Laboratorio di Genetica Medica
Lo studio prenatale dei cromosomi fetali:
esame citogenetico
standard vs array
Bologna, 06 Giugno 2014
Giorgio Lucci
La citogenetica classica
Inizio della citogenetica umana moderna
Tjio e Levan, nel 1956, stabilirono il
numero corretto dei cromosomi umani,
46, principalmente grazie ai miglioramenti
tecnici delle procedure di preparazione
dei cromosomi metafisici.
Ciò permise l’identificazione dei cromosomi individuali e l’associazione di
particolari disordini genetici con specifici cromosomi.
La citogenetica classica
- Durante il “periodo trisomico” : attenzione a pazienti con anomalie congenite : si scoprì che
pazienti con sindrome di Down possedevano un cromosoma 21 addizionale (Lejeune et al. (1959)
Etude des chromosomes somatiques de neuf enfants mongoliens. Compt Rend 248:1721-1722).
- Vennero scoperte altre trisomie, quali la trisomia 13 (sindrome di Patau), la trisomia 18
(sindrome di Edwards) e descritte inoltre anomalie numeriche coinvolgenti i cromosomi
sessuali associati a specifici fenotipi clinici (45,X0 sindrome di Turner; 47XXY sindrome di
Klinefelter).
- Gli ulteriori avanzamenti portarono all’“era del bandeggio”: il pattern di bande orizzontali,
con diversa intensità di colorazione, risultano essere specifiche per ogni cromosoma,
permettendone il riconoscimento. Ciò permise di studiare riarrangiamenti strutturali
associati a specifiche sindromi genetiche.
- Col tempo le tecniche di bandeggio si sono raffinate ed è aumentato il livello di risoluzione al
quale possono venire studiati i cromosomi.
Il cariotipo standard
Vantaggi:
Visione d’insieme dell’intero genoma
Individua anomalie strutturali bilanciate
Individua anomalie strutturali sbilanciate
Svantaggi:
Risoluzione di circa 10-5 Mb (da 320 bande a 1000 bande)
Variazioni strutturali di dimensioni
Le dimensioni delle delezioni/ duplicazioni sono molto varie
Possono esserci perdite o guadagno di materiale genetico ( più o meno importante )
di dimensioni inferiori al limite della risoluzione dell’analisi del cariotipo standard
Al limite inferiore vi è la delezione o la sostituzione di una singola base nucleotidica
in uno specifico gene, che può produrre una alterata espressione dello stesso e
patologia, evidenziabile con tecniche di biologia molecolare quali sequenziamento o
RdB ecc.
Un avanzamento diagnostico è venuto dall’utilizzo congiunto di tecniche
di citogenetica classica con alcune di biologia molecolare
La FISH
Sonde locus-specifiche
Sonde alfoidi
Sonde painting
La FISH
Vantaggi:
Risoluzione
> rispetto all’analisi cromosomica standard (circa 40-150 Kb)
Ha permesso di individuare: sindromi da microdelezione e sindromi da
geni contigui e regioni critiche delle sindromi cromosomiche tradizionali
Svantaggi:
Tecnica lunga , laboriosa , costosa
E’ necessario conoscere il bersaglio: evidenzia solo ciò che
il clinico ricerca in base a quanto osservato
Non analizza l’intero genoma (numero di sonde limitato dal numero
di fluorocromi marcatori utilizzabili in una singola analisi)
Comparative Genomic Hybridization (CGH)
Comparative Genomic Hybridization (CGH)
Vantaggi
Visione dell’insieme del genoma
Non necessario conoscere il bersaglio
Risoluzione nell’ordine di 2-3 Mb
Svantaggi
Analisi comparativa e non assoluta
(DNA di comparazione è di soggetto “sano”)
Tecnica lunga e laboriosa, costosa
Non individua riarrangiamenti cromosomici, come inversioni o traslocazioni,
che siano bilanciati
Spesso materiale di partenza non adatto per ottenere buoni preparati
metafasici (aborti, tumori solidi..)
Array CGH
Principio
Questa tecnologia è stata inizialmente sviluppata utilizzando il principio della CGH convenzionale
1) Nell’arrayCGH, un DNA di riferimento e un DNA di un paziente sono
differentemente marcati ( il primo solitamente con un colorante rosso ed il secondo in
verde) e poi sono coibridati a piccoli frammenti di DNA umano posti in maniera
ordinata su un vetrino (Array).
2) La distinzione tra condizione con guadagno, perdita o bilanciamento si basa sul
rapporto di fluorescenza verde rispetto a rosso per ciascun frammento di DNA posto
ordinatamente sul vetrino
3) Utilizzando strumenti informatici , il rapporto di fluorescenza verde a rosso per ciascun
segmento di DNA viene mappato in un punto specifico di un cromosoma, risultando
in un profilo dell’array.
Comparative Genomic Hybridization ARRAY ((aCGH
aCGH))
Array - Cariotipo Molecolare
•circa 4000 cloni
•Cloni spottati in triplo e quadruplo
(repliche)
•Controlli positivi e negativi,presenza di
barcode
• 1Mb risoluzione, backbone (BAC)
• 0,2Mb risoluzione, regioni associate a
patologie (Oligo)
Esempio di Array
Protocollo (2-3 gg)
Estrazione e
digestione con
ECORI
Controllo digestione e
purificazione su colonnina
e
DNA
test
DNA
controllo
20 kb
600bp
2 cicli di Marcatura
con controllo su gel
Cy3 ( test)
532nm
Cy5( ctr)
635nm
unione dei Dna (+ H.cot1) e
precipitazione
Lavaggi
ibridazione su chip O.N.
Scannerizzazione
analisi
Fase 1: Scannerizzazione
- Lettura laser 10 u
- Ottenimento di immagini/ file per software analisi
Cy5
Cy3
Fase 2:
Analisi con software
-file gal (Genepix Array List)
info su spot
Fase 2:
Analisi con software
-
Allineamento automatico griglia (file gal)
Normalizzazione
Post
Esclusione dati
processing
Combinazione delle repliche (BAC)
File variazioni quantitative genomiche
profili dei cromosomi
Profili cromosomi
Risultato:
log 2
CY3(test)
Cy5( ctr)
Esempio
Ricerca sul database
http://projects.tcag.ca/variation/
Tipologie di Array
( in base al tipo di sonda molecolare utilizzata per l’ibridazione)
I più impiegati in passato sono stati i BAC-array cioè: frammenti
di DNA umano della dimensione di 100-150 Kb incorporati in
cloni BAC ( bacterial artificial chromosome).
Alternativamente sono stati utilizzati i cosiddetti Oligo-array
cioè: le sonde sono piccoli frammenti di Dna di circa 40- 70
basi nucleotidiche (oligonucleotidi).
Risoluzione dell’Array
I segmenti di DNA possono essere “campionati” in tutto il genoma e la loro
frequenza ( cioè la distanza media tra due segmenti tra loro prossimi) è uno dei
parametri che determina la risoluzione dell’Array In pratica più densamente le
sonde coprono una regione cromosomica o l’intero genoma , più alto è il potere
di risoluzione dell’array (vi sono poi altri fattori da cui dipende la risoluzione :
intensità del segnale, rumore di fondo, tipo di algoritmo..)
i BAC-array hanno almeno una risoluzione di 1 Mb cioè può identificare
guadagni o perdite di Dna di 1 Mb cioè circa di 1/10 di una banda cromosomica
(sino ad essere contigui)
Gli oligo-array disponibili commercialmente comprendenti da 44.000 a
2.000.000 circa oligonucleotidi con una media di distanza tra loro 0,02 - 0,01
Mb cioè con una risoluzione da 500 a 1000 volte più alta rispetto a quella di un
cariotipo standard
A : bandeggio G a bassa risoluzione 350 bande
B: bandeggio a più alta risoluzione 550 bande
C: risoluzione incrementata con l’utilizzo di 10 segmenti DNA distribuiti uniformemente in 15q21
D: risoluzione incrementata con l’utilizzo di 500 segmenti DNA distribuiti uniformemente in 15q21
Tipologie di Array
(in base alle parti del genoma analizzate)
Genome–wide array
Le sonde coprono, + o – uniformementente, tutto il genoma
Vantaggio:
identifica piccoli CNVs in tutto il genoma
Svantaggio:
mette in evidenza anche riarrangiamenti di incerto significato patogenetico (VOUS)
Targeted–array
Sono scelte specifiche regioni cromosomiche da analizzare in base alla riconosciuta
associazione con sindromi specifiche (e relativamente frequenti)
Vantaggio:
analizza solo regioni riconosciute come patogenetiche
Svantaggio:
molti riarrangiamenti mappano al di fuori delle regioni considerate
Specificità della Diagnosi Prenatale (DP)
Esistono tempi definiti e brevi per fornire una risposta diagnostica del cariotipo.
La corrispondenza tra risultato analitico della DP e effetto fenotipico patologico/ non
patologico e le caratteristiche della patologia, in vari casi, è verificabile solo dopo la
nascita.
Sulla base del risultato analitico e della sua interpretazione in consulenza genetica,
viene usualmente deciso dalla coppia se proseguire o meno la gravidanza.
Array VS Cariotipo standard
in Diagnostica prenatale
- Cosa l’Array dà in più , cosa in meno , quale è il grado delle differenze e in che modo
utilizzare le metodiche?
Su tali basi si sceglie se gli Array siano attualmente da utilizzare come primo step cioè per tutte
le Dp indipendentemente dal grado alto o relativamente basso di rischio fetale di patologia
sostituendo di fatto il cariotipo standard oppure solo in caso ci sia dimostrato un rischio elevato
cioè secondo step.
(Tecniche
Tecniche eseguite in parallelo per verificare pro/contro per alcuni anni in vari centri)
Posizioni attuali
(ciascuna porta dati a supporto della propria tesi) :
• conservatrice
• avanzata
• intermedia
SIGU
Position paper per microarray (CGH-array e SNP-array) in diagnosi prenatale. (Ultrasound Obstet Gynecol. 2012 Jan
20. doi: 10.1002/uog.11092.)
Svantaggi
- Dati in letteratura ancora limitati
- Presenza di VOUS>o<in base alla piattaforma impiegata:
(Targheted 0,4% ; Whole-genome SNP-array 9-12%)
-Non evidenzia riarrangiamenti bilanciati e mosaicismi di basso grado
-CMA come test di 2°livello dopo il cariotipo standard in gruppi selezionati con:
-1 o+ anomalie ecografiche fetali
(con cariotipo normale, l’ incidenza dei CNVs patogeni è di circa 6.4%)
- riarrangiamenti cromosomici ”de novo” (anche apparentemente bilanciati)
-Presenza di marker sovrannumerario
Indicazioni cliniche per l’analisi arrayCGH in diagnosi prenatale (E.C.A.)
• Due o più anomalie ecografiche compresa IUGR
• Genitori portatori di riarrangiamento cromosomico
• Precedente figlio affetto da anomalia cromosomica
• Caratterizzazione molecolare di un riarrangiamento
struttarale in epoca prenatale
Critiche al position paper SIGU:
- Non ha considerato importanti pubblicazioni (dati su 1000 esami anziché 9000)
- Non vi è aumento di VOUS rispetto citogenetica classica
(un caso su 3000 Targeted-array, elevata risoluzione regioni di patologie note e bassa per backbone)
- Da Studio è emerso che: in 17 gravidanze su 2880 a basso rischio (0.6%) ed in 7 su
120 gravidanze ad alto rischio (5.8%), l’array ha permesso di riscontrare anomalie
cromosomiche submicroscopiche che sarebbero sfuggite se si fosse effettuato solo il
cariotipo convenzionale.
ESAME DI 1°LIVELLO
- Maggiore risoluzione
- Tempi molto ridotti (minore ansia e possibilità interruzione anticipata)
Critiche al position paper SIGU:
- Riguardo traslocazioni bilanciate è rischio per il feto solo se “de novo”
(rarissime e con piccole perdite evidenziabili con CMA, suggerito proprio come approfondimento da
SIGU)
- Molto remoto anche rischio di patologia associata a “effetto posizione”
- Sottolineato limiti del cariotipo tradizionale in DP:
• Limiti di risoluzione
•Coltura in vitro può fallire (ripetizione prelievo invasivo)
•Coltura tende a eliminare progressivamente mosaici a bassa %
ESAME DI 1°LIVELLO
ACOG (American College of Obstetricians and Gynecologists)
SMFM (Society for Maternal-Fetal Medicine)
December 2013
1) Nei casi di gravidanze con anomalie fetali riscontrate all’ecografia ( alto rischio), è
raccomandato l’uso il cariotipo molecolare come test di primo livello (cioè è raccomandato
il suo impiego diretto), in sostituzione del cariotipo tradizionale;
2) Il cariotipo molecolare può essere utilizzato anche nei casi in cui non vengano riscontrate
anomalie fetali all’ecografia, e cioè anche in gravidanze a basso rischio
3) L’uso del cariotipo molecolare non deve essere limitato alle gravidanze con indicazione di età
materna avanzata (≥ 35 anni), bensì può essere proposto a tutti i pazienti che si
sottopongono a diagnosi prenatale invasiva, poiché le anomalie cromosomiche riscontrabili con
questo esame non sono necessariamente associate all’aumento dell’età della paziente.
Sottolinea:
• che c’è un’ampia evidenza scientifica che dimostra un maggiore detection rate del cariotipo
molecolare in diagnosi prenatale (benefici soprattutto con anomalie ecografiche) e come vi sia
la necessità, ormai imprescindibile, di proporre test prenatali la cui risoluzione sia maggiore
della citogenetica classica.
• l’importanza della consulenza pre e post test
Mercoledì 28 Maggio 2014
CONCLUSIONE
Discussione aperta
(Incremento conoscenze su CNVs)
(Incremento utilizzo Array in DP)
Lo studio prenatale dei cromosomi fetali:
esame citogenetico
standard vs array
FINE
