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Relazione inerente l’ attività di Ricerca svolta nell’ambito del percorso di
“Diffusione e Valorizzazione dei risultati della ricerca”
Corso di alta Formazione STRAIN
Obiettivi:
Le attività di ricerca svolte nell’ambito del percorso di “Diffusione e Valorizzazione dei risultati
della ricerca”(Corso di alta Formazione STRAIN), presso i laboratori del gruppo di ricerca AMEG
(Artificial Metallo- Enzyme Group) del Dipartimento di Scienze Chimiche dell’Università degli
Studi di Napoli “Federico II”, sotto la supervisione del Professor Vincenzo Pavone, si inquadrano
nell’ambito di un progetto relativo allo sviluppo di nuovi materiali da utilizzare per lo sviluppo di
nuovi biosensori per il monitoraggio del glucosio.
In particolare, il lavoro che ho svolto ha riguardato la funzionalizzazione dei materiali sia con un
enzima naturale, la Glucosio ossidasi, sia con un enzima di sintesi, modello di nanoperossidasi,
Fe(III)Mimochrome, sviluppato nei laboratori del gruppo AMEG.
Attività svolte e risultati conseguiti:
Un biosensore è un particolare dispositivo analitico, costituito da un elemento di riconoscimento
biologico connesso con un trasduttore del segnale: il trasduttore converte una variazione chimicofisica osservata in un segnale misurabile, generalmente un segnale elettrico, la cui grandezza è
proporzionale alla concentrazione di una sostanza specifica o di un insieme di prodotti.
Il principio di funzionamento del biosensore è molto semplice: l’elemento biologico interagisce con
la sostanza da analizzare (analita) ed un sistema di trasduzione (sensore) converte la risposta
biochimica nel segnale elettrico
Figura 1.1: Schema che mostra i principali
componenti di un biosensore
Le nanoparticelle d’oro (AuNP) trovano applicazioni in diversi campi: in elettronica - come
dispositivi di memoria, permettendo di migliorarne le prestazioni nel tempo; come
nanocatalizzatori; come vernici - il colore rosso rubino è stato utilizzato nella preparazione di vetri
colorati e ceramiche; possono trovare interessanti applicazioni biomediche e biotecnologiche, come
ad esempio nel trasporto di farmaci, nell’ingegneria dei tessuti, nell'immobilizzazione di enzimi e/o
substrati. Nanoparticelle di oro solubili in mezzi acquosi rappresentano una piattaforma ideale per la
sintesi di bioconiugati stabili. Il vantaggio dell’utilizzo di AuNP come supporto solido deriva dal
fatto che le loro piccole dimensioni potranno consentire l’ancoraggio di un numero maggiore di
biomolecole sulla superficie. I sistemi così ottenuti saranno in grado di catalizzare un maggior
numero di reazioni chimiche (per unità di superficie), e ciò si tradurrà in un’amplificazione del
segnale rilevabile e quindi un aumento di sensibilità.
La sintesi delle nanoparticelle d’oro(AuNPs) è stata condotta utilizzando il metodo di Turkevitch
che prevede la riduzione dell’acido tetracloroaurico HAuCl4 ad opera del citrato in acqua, con
l’ottenimento di AuNP dell’ordine dei 20 nm di diametro, rivestite di citrato. In seguito tali
nanoparticelle sono state funzionalizzate con gli enzimi selezionati.
1) Funzionalizzazione delle Nanoparticelle d’oro con la Glucosio ossidasi (GOx):
La strategia di funzionalizzazione delle nanoparticelle ha previsto vari step:
a) funzionalizzazione della glucosio ossidasi di tipo II (GOx-II) estratta da Aspergillus niger
con l’acido lipoico;
b) purificazione della miscela di reazione mediante gel filtration;
c) ancoraggio della GOx funzionalizzata con l’acido lipoico sulle Nanoparticelle e successiva
purificazione tramite cicli di centrifugazione per allontanare l’enzima non legato alle
AuNPs.
d) valutazione dell’attività catalitica delle nanoparticelle funzionalizzate con la GOx mediante
il saggio con la o-dianisidina, come riportato in letteratura [D. Li et al., BBRC 355, 488-493,
2007].
In merito alla valutazione dell’attività catalitica delle nanoparticelle funzionalizzate con
GOx, è da notare che la GOx catalizza la seguente reazione:
β-D-glucosio + O2 D-glucono-1,5-lattone + H2O2
Il saggio è stato eseguito in presenza di HRP (Horseradish Peroxidase) che, reagendo con l’acqua
ossigenata prodotta, ossida la o-dianisidina. La o-dianisidina ossidata assume una colorazione
arancio-marroncina e la produzione del composto ossidato viene seguita, mediante spettroscopia
UV-vis, seguendo la comparsa di una banda a λ= 460 nm.
I risultati che sono stati ottenuti dimostrano che la funzionalizzazione dell’enzima naturale con le
nanoparticelle non altera la funzionalità dell’enzima stesso per cui tali bioconiugati
(GOx/AuNPs) possono essere utilizzati per eventuali applicazioni biotecnologiche.
2) Funzionalizzazione
Mimochrome.
delle
Nanoparticelle
d’oro
con
l’enzima
sintetico
Fe(III)-
In seguito, le AuNPs sono state funzionalizzate con l’enzima Fe(III)-Mimochrome, sintetizzato
nei laboratori in cui ho svolto il periodo di “training on job”.
Anche in questo caso la funzionalizzazione ha previsto vari step:
a) funzionalizzazione dell’enzima Fe(III)-Mimochrome con l’acido lipoico;
b) ancoraggio dell’enzima funzionalizzato con l’acido lipoico sulle Nanoparticelle e successiva
purificazione tramite cicli di centrifugazione, per allontanare l’enzima non legato alle
AuNPs.
c) valutazione dell’attività catalitica delle nanoparticelle funzionalizzate.
Il saggio dell’attività catalitica è stato eseguito utilizzando il substrato riducente ABTS(2,2'azino-bis (3-acido ethylbenzthiazoline-6-solfonico)) e H2O2 (perossido d’idrogeno).
E’ stata analizzata l’attività catalitica nell’ossidazione dell’ABTS con perossido d’idrogeno.
Le AuNPs funzionalizzate con l’enzima hanno mostrato attività catalitica, dimostrazione del
fatto che la biomolecola è legata covalentemente alle Nanoparticelle e che la strategia sintetica
utilizzata ha avuto successo.
Successivamente sono stati utilizzati contemporaneamente entrambi gli enzimi per la
funzionalizzazione delle AuNPs.
3) Funzionalizzazione delle AuNPs con GOx e Fe(III)-Mimochrome, con produzione di un
SAM (Self-assembled monolayers) misto sulla superficie delle AuNPs:
Nell’ambito dell’attività svolta è stata presa in esame la possibilità di funzionalizzare le
nanoparticelle d’oro con entrambi gli enzimi, creando quindi sulla loro superficie un cosiddetto
Self-assembled monolayers (SAM) misto.
Con la formazione di un SAM misto si verrebbe a creare sul biosensore un’architettura che
potrebbe consentire l’utilizzo dell’enzima GOx senza la presenza di un mediatore che viene
solitamente introdotto per facilitare il trasferimento elettronico fra analita ed elettrodo. La GOx,
infatti, in presenza di glucosio produrrà perossido di idrogeno che potrà essere rivelato dalla
metallo-proteina artificiale.
Per la formazione del SAM misto sulla superficie d’oro delle nanoparticelle, sono stati adoperati
la GOx e l’enzima sintetico, entrambi a loro volta funzionalizzati con acido lipoico. In
particolare, la procedura sintetica utilizzata ha previsto dapprima la reazione di
funzionalizzazione delle AuNPs con la GOx, l’incubazione delle nanoparticelle contenenti la
GOx in una soluzione di enzima sintetico, ed infine la passivazione delle risultanti AuNPs con
acido lipoico.
In seguito, come nel caso precedente, è stata valutata l’attività catalitica delle Nanoparticelle
funzionalizzate tramite il saggio con la o-dianisidina, in assenza però di HRP. Questo perché la
GOx, in presenza di glucosio, produce perossido d’idrogeno che potrà essere rivelato dalla
metallo-proteina artificiale che ha attività perossidasica e che, quindi, sostituisce l’HRP utilizzata
in letteratura.
Come già riportato nel caso delle nanoparticelle funzionalizzate con uno solo dei due enzimi,
anche in questo caso, sulle nanoparticelle ottenute, è stata verificata la funzionalità della GOx.
E’ stato quindi condotto il saggio con la o-dianisidina, in assenza però di HRP. In base
all’esperimento cinetico effettuato, è possibile affermare che nel bioconiugato
AuNPs/GOx/Fe(III)-Mimochrome, la GOx ha preservato la sua funzionalità per cui si può
concludere che questa architettura potrà essere utilizzata per lo sviluppo del biosensore.
Struttura ospitante:
Ho svolto la mia attività di ricerca presso il Dipartimento di Scienze Chimiche dell’Università di
Napoli “Federico II”, dove sono in servizio circa 100 unità di personale scientifico, tra docenti e
ricercatori, e circa 20 unità di personale tecnico-amministrativo e addetto alla biblioteca.
Le principali attività del Dipartimento sono la Ricerca, la Didattica e le attività per Conto-terzi.
Le attività di Ricerca del Dipartimento coprono vari settori della Chimica, tra i quali, la
progettazione e la sintesi di nuove molecole, dalle molecole di bassa massa molecolare alle
macromolecole, la purificazione e la caratterizzazione analitica di molecole di origine naturale e
di sintesi, la determinazione strutturale di nuove molecole mediante diffrazione raggi X,
risonanza magnetica nucleare, spettroscopie ottiche ed elettroniche di spin, spettrometria di
massa. Gli studi di progettazione, sintesi e caratterizzazione di nuove molecole sono mirati, ad
esempio, alla produzione di molecole innovative con proprietà catalitiche in importanti processi
chimici e di polimerizzazione, o alla produzione di nuovi materiali strutturali e funzionali, per
svariate applicazioni in campi anche molto diversi. Le attività di ricerca riguardano, ad esempio,
lo studio di biomolecole e biopolimeri per applicazioni in biotecnologia (dallo sviluppo di
biosensori alle applicazioni biomedicali), lo studio di molecole organiche funzionali e polimeri
organici per applicazioni speciali, come la ricerca di materiali per ottica e microelettronica, e per
applicazioni strutturali, come la ricerca e lo sviluppo di materiali dalle proprietà meccaniche di
rigidità e flessibilità innovative e di nuovi elastomeri, e lo studio di materiali nanostrutturati per
applicazioni nelle nanotecnologie in campi diversi, dalla biologia alla medicina, dalla
microelettronica alla nanofotonica.
In particolare, il gruppo ospitante ha riconosciuta esperienza nel campo della chimica delle
proteine e peptidi, in particolare nella progettazione, sintesi e caratterizzazione strutturale di
peptidi in soluzione e allo stato solido, avvalendosi di strumentazioni quali Sintetizzatori di
peptidi, sistemi HPLC, spettrometri LC-MS-ESI-MS e LC-ITTOF; dicrografo, spettrometro
NMR Bruker Avance 600 MHz con probe criogenico, voltammometro, spettrofluorimetro,
sistema stopped – flow, spettrofotometri UV-vis, Assorbimento atomico, GC. Il gruppo ha
accesso al CERM European Large Scale Facility (Centro di Risonanza Magnetica)
dell'Università degli Studi di Firenze, ed ai principali sincrotroni europei (Elettra, Trieste, Italia ,
ESRF, Grenoble, Francia).
Tutor Scientifico: Professor Vincenzo Pavone
Professore ordinario di chimica generale e inorganica
Telefono: 081-674399
Email: [email protected]