DNA

DNA
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RNA
Uracile al posto
della
Timina
Sempre a SINGOLO FILAMENTO
RNA MESSAGGERO
Filamento lineare di sequenze
nucleotidiche: copia l’informazione
presente sul DNA e porta il messaggio a
livello dei ribosomi
RNA RIBOSOMALE
componente dei ribosomi: fornisce un
meccanismo per decodificare l’mRNA in
amminoacidi
70S
Subunità 30S contiene
l’rRNA 16S
Subunità 50S contiene
l’rRNA 23S + 5S
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RNA TRANSFER
lega e trasferisce un amminoacido specifico
ad una catena polipeptidica in crescita a
livello dei ribosomi
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La replicazione
INTERVENGONO PER LA
FORMAZIONE DELLA
FORCELLA =
DENATURAZIONE
SINTETIZZANO I PRIMERS
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Il codice genetico
Codone
64 possibili triplette
(codoni)
AA
Codone
AA
UUU
Fenilalanina
ACU
Treonina
UUC
Fenilalanina
ACC
Treonina
UCU
Serina
ACG
Treonina
UCC
Serina
ACA
Treonina
UCG
Serina
GGU
Glicina
UCA
Serina
GGC
Glicina
CCU
Prolina
GGG
Glicina
CCC
Prolina
GGA
Glicina
CCG
Prolina
CAU
Istidina
CCA
Prolina
CAC
Istidina
Alcuni AA sono specificati da più di
un codone
DEGENERAZIONE DEL CODICE
GENETICO
per minimizzare gli
effetti delle mutazioni
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61 codoni = di senso, specificano per i 20
amminoacidi
3 codoni= di stop, sono impiegati come
segnale di arresto della traduzione: TAA,
TAG, TGA
codone di inizio: ATG (GTG TTG), a cui
corrisponde un tRNA che trasporta una Nformil-metionina
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gene
Sequenza nucleotidica continua,
specificata da un codone di inizio,
un certo numero di codoni interni
a cui si aggiunge il codone di stop
Codifica per un prodotto del
fenotipo
ORF= OPEN READING FRAME
REGIONE CODIFICANTE,
MA FENOTIPO
SCONOSCIUTO
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La trascrizione
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Il sito promotore
Ribosomal Binding
Site = RBS
GAGG
AAGG
GGA
GGAG
AGGA
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La traduzione
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INIZIO ATG GTG TTG CTG
STOP
TAA TAG TGA
Promotore della trascrizione
GENE
OPERONE
Schema di lettura aperto: Open Reading Frame
ORF
gene
proteina
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Operone ribosomale
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Regolazione
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La variabilità genetica
Il DNA può cambiare
Errori durante la
replicazione
Mutazioni
Trasposizione
Mutazioni
Cambio casuale ma stabile ed
ereditabile
Letali
Negative
Positive
mutazioni da transizione= purina/purina
pirimidina/pirimidina
mutazioni da transversione= purina/pirimidina
delezione o inserzione di una base = frame
shift= Mutazioni puntiformi
L’espressione di una mutazione sarà rilevata solo se
produce un fenotipo alterato che può essere
riconosciuto
l’ordine dei geni può cambiare ?
TRASPOSONI
segmenti di
DNA mobili
La lunghezza dei trasposoni noti è compresa tra 750
e 40000 coppie di basi e nei batteri
ne sono stati trovati di due tipi :
SEMPLICI chiamati anche SEQUENZE DI
INSERIMENTO O DI INSERZIONE.
IR
IR
Trasposasi
lunghezza media sequenze IS: 1000-1500 bp
lunghezza media IR: 10-25 bp
Sequenze ripetute invertite= IR
COMPLESSI
IR
altri geni
IR
IR
IR
sequenza IS
sequenza IS
trasposone
marcatori genetici
(bp)
Tn3
Tn501
Tn951
Tn5
Tn9
Tn10
Tn1681
4957
8200
16500
5700
2500
9300
2061
Amp
Hg
Utilizzazione lattosio
Kc
Cm
Tet
Enterotossina stabile al calore
Meccanismi di trasposizione:
Semplice o non replicativa: entrambi i filamenti del DNA
originale si spostano insieme da una regione all’altra senza
replicarsi.
Replicativa: coinvolge la replicazione del DNA, una copia del
trasposone rimane nel suo sito originario mentre l’altra si inserisce
in un nuovo locus.
Inattivazione del gene bersaglio
promotore
DNA
mRNA
proteina
promotore
DNA
mRNA
proteina assente o tronca
Attivazione di geni silenti
promotore
debole
DNA
gene non trascritto o scarsamente trascritto
promotore
forte
gene altamente trascritto
La cellula può proteggersi dalle
variazioni?
Endodesossiribonucleasi di restrizione = Endonucleasi =
ER
Eco RI da E. coli
=
5’ –G-A-A-T-T-C-
Siti di restrizione
-C-T-T-A-A-G-5’
Hae III da Haemophilus aegyptius
5’ –G-G-C-C-C-C-G-G-5’
Hpa II da Haemophilus parainfluenzae
5’ –C-C-G-G-G-G-C-C-5’
Fanno parte del sistema di
MODIFICAZIONE/RESTRIZIONE
presente in molte cellule batteriche
Come possiamo sfruttare in laboratorio le
conoscenze sul DNA?
1°
Estrazione e purificazione dalle cellule
batteriche
2°
Quantificazione e visualizzazione
spettrofotometrica
3°
4°
5°
6°
Visualizzazione per via elettroforetica
Identificazione tassonomica: %GC e
riassociazione molecolare DNA/DNA
Amplificazioni di porzioni specifiche del
cromosoma
Riconoscimento a livello di specie e
ceppo in funzione dello studio molecolare
delle porzioni amplificate
Estrazione e purificazione dalle cellule
batteriche
Raccolta e lavaggio delle cellule
Risospensione in tampone + saccarosio (6%)
Aggiunta di agente litico: lisozima (pH 7-8, 37°C
per 30 min)
Aggiunta di tensioattivo: SDS al 20%
Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi:
fenolo, CHF/isoamilico
Centrifugazione e raccolta del surnatante
Fase acquosa contenente il DNA
Interfase
Solvente
Ulteriore deproteinizzazione e raccolta del
surnatante
Trattamenti enzimatici con RNAsi e Proteinasi
Precipitazione del DNA con 2 vol. di EtOH
Scioglimento del DNA in tampone
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Quantificazione e visualizzazione
spettrofotometrica
Il DNA ha un massimo di
assorbimento a 260 nm
1 OD260nm = 50 µg/ml
Il DNA si denatura per effetto
del calore = si rompono i legami
H e si separano i due filamenti
Per l’EFFETTO IPERCROMICO delle
basi nucleotidiche, all’aumentare
della separazione dei due filamenti
aumenta la OD260nm
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Visualizzazione per via elettroforetica
una molecola carica posta all’interno di un campo
elettrico migra in direzione del polo di carica
opposta
in
un gel costituito da un polimero organico
molecole di dimensioni diverse (ma di uguale carica)
migrano con velocità diverse, perché le molecole di
dimensioni maggiori incontrano maggiore resistenza
tra le maglie di un gel
È così possibile visualizzare il DNA facendolo
migrare all’interno di un supporto solido (gel) e
colorandolo opportunamente
I REAGENTI DELL’ELETTROFORESI:
Tampone : crea continuità nella vaschetta
AGAROSIO: polimero che costituisce il gel
Indicatore DI CORSA: permette di visualizzare la corsa
ed aumenta la densità della soluzione di DNA da inserire
nelle taschine del gel
BROMURO di ETIDIO: si intercala tra le basi azotate
delle molecole di DNA e lo ‘colora’
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LA STRUMENTAZIONE
DELL’ELETTROFORESI:
1) ALIMENTATORE:
crea la differenza di
potenziale
2) VASSOIO e
VASCHETTA
ELETTROFORETICA:
vi si alloggia il gel, vi
si instaura il campo
elettrico
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IL RISULTATO DI UNA CORSA
ELETTROFORETICA
frammenti di lunghezza
maggiore
POLO
] bande di DNA
frammenti di lunghezza
minore
POLO
+
VISUALIZZAZIONE MEDIANTE TRANSILLUMINATORE
A LUCE ULTRAVIOLETTA (254-312nm)
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