................................................. 2
1.1
Informazioni di base ....................................................................................... 2
1.2
Descrizione del prodotto................................................................................. 3
Materiale .................................................................................................................. 4
2.1
Contenuto dell’HISTO TYPE Narcolepsy ....................................................... 4
2.2
Materiale supplementare necessario.............................................................. 4
2.3
Conservazione e stabilità ............................................................................... 5
3. Dati per l’esecuzione .................................................................................................. 5
4. Procedura del test....................................................................................................... 6
4.1
Condizioni di sicurezza ed indicazioni speciali............................................... 6
4.2
Estrazione del DNA ........................................................................................ 6
4.3
Amplificazione ................................................................................................ 6
4.4
Elettroforesi del gel......................................................................................... 9
4.5
Documentazione ed interpretazione............................................................... 9
5. Avvertenze e precauzioni ........................................................................................ 10
6. Soluzione dei problemi ............................................................................................. 11
7. Referenze ................................................................................................................ 12
8. Spiegazione dei simboli usati sulle etichette ............................................................ 12
Versione: 01/2010
1.
Introduzione
1.1 Informazioni di base
La narcolessia appartiene al gruppo dei disturbi del sonno (dissomnia). E’ un disordine
disabilitante del sonno che presenta un’incidenza dello 0,02-0,18% della popolazione
generale in vari paesi e gruppi etnici. I sintomi caratteristici di questo disordine sono una
eccessiva sonnolenza nelle ore diurne, sonno anormale, paralisi del sonno, catalessi e
allucinazioni ipnagogiche. La narcolessia è causata dalla perdita selettiva dei neuroni che
producono ipocretina nell’ipotalamo.
La sua stretta associazione al sistema HLA è nota da lungo tempo. Circa l’85-95% dei
pazienti narcolettici presentano l’aplotipo HLA DRB1*1501 -DQA1*0102 - DQB1*0602,
confrontato con il 30% della frequenza nella popolazione normale. La maggiore
associazione con narcolessia è stata studiata per il sottotipo DQB1*0602, che il marcatore
di narcolessia più specifico in tutti i gruppi etnici. Circa il 98% dei pazienti narcolettici è
stato tipizzato come portatore del sottotipo DQB1*0602, mentre l’associazione con
DRB1*1501, DQA1*0102 è riportata in una casistica numericamente inferiore.
Sulla base di queste informazioni, la rilevazione dei genotipi DRB1*1501, DQA1*0102, e
DQB1*0602 è un utile strumento per la diagnosi della narcolessia. In caso di un risultato
del test negativo per DQB1*0602, è possibile escludere la narcolessia con sufficiente
probabilità. D’altra parte, in caso di un risultato del test positivo per lo stesso allele, non
indica necessariamente l’esistenza di patologia narcolettica, poiché la frequenza di
DQB1*0602 è di circa l’11-22% nella popolazione generale.
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1.2 Descrizione del prodotto
Recentemente nella tipizzazione HLA sono stati fatti molti progressi mediante l’utilizzo
della Polymerase Chain Reaction (PCR). Il sequenziamento degli alleli HLA
ha reso
possibile la tipizzazione a livello del DNA con una risoluzione più alta e con molti vantaggi
rispetto all’uso tradizionale del metodo sierologico.
Il materiale base per la tipizzazione con gli HISTO TYPE SSP kits è il DNA purificato. La
procedura del test viene effettuato utilizzando il Sequence Specific Primers (SSP) -PCR
(vedi Fig. 1). Questo metodo si basa sull’estensione del primer, e perciò la riuscita della
PCR dipende da un esatto match all’estremità 3' di entrambi i primers. Perciò, solo se i
primers sono complementari alla sequenza avviene l’amplificazione, che viene di seguito
evidenziata dall’elettroforesi del gel di agarosio.
Match esatto
Amplificazione
Mismatch
Nessuna Amplificazione
(Allele non specifico)
(Allele specifico)
Fig. 1: Principio della SSP-PCR
La composizione delle positività delle mixes dei primer rende possibile una chiara
identificazione della tipizzazione HLA indicata nel diagramma di interpretazione. Per ogni
tipizzazione vengono usati un certo numero di mixes (8) prealiquotate e liofilizzate nelle
quali è incluso il controllo di amplificazione interno con un volume finale di 10 µl.
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2.
Materiale
2.1 Contenuto dell’HISTO TYPE Celiac Disease kit
♦
20 piastre HISTO TYPE sufficienti per 20 tipizzazioni HLA. Le miscele delle reazioni
prealiquotate e liofilizzate, includono i primers alleli specifici, i primers del controllo
interno (specifici per il gene G3PDH umano) e nucleotidi. La prima mix di reazione è
chiaramente contrassegnata ed ogni piastra ha stampato il numero di lotto.
♦
Controllo di contaminazione della reazione di PCR con primer di controllo interno e
primer per le amplificazioni specifiche.
♦
PCR-buffer 10x sufficiente per 20 tipizzazioni.
♦
12 strisce di tappi à 8 sufficienti per 20 tipizzazioni.
♦
Istruzioni d’uso, tabella delle specificità, diagramma d’interpretazione e fogli di lavoro.
2.2
Materiale necessario supplementare
♦
Taq Polimerasi (5 U/µl).
♦
BAG EXTRA-GENE (facoltativo) Kit per l’estrazione di DNA da sangue / linfociti /
leucociti o materiale per altri metodi di estrazione di DNA.
♦
Pipette a pistone (0,5-250 µl).
♦
Punte sterili con filtro.
♦
Termociclatore (per es. PTC 200 con coperchio termostatato, MJ Research/BioRad)
Dispositivi e materiale per l’elettroforesi del gel
♦
DNA agarosio
♦
Buffer TBE 0.5 x (45 mM di Tris, 45 mM di acido borico, 0,5 mM di EDTA).
♦
Etidio bromuro (EtBr).
♦
Cella elettroforetica.
♦
DNA-length standard (Cat.-No.: 7097)
♦
Alimentatore di corrente (200-300 V, 200 mA)
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Dispositivi per l’interpretazione e la documentazione
♦
Transilluminatore UV (220-310 nm)
♦
Macchina fotografica (per es. sistema Polaroid) con pellicola (Polaroid tipo 667)
2.3.
Conservazione e stabilità
Il kit è fornito senza ghiaccio secco. Conservare tutti i reagenti a -20 ÷ -80 °C al buio. La
data di scadenza viene indicata sull’etichetta di ogni reagente ed è valida anche per i
reagenti aperti. La data di scadenza indicata sull’etichetta esterna si riferisce al reagente
contenuto nel kit con la stabilità più breve. Scongelare brevemente il PCR-buffer 10 x
prima dell’uso.
3.
Dati per l’esecuzione
Sensibilità analitica :
Viene garantita una tipizzazione attendibile usando 50-80 ng
di DNA per ciascuna mix di reazione.
Specificità diagnostica:
La composizione della positività delle mix dei primers
garantisce un’identificazione attendibile della tipizzazione HLA
(basata sugli ultimi dati di sequenza) indicate nel diagramma
d’interpretazione.
Gli
aggiornamenti
saranno
effettuati
regolarmente.
Per ogni lotto la specificità di ogni mix è stata verificata con DNA da campioni di
riferimento: ogni reazione PCR è stata testata positivamente almeno una volta. Gli alleli,
non inclusi che per la loro rarità non sono stati rispettivamente testati, sono indicati nel
diagramma d’interpretazione o nella tabella delle specificità.
E’ stato eseguito uno studio della performance per l’ HISTO TYPE Narcolepsy con almeno
50 campioni di DNA. Il confronto dei risultati ottenuti e le tipizzazioni ottenute con kits SSP
di un altro fornitore, non mostrano discrepanze.
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4.
Procedura del test
4.1
Condizioni di sicurezza ed indicazioni speciali
La PCR è un metodo particolarmente sensibile e dovrebbe essere eseguito da personale
debitamente addestrato con esperienza in tecniche di genetica molecolare e in
istocompatibilita. Dovrebbero essere seguite le linee guida dei trapianti così come gli
standard EFI per ridurre i rischi di false tipizzazioni, nel caso particolare di discrepanze nel
metodo sierologico e quello della genetica molecolare .
Si devono osservare condizioni speciali di sicurezza per evitare contaminazioni e perciò
false reazioni:
♦
Indossare i guanti durante il lavoro (se possibile senza polvere).
♦
Usare nuove punte per ogni semina (con filtro integrato).
♦
Usare aree di lavoro separate per la pre-amplificazione (estrazione del DNA e
preparazione
delle
reazioni)
e
post-amplificazione
(elettroforesi
del
gel,
documentazione). Usare preferibilmente due stanze separate.
♦
Usare dispositivi ed altro materiale solo nei rispettivi posti e non scambiarli.
4.2 Estrazione del DNA
Per la tipizzazione HLA-SSP di un paziente sono richiesti 1 µg di DNA (corrispondenti
approssimativamente a 0.1 - 0.5 ml di sangue). Per es. il BAG EXTRA-GENE kit è ideale
per l’estrazione poiché il DNA puro lo si può ottenere da sangue intero in breve tempo
senza usare chimici tossici o solventi. Inoltre, altri metodi descritti nella letteratura come il
metodo cloroformio-trietil-ammonio-bromuro (CTAB) o la purificazione fenolo-cloroformio
sono idonei per fornire una sufficiente purezza del DNA. La presenza di eparina
potenzialmente inibisce la PCR. Perciò per la tipizzazione si consiglia sangue in EDTA o
citrato. Il DNA dovrebbe avere una purezza (rapporto di estinzione OD260/OD280 ) tra 1.5
e 2.0.
4.3
Amplificazione
Tutte le mixes prealiquotate e liofilizzate contengono già i primers allele-specifici, i primers
di controllo e i nucleotidi. Questi sono forniti liofilizzati nel fondo delle provette di reazione.
I parametri di amplificazione sono ottimizzati ad un volume finale di 10 µl.
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1.:
Prelevare il numero richiesto di piastre HISTO TYPE HLA-SSP da - 20°C e
scongelare il PCR-buffer 10 x a temperatura ambiente.
2.:
Preparare la Master-Mix composta da PCR-buffer 10 x, soluzione DNA, TaqPolymerase e Aqua dist. e miscelare bene. L’HISTO TYPE Narcolepsy kit lavora con
la stessa Master-Mix come gli altri BAG HISTO TYPE SSP Kits e perciò possono
essere combinati. La composizione della Master-Mix è esposta nella Tabella 1 (p.7).
Se si deve eseguire un controllo di contaminazione, preparare prima la Master-Mix
senza la soluzione di DNA e seminare 10 µl di questa miscela nel controllo di
contaminazione. In seguito aggiungere la soluzione di DNA e distribuire la MasterMix nelle provette di reazione preseminate.
Tabella 1:
Composizione della Master-Mix
nr. di mix Acqua dist.
8
69
10 x PCR
buffer
Soluzione DNA
(25-40 ng/µl)
Taq-Polymerase
(5 U/µl)
Volume
totale
10
20
0,8
100
µl
Ö la quantità di DNA dovrebbe essere compresa tra 50 e 80 ng per mix. a seconda della concentrazione di
DNA, occorre variare le quantità di acqua e DNA da aggiungere.
(es.: 20 µl di soluzione di DNA solution (25 ng/µl) e 69 µl acqua dist.; 10 µl soluzione di DNA (50 ng/µl) e
79 µl acqua dist.).
3.:
Dopo aver vortexato aggiungere immediatamente 10 µl di questa miscela alle
miscele di reazione preseminate e liofilizzate. Cambiare il puntale dopo ogni semina.
Chiudere bene le provette con i
Marcatura
rispettivi tappi. Assicurarsi di
non toccare con le dita la parte
Î
cdefghij
kl . . . . .
interna dei tappi ed il bordo superiore delle provette, per evitare la contaminazione.
Se si usano termociclatori con coperchio a chiusura ermetica, è anche possibile
usare PCR mat riciclabili.
Scuotere leggermente la piastra verso il basso per dissolvere il pellet blu sul fondo
della piastra. Tutte le soluzioni PCR dovrebbero depositarsi sul fondo.
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4.:
Mettere le provette di reazione nel termociclatore e chiudere il coperchio in modo che
le provette di razione non si deformino riscaldandosi. Iniziare il programma PCR. Se
viene usato un coperchio termostato non è necessario aggiungere olio minerale
all’interno delle provette!
Parametri di amplificazione:
Programma-Step
Temp.
Tempo
Numero di cicli
Prima denaturazione
96°C
5 Min
1 ciclo
Denaturazione
96°C
20 Sec
5 ciclo
Annealing+Estensione
68°C
1 Min
Denaturazione
96°C
20 Sec
Annealing
64°C
50 Sec
Estensione
72°C
45 Sec
Denaturazione
96°C
20 Sec
Annealing
61°C
50 Sec
Estensione
72°C
45 Sec
Estensione finale
72°C
5 Min
1 ciclo
una
velocità
Con
termociclatori
che
hanno
Tipi di
termociclatore:
PTC 100 / 200
(MJ Research/
BioRad),
GeneAmp PCRSystem 9600 / 9700
(utilizzare per favore
modalità di
riscaldamento 9600)
(ABI) e Mastercycler
epGradient S
(Eppendorf)
10 ciclo
15 ciclo
elevata
di
raffreddamento
e
riscaldamento, si consiglia comunque di utilizzare un programma di ramping a
velocità inferiore.
Poichè i termociclatori di produttori diversi hanno performance diverse ed anche i
singoli apparecchi individuali dello stesso tipo possono funzionare in modo
diverso, potrebbe essere necessario ottimizzare i parametri di amplificazione.
Per ottimizzare il Vs. apparecchio seguire le istruzioni seguenti:
Con reazioni false positive (bande non specifiche, additional types): aumentare la
temperatura di annealing di 1°C.
Con reazioni false negative (bande assenti): diminuire la temperatura di annealing di 1°C
e/o aumentare i tempi di annealing di 5 secondi e/o aumentare i tempi di denaturazione di
5 secondi.
Si consiglia di usare solo termociclatori regolarmente calibrati. Per questo il BAGCycler Check kit è ideale per il controllo del buon funzionamento del Vs.
apparecchio (Cat.-No.: 7104). I test per il controllo di qualità sono stati eseguiti su
un PTC-100/200 (MJ Research), 9700 (ABI) e Mastercycler epGradient S (Eppendorf).
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4.4
Elettroforesi del gel
La separazione dei prodotti ottenuti con l’amplificazione si effettua tramite gel di agarosio
in elettroforesi orizzontale. Si consiglia come tampone per l’elettroforesi TBE 0.5 x (45 mM
di tris, 45 mM di acido borico, 0.5 mM di EDTA). La concentrazione del gel dovrebbe
essere 2.0 - 2.5% di agarosio. Lasciare polimerizzare il gel per almeno 30 minuti prima di
caricare il campione. Al termine dell’amplificazione, prelevare i campioni dal termociclatore
e caricare con attenzione ciascuna miscela di reazione in ogni pozzetto del gel. Inoltre,
caricare 10 µl di DNA length standard per la valutazione del peso molecolare. La corsa
elettroforetica è fatta a 10-12 V/cm (con elettrodi distanti 20 cm 200-240 V circa), per 2040 min. Al termine della corsa, il gel viene immerso in una soluzione di etidio bromuro
(EtBr) (circa 0.5 µg/ml di EtBr in H2O o buffer TBE) per 30-40 minuti. In alternativa l’EtBr
(0.5 µg/ml) può essere aggiunto al buffer per l’elettroforesi o al gel di agarosio. Se
necessario, rimuovere l’EtBr in eccesso immergendo il gel in H2O o buffer TBE 0.5 x per
20-30 minuti.
4.5
Per
Documentazione ed interpretazione
la
documentazione
visualizzare
il
prodotto
di
amplificazione
usando
un
transilluminatore UV (220-310 nm) e fotografare con una macchina fotografica, un filtro e
una pellicola adatti (per es. polaroid con pellicole 667). Scegliere i tempi di esposizione e
di apertura in modo che le bande siano ben visibili e risaltino sullo sfondo scuro (per
esempio apertura 11, tempo di esposizione 1 secondo).
Per l’interpretazione usare la tabella delle specificità ed il diagramma d’interpretazione
(vedere fogli aggiuntivi); sono da considerare positive solo le bande che hanno un peso
molecolare corretto in confronto al ladder DNA standard. Le dimensioni corrette sono
indicate nella tabella delle specificità e nel diagramma di interpretazione. Il controllo
interno a 1070 bp deve essere chiaramente visibile nei pozzetti dove non c’è
amplificazione allele-specifica. In alcuni casi dove c’è un’amplificazione allele-specifica il
controllo interno può essere più debole o scomparire completamente. Per risultati non
corretti consultare la sezione “Soluzione dei problemi” (6).
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Nel controllo di contaminazione non dovrebbe essere visibile alcuna banda. In caso di
contaminazione con DNA genomico ci sarà una banda a 282 bp. Potrebbero esserci
bande addizionali a 78 bp, 104 bp, 176 bp e 580 bp ca.. In caso di contaminazione con
DNA amplificato ci sarà una banda a 78 bp e/o a104 bp e/o a 282 bp.
5. Avvertenze e precauzioni
L’etidio bromuro è un potente mutageno. Indossare i guanti quando si maneggiano gels o
soluzioni contenenti EtBr! Fare riferimento alle istruzioni, alle avvertenze e alle precauzioni
d’uso del produttore! Il transilluminatore UV emette onde molto corte che possono causare
bruciature alla pelle e alla retina. Usare una maschera per la protezione facciale UV!
Tutti i materiali biologici impiegati per l’estrazione del DNA, per es. sangue o tessuto
umano, devono essere maneggiati come potenzialmente infetti. Si consigliano precauzioni
di sicurezza appropriate quando si maneggiano materiali biologici (non pipettare con la
bocca; indossare guanti monouso quando si maneggia materiale biologico e si esegue il
test; al termine del test disinfettare le mani).
Il materiale biologico deve essere inattivato prima dello smaltimento (per es. in autoclave).
Il materiale smaltito deve essere autoclavato dopo l’uso.
La fuoriuscita di materiale potenzialmente infetto deve essere rimosso immediatamente
con carta assorbente e le aree contaminate pulite con un disinfettante standard o con
etanalo al 70%. Il materiale usato per pulire le fuoriuscite, incluso i guanti, deve essere
inattivato prima dello smaltimento (per es. in autoclave).
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6.
Soluzione dei problemi
Problema
Possibile causa
Soluzione
nessuna amplificazione,
DNA contaminato con inibitori di PCR
ripetere l’estrazione del DNA,
length standard visibile
provare metodi diversi
concentrazione di DNA
modificare la concentrazione di DNA /
troppo alta / troppo bassa
ripetere l’estrazione di DNA
enzima mancante
ripetere la tipizzazione,
o concentrazione troppo bassa
modificare
la
concentrazione
dell’enzima
DNA da sangue in eparina
ripetere la tipizzazione con sangue in
EDTA
parametri di amplificazione errati
ottimizzare i parametri di amplificazione
(vedere 4.3) œ
Ripetuto insuccesso in
perdita nelle provette di reazione;
ciascun pozzetto (nessun
evaporazione di acqua e variazione usare un’altra provetta di reazione
controllo di amplificazione)
della concentrazione durante la PCR
amplificazione a specifica, contaminazione
bande addizionali,
(bande
dimensioni
prodotti
di ripetere la tipizzazione,
amplificazione
addizionali
errate
con
chiudere bene le provette con i tappi;
assicurarsi dell’esatta procedura del
lavoro
di
devono DNA contaminato con sali
essere tralasciate)
ripetere l’estrazione di DNA,
provare metodi diversi
concentrazione di DNA troppo alta
usare meno DNA
concentrazione dell’enzima troppo alta usare meno enzima
parametri di amplificazione errati
ottimizzare i parametri di amplificazione
(vedi 4.3) œ
l’interpretazione mostra più
contaminazione carry-over (prodotti di
controllare la Master Mix
di 2 specificità
amplificazione!)
(senza aggiunta di DNA)
nuovo allele
assicurarsi dell’esatta procedura del
lavoro
nessuna banda visibile o
colorazione EtBr troppo debole
ripetere la colorazione
molto debole, length
standard invisibile
lo sfondo del gel è troppo colorazione troppo forte,
chiaro
concentrazione di EtBr troppo alta
immergere il gel in H2O o TBE per
diminuire la concentrazione di EtBr
bande confuse
buffer per elettroforesi troppo caldo
diminuire il voltaggio
errato buffer per elettroforesi
usare buffer TBE 0,5 x
œ Quando si usano i reagenti ed il materiale elencato, considerare come ultima risorsa l’ottimizzazione
dei parametri di amplificazione. In molti casi, è possibile interpretare il test eliminando le bande addizionali
che hanno pesi molecolari non corretti.
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7.
Riferimenti
Nishino, S. et al., 2000. Sleep Medicine Reviews 4:75-99
Mignot, E. et al., 2001. Am. J. Hum. Genet. 68:686-699
Overeem, S. et al. 2008. Sleep Medicine Reviews 12:95-107
Bodmer, J. et al., 1997. Tissue Antigens 49:297-321
Olerup, O., Zetterquist H., 1992. Tissue Antigens 39:225-235
Olerup, O., Zetterquist H., 1993. Tissue Antigens 41:55-56
Maniatis et al., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
New York: Cold Spring Harbour Laboratory
Beutler, E. et al., 1990. BioTechniques 9:166
8. Spiegazione dei simboli usati sulle etichette
IVD
For in vitro diagnostic use / Per uso dianogstico in vitro
Storage temperature / Temperatura di conservazione
LOT
Batch code / Codice del lotto
Use by / Utilizzare fino a …..
REF
Catalogue number / Numero di codice
Consult instructions for use / Consultare le istruzioni d’uso
Per le istruzioni d'uso in altre lingue si veda:
http://www.bag-healthcare.com/en/Diagnostika/Downloads/
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12 di 12
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