Sintesi Parallele - ISCaMaP

School of Industrial and Information Engineering
Course 096125 (095857)
Introduction to Green and Sustainable Chemistry
A.A. 2015/2016
- Sintesi Parallele
- Chimica Combinatoriale
- Ottimizzazione di Processo
Prof. Attilio Citterio
Dipartimento CMIC “Giulio Natta”
http://ISCaMaP.chem.polimi.it/citterio/
Esempio di diversità molecolare
Tetra-peptide: H2N-A-B-C-D-CO2H

si consideri solo i 20 amino acidi naturali (serie L)
204 = 160,000 differenti tetra-peptidi !

ora si includa i 19 amino acidi D (20 L + 19 D = 39)
394 = 2.3 milioni di tetra-peptidi differenti!!

ora si includa 20 amino acidi non naturali
594 = 12 milioni di tetra-peptidi differenti !!!!
Chimica Combinatoriale: metodologia con cui si può preparare e valutare
una famiglia (libreria) di composti correlati (per struttura e sintesi)
Per le sintesi multi-step, si deve usare l’approccio sintetico in esperimenti
in parallelo oppure utilizzando una fase solida per velocizzare la
purificazione degli intermedi
Attilio Citterio
Chimica Combinatoriale nella Progettazione
di Farmaci
Target Terapeutico
Scoperta Capostipite
Ottimizzazione Struttura
Sviluppo Candidato
La Chimica
Combinatoriale
opera qui
Farmaco
Attilio Citterio
Industria Farmaceutica – Scoperta di
Farmaci
Composto
Guida (lead)
ottimizzazione
(sintesi)
Farmaco
10 anni
400 – 800
milioni di $
$$$
Identificazione Prodotto guida : letteratura (aperta e brevettuale)
natura (prodotti naturali)
Attenta ottimizzazione di una struttura guida tramite sintesi chimica
“gioco metile-etile-butile-futile”
N° farmaci commercializzabili
per composti sottoposti a test
biologico preliminare
1
10,000
Attilio Citterio
Progettazione razionale
Chimica combinatoriale
Tools:
1. Tecniche in Fase Solida 1.1. Vantaggi 1.2. Requisiti 1.3. Esempi di Supporti Solidi 1.4. Spaziatori e leganti 1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
Resine Merrifield per la sintesi peptidica (gruppo clorometile) Resine Wang e Rink Resine diiidropiraniche 2. Sintesi Parallele 2.1. Procedure di Houghton delle Bustine di te 2.2. Sintesi parallela automatizzata 2.3. Tecnica "split and pool" 3. Sintesi Combinatoriale Mista 4. Sintesi in fase soluzione Attilio Citterio
School of Industrial and Information Engineering
Course 096125 (095857)
Introduction to Green and Sustainable Chemistry
A.A. 2015/2016
Sintesi Organica in Fase Solida Catalisi su Supporti Polimerici
Prof. Attilio Citterio
Dipartimento CMIC “Giulio Natta”
http://ISCaMaP.chem.polimi.it/citterio/
Sintesi Organica in Fase Solida (SPOS)
La sintesi in fase solida è una metodologia che consente di realizzare
trasformazioni chimiche con l'ausilio di un polimero insolubile. Perciò, è
anche nota come sintesi assistita da polimeri e, quando si applica alla
chimica organica, essa assume l'acronimo di “SPOS” = Solid-Phase
Organic Synthesis.
Deprotection
1) HBr/AcOH
Heating
Neutralization
2) Et3N
Deprotection,
Neutralization
and Coupling
Coupling
DCC
L-leu-L-ala-gly-L-val
L'approccio fu introdotto da R. B. Merrifield,
Premio Nobel per la Chimica nel 1984.
Attilio Citterio
R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149
Tecniche in Fase Solida
•
I reagenti sono legati a una superficie polimerica e modificati mentre sono
ancora legati. Si rilascia il prodotto finale alla fine della sintesi.
Vantaggi
• Si possono legare reagenti specifici a specifici supporti a palline
• I supporti si possono mescolare e far reagire nello stesso contenitore
• I prodotti formati sono specifici per ogni pallina e fisicamente distinti
• Si possono usare reagenti in eccesso per spingere le reazioni a completezza
e questi possono essere facilmente rimossi
• Gli intermedi di reazione stanno sulle palline e non si devono isolare/purificare
• Si possono separare le singole palline per isolare singoli prodotti
• Il supporto polimerico si può rigenerare e ri-usare dopo distacco del prodotto
Requisiti
• Una pallina di resina o una superfice funzionalizzata agisce da supporto solido
• Uno spaziatore e un legante Un legame che lega il substrato al legante. Il
legame deve essere stabile.
• Un mezzo per staccare il prodotto dal legante alla fine.
• E' possibile automatizzare il tutto.
Attilio Citterio
Tecniche in Fase Solida
Esempi di Supporti Solidi
•
Palline di polistirene parzialmente cross-legato di natura idrofobica
causano problemi nella sintesi peptidica per il "folding" dei peptidi
•
La resina poliammidica di Sheppard è più polare
•
La resina Tentagel ha un intorno simile all'etere o al THF
•
Palline, punte e superfici di vetro funzionalizzate
Le palline devono essere in grado di
rigonfiarsi nel solvente usato, e
rimanere stabili
La maggior parte delle reazioni
avvengono all'interno delle resine.
Rigonfiamento indotto dal solvente
Attilio Citterio
Struttura di un Polimero per SPOS
Il materiale si può distinguere in quattro componenti differenziati :
Supporto Solido
(nocciolo)
Spaziatore
Legante
Scaffold
Il nocciolo è normalmente un polimero reticolato all'1% insolubile. Tipici
sono i copolimeri del polistirene e divinilbenzene eventualmente con
polietielenglicol.
Spaziatore: se presente, è comunemente un frammento molecolare (tipico il
polietilenglicol) che connette il supporto solido al legante attraverso un
legame covalente. Da più reattività da soluzione con minor carico di resina
Legante, se presente, fornisce un metodo ortogonale al rilascio del scaffold
Scaffold è la parte che si è interessati a far intervenire nella chimica e che
rilascia il prodotto alla fine della sintesi.
.
Attilio Citterio
Scaffolds e Gruppi Terminali Funzionali Reattivi
Polimeri Reattivi per la Sintesi Organica Fase Solida
A, B e D
+A+B
+C
C
+A+B
A +B
Ph Cl
P Ru PPh2
Ph Cl
A) Catalizzatore
+
NH ClCrO3
B) Ossidante
Attilio Citterio
Ph
O
NCO
N
O
C) “Bloccante” D) Ausiliario Chirale
Vantaggi dei SPOS
C'è una serie di ragioni di base che rendono la SPOS una metodologia
vantaggiosa in confronto alla classica sintesi in fase liquida :
1. Procedure di reazioni semplificate: la purificazione dei prodotti di reazione
si può fare per semplice filtrazione e lavaggio della resina.
2. Influenza termodinamica e cinetica sul corso della reazione: consente di
usare un largo eccesso di reattivo in soluzione (gruppi protettivi
polimerici) o su resina (polimerico reattivo), con alta resa di reazione.
3. Rigenerazione della resina: La resina o il reattivo polimerico si possono
rigenerare per essere usati in una nuova reazione.
4. Principio dell'alta diluizione: Controllando la capacità equivalente della
resina (< 0.8 mmol/g), si possono eliminare indesiderate reazioni di
accoppiamento e si favorire le reazioni di ciclizzazione intramolecolare.
5. E' possibile automatizzare le procedure: l'automazione si usa tipicamente
nelle tecniche di Chimica Combinatoriale e nella tecnica di Array in Fase
Soluzione.
Attilio Citterio
Svantaggi dei SPOS
I principali svantaggi della chimica assistita dai polimeri sono:
1. Sviluppo di un metodo sintetico: Essendo una reazione solido-liquido
(controllata cineticamente dalla diffusione reattiva nei poro del polimero) e
avviene su un supporto solido (che deve essere stabile), le condizioni di
reazione in soluzione non possono essere direttamente applicate, perciò
si devono ottimizzare (scegliendo dei gruppi protettivi polimerici).
2. Limiti dei supporti solidi e dei “linkers”: I “linkers” e i supporti solidi, benché
sviluppati commercialmente, sono in numero limitato.
3. Monitoraggio delle reazioni: Usando gruppi protettivi polimerici, i tempi reali
di monitoraggio delle reazioni sono limitati in quanto il prodotto che si
forma rimane legato al polimero.
4. Stadi sintetici aggiuntivi: Lavorando con reazioni di addizione-eliminazione,
si devono aggiungere più stadi alla sintesi tradizionale in soluzione. Il
processo ha bassa EA e numerosi scarti.
5. Scala: Generalmente il metodo si applica alla sintesi di campioni di prodotto
inferiore a 1 g, ma in alcuni casi lo si è applicato in fase di produzione.
Attilio Citterio
Tipi di Supporto Solido
Si usano supporti polimerici
per immobilizzare i
substrati, reagenti e
catalizzatori.
Il supporto polimerico nella
maggior parte dei casi è
insolubile, ma talvolta si usano
polimeri solubili. I polimeri usati
nelle sintesi di molecole
organiche appartengono a
quattro classi :
1) Polimeri organici reticolati: sono insolubili in solventi organici e possono
essere micro-porosi o macro-porosi (per es. Polistirene).
2) Polimeri organici lineari: solubili in solventi organici e insolubili in altri da cui
si possono precipitare (per es. Polietilenglicol).
3) Dendrimeri: la cui solubilità dipende dalla polarità e forma
4) Supporti inorganici : vetro poroso, silice, allumina, argille, grafite.
Attilio Citterio
Tipi di Supporto
I supporti costituiti da polimeri organici reticolati sono i più comuni:
 I due tipi di supporto per lo più usati nelle applicazioni sono:
•
•
poli(stirene-co-divinilbenzene) PS-DVB
2) poli(etilenglicol-co-stirene-co-divinilbenzene) PEG-PS-DVB
PS-DVB
PEG-PS-DVB
X
(CH2 )m -(OCH2 CH2 )n -OCH2 CH2 -X
PS
PS
X = Cl (Merrifield), OH, NH2
Dimensione:
Capacità
equivalente:
Compatibilità
chimica:
100-200 mesh (75-15 mm)
200-400 mesh (38-75 mm)
X = Br, OH, NH2, SH, COOH
100-200 mesh (75-15 mm)
0,2-0,5 mmol/g
0,5-4 mmol/g
DMF, DCM, THF,
Toluene.
Termicamente stabile
Incomplatibile con
solventi protici
Attilio Citterio
solventi protici
e non protici
Polistirene Reticolato
Il supporto polimerico più usato nella sintesi organica in fase solida è il
poli(stirene-co-divinilbenzene).
Il principale problema presentato da questo polimero per il suo impiego
in sintesi è la sua disomogeneità.
+
+
miscela commerciale
+
+
impurezze
Attilio Citterio
Origine della Disomogeneità
1. Differente reattività del m-DVB e del p-DVB:



Per quanto riguarda il primo gruppo vinile, l'isomero meta reagisce con lo
stirene più velocemente dell'isomero para.
Il p-DVB reagisce meglio con sé stesso (microstruttura densa).
Per quanto riguarda il secondo gruppo vinile, il m-DVB reagisce ad una
velocità simile a quella dello stirene, e si inserisce più regolarmente.
2. Modifiche del polimero dopo la sua sintesi:


Lavando il polimero con buoni solventi lo si secca con collasso dei pori.
Lavando il polimero con cattivi solventi lo si secca con pori più grandi.
Regioni omogenee
ma spaziate dal
monomero meta
Regioni dense
ricche in
monomero para
Attilio Citterio
Sintesi del Polistirene Reticolato
La tecnica preferita per la formazione di resine per sintesi è la
polimerizzazione in sospensione. Essa differisce dalle altre tecniche:



È un sistema bifasico : fase monomero (costituita dal monomero e dal
solvente organico –”porogeno”-) e la fase acquosa.
Utilizza uno stabilizzante come additivo: una miscela di sali inorganici e
specie organiche polari (polivinilalcol), per abbassare la tensione
superficiale delle gocce e inibire la loro aggregazione.
Produce delle sfere quasi perfette. formando gocce di monomero in fase
acquosa (sotto agitazione meccanica).
Attilio Citterio
Proprietà del Polistirene Reticolato
Il “Rigonfiamento” di un polimero reticolato
è equivalente alla solvatazione di un
polimero lineare:
 Il solvente penetra nel polimero
reticolato e occupa gli interstizi tra le
catene di polimero, facendo
aumentare il volume.
 La reticolazione del polimero crea
come una trama che previene il
movimento delle catene del polimero
necessarie a formare una soluzione.
 Il polimero rigonfiato è il reale solvente
della reazione in fase solida, ma
presenta un'alta viscosità.
• Non c'è relazione diretta tra la quantità e la cinetica della reazione di imbibizione.
• Il grado di reticolazione ha un grande impatto sulla capacità di imbibizione tramite
l'entropia configurazionale dissipata. Un'elevata reticolazione rende più rigido il
polimero, l'entropia dissipata è inferiore e l'imbibizione è difficile.
Attilio Citterio
Resine Polistireniche Derivatizzate
L'uso di Resine Polistireniche Derivatizzate è stato introdotto perché lo scheletro
alchilico è chimicamente inerte mentre gli anelli benzenici sono reattivi e si
possono modificare facilmente (per sostituzione elettrofila aromatica (per es.
clorometilazione) o sostituzione nucleofila (litiazioni)). Inoltre, sono disponibili
molti monomeri stirenici funzionalizzati poco costosi.
PS
A
+
CH3OCH2Cl
PS
Lewis acid
Lewis acid: SnCl4; ZnCl2; BF3.OEt3
costant behavior needs 19%Cl
+
B
+
GF
para-/orto-: 95:5
GF
Metodo A: ha il vantaggio di far reagire solo anelli e posizioni di ugual
accessibilità. Lo svantaggio è che le reazioni sono lente e difficili da seguire
con problemi di resa e sottoprodotti.
Metodo B: Assicura l'esatta posizione della funzionalizzazione e un altro
grado di sostituzione, ma richiede la sintesi di appropriati monomeri.
Attilio Citterio
Resine Polistireniche Derivatizzate
Ottenibili per funzionalizzazione del clorometilpolistirene:
O
1)
PS
O
N
7)
O
2)
3)
PS
9)
NH2
Cl
O
PS
4)
PS
12)
O
5)
PS
SH
CH3
CN
PS
10)
PS
COOH
PS
13)
PS
11)
CHO
CH3
COCl
PS
14)
6)
8)
S
PS
PS
PPh2
OH
1) Potassio ftalimmide, DMF; 2) NH2NH2, EtOH; 3) NH3, DCM; 4) KOAc, DMA, 85 ºC, 24h; 5) HAL,
etere, 4h; 6) KOH, 1-pentanolo, riflusso, 24h; 7) KSAc, DMF; 8) LiBH4, etere; 9) NaCN, DMF, H2O, 120
ºC, 20h; 10) H2SO4, AcOH, H2O, 120 ºC, 10h; 11) SOCl2, toluene, 110 ºC, 24h; 12) DMSO, NaHCO3,
155 ºC, 6h; 13) m-CPBA, DME, 55 ºC, 19h; 14) ClPPh2, Li, THF.
Attilio Citterio
Linkers nelle Sintesi SPOS
Altri leganti
OH
O
NHFmoc
OMe
OMe
O
linker
Rink acido
OMe
linker
Rink ammide
protetta
OMe
NHFmoc
O
Cl
linker
Sieber
protetto
Linker
Tritile
Attilio Citterio
O
Linkers nelle Sintesi SPOS
Linker a presa sicura
S
O R
stabile
OO
S
OO
S
O R
+ R-OH
base
labile
OH-
HNR1R2
R = H: stabile
+ CH2N2  R = CH3: labile
prodotto-COOH
prodotto-CONR1R2
Linker senza traccia (a presa sicura)
H
N
O
H
N
Cu(OAc)
N
H
NH2
Attilio Citterio
O
+
N2
+
R
Sintesi in Fase Solida : Gruppi Protettori
I gruppi protettori usati nella sintesi in fase solida sono pochi.
 Per ammine.
 Boc (t-butossicarbonile)
 Fmoc (9-fluorenilmetossicarbonile)
 Tmsec (2-[ trimetilsilil ]etossicarbonile)
 Per acidi carbossilici.
 Tert-Butil estere (t-butil estere)
 Fm estere (9-fluorenilmetil estere)
 Tmse estere (2-[trimetilsilil]etil estere)
Attilio Citterio
Sintesi in Fase Solida di Peptidi - Stadi Coinvolti
1. L'amminoacido N-protetto (Boc
o Fmoc) è attaccato alla resina
mediante il terminale C
2. Deproteggere il terminale N
3. Accoppiare: Aggiungere la
soluzione del successivo
amminoacido. Lasciare
reagire, lavare.
4. Ripetere la deprotezione ed
accoppiare con ogni
monomero successivo
5. Staccare il peptide dalla resina
Nota: sintetizzare da C a N
Cl C H 2
R = polistirene eticolato
R
H
+
BOC N H C CO2- Cs
R1
H O
BOC N H C C O C H 2
R1
Deprotto e neutralizzato con
diisopropiletilammina (DIEA)
1) TFA
2) DIEA
H O
H 2N C C O C H 2
R1
Accoppiamento
R
1) Boc-NH-CHR2-COOH
2) DCC, HOBt
H O
H O
BOC N H C C N H C C O C H 2
R2
R1
Distacco del gruppo protettivo
e del dipeptide dalla resina
R
R
1) HF
2) Purificato via HPLC
H O
H O
H 2N C C N H C C O H
R2
R1
dipeptide
Schema basato sulla metodologia Merrifield per SPPS basati su Boc
Attilio Citterio
Sintesi in Fase Solida
di Peptidi
Attivazione
Sbloccaggio
Accoppiamento
Ripetere gli stadi ad ogni
aggiunta di amminoacido
Sblocco finale
Resina
Amminoacido 1
Rottura e
deprotezione
Amminoacido 2
Gruppo protettore
Fmoc
Attivatore
Peptide sbloccato (prodotto finale)
Attilio Citterio
Gruppo protettore
in catena (1)
Gruppo protettore
in catena (2)
Chimica Organica in Fase Soluzione (Array)
Più composti significa meno tempo per composto
Ciò richiede:





Buone procedure generalizzate
Corte sequenze sintetiche
Reazioni ad alta resa
Aggiunta stechiometrica di reagenti
Richiede lo sviluppo di lavorazioni e metodi di purificazioni in parallelo
I prodotti sono solubili





I sottoprodotti e i reagenti in eccesso sono anch'essi solubili e si
accumulano ad ogni stadio
L'analisi diretta è molto più facile (tlc, nmr, ms, hplc, lc/ms)
Le cinetiche sono uniformi e familiari
Si può usare reagenti per fase solida (SPR’s)
Non è richiesto nessun linkers, meno chimica escluda.
Attilio Citterio
Chimica Organica in Fase Soluzione (Array)
Reazioni di Condensazione a Componenti Multipli
R1CHO
Biginelli
R1CHO
R5NC
R2NH2
Ugi
R1CHO
Grieco
Kobayashi
Armstrong, R.W., Combs, A.P., Tempest, P.A., Brown, S.D., & Keating, T.A. Acc.. Chem. Res.,
29, 123-131 (1996).
Attilio Citterio
Tendenze negli Ultimi Anni
Sld P S&M
Sld P Array
10,000+
Solu P Array
2004
N° di
Composti
1000+
Solu P Array
1996
Sintesi
Organica
Classica
0
tempo
Gli Array in Fase Soluzione o
Sintesi Parallele ora dominano
tempo per la
fase soliida
Attilio Citterio
Apparati Commerciali per la SPOS
Apparati Completi
Argonaut
Quest 210
Nautilus 2400
Trident
Modelli
base
FlexChem
www.robsci.com
www.scigene.com
MiniBlock
www.bohdan.com
www.Autochem.com
Bohdan Ram
Tecan Combitec
Advanced Chemtech
496
Myriad Core
Polyfiltronics/Whatman
www.whatman.com
Charybdis Technologies
www.spike.cc
Attilio Citterio
Metodi di Purificazione
Fase Solida
 Lavare esaustivamente
 Distacco dipendente dal Prodotto
Fase Soluzione – Purificazione Parallela
 Estrazione
• liquido-liquido, acido/base
• SPE, resine bloccanti
• Sintesi Fluorosa
 Cromatografia
 MIP (molecular imprinted polymers)
Attilio Citterio
Resine Bloccanti
O
N H2
R C N O
1.5 eq.
+
CHCl3, RT, 3h
R1
N
H
C
O
1 eq.
N
H
H 2N R'
N
H
R2
N
H
R1
S. W. Kaldor, J. E. Fritz, J. Tang, E. R. McKinney, Biorganic & Med. Chem. Lett.,
6, 3041-3044 (1996).
Attilio Citterio
Sintesi Fluorosa
O
N
O
Fase Fluorosa (C6F12)
Fase Acquosa
O
S
+
O
–
Br
Sostituire le resine
con sostituenti
fluorurati
Fase alocarburica (CH2Cl2)
D. P. Curran, M. Hoshino, J. Org. Chem., 1996, 61, 6480-6481.
D. P. Curran and Z. Luo, Fluorous Synthesis with Fewer Fluorines (Light Fluorous Synthesis):
Separation of Tagged from Untagged Products by Solid-Phase Extraction with Fluorous Reverse Phase
Silica Gel, J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 9069.
http://fluorous.com
Attilio Citterio
School of Industrial and Information Engineering
Course 096125 (095857)
Introduction to Green and Sustainable Chemistry
A.A. 2015/2016
Sintesi Parallele
Prof. Attilio Citterio
Dipartimento CMIC “Giulio Natta”
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Sintesi Parallele
Obiettivi
• Usare una via sintetica standard per produrre una gamma di analoghi,
con un differente analogo in ogni recipiente di reazione,
• L'identità di ogni struttura è nota
• Utile per produrre un'ampia gamma di analoghi pe SAR o
ottimizzazione di prodotto (farmaco)
Sintesi parallela automatizzata
Sono disponibili sintetizzatori automatici con 42, 96 o 144 recipienti di
reazione o postazioni
• Usano palline o spilli per supporto in fase solida
• Le reazioni e le lavorazioni sono condotte automaticamente
• Alcune vie sintetiche usate per ogni recipiente, ma diversi reagenti
• Si ottengono prodotti differenti in ogni recipiente
Attilio Citterio
Attrezzature per la CC
L’apparecchiatura varia molto dalla
tradizionale di “sintesi organica”.
‘personal synthesizer’ da 24
posizioni basati sulla chimica per
reagenti in soluzione e supportati su
solidi (tubi da 0.3 - 3 ml) che
consente un veloce trasferimento
via robot a 24 piatti per bioassaggi.
Stazione di reazione a 6 posti che
opera con reazioni da 6 H 100 ml in
parallelo con agitazione,
riscaldamento, sotto vuoto o in
pressione. Ideale per la sintesi
parallela di precursori rilevanti
Attilio Citterio
Purificazioni in CC
Sistema per purificazioni parallele di
Stacker.
Contenitore a 24 postazioni che
consente di effettuare filtrazioni,
separazioni di fasi e tecniche di
estrazioni in Fase Solida (SPE).
Opera in abbinamento con i
sintetizzatori paralleli personali.
Attilio Citterio
Sintesi Parallele
Sintesi simultanea di molti prodotti in differenti
recipienti di reazione con l’aiuto dell’automazione.
(aumento della produttività di 100-volte o più)
Ogni pozzetto contiene un composto, e si può
identificare dalla sua posizione sulla griglia
Es.: Sintesi parallele di una libreria a 96-membri di
dipeptidi in un piatto per micro titolazioni ad 8 righe
e 12 colonne. (vista parziale)

Fase 1: ogni riga parte con un diverso
amminoacido legato ad un supporto
 Fase 2: ogni colonna aggiunge un secondo
amminoacido diverso. (si hanno 96 differenti
dipeptidi)
 Fase 3: Rimuovere i dipeptidi dal supporto
 Fase 4: Testare ogni scomparto per l’attività
biologica.
Attilio Citterio
Ala, A
A
A
A
Val, V
V
V
V
Gly, G
G
G
G
Ala, A
I A
S A
F A
Val, V
I V
S V
F V
Gly, G
I G
S G
F G
I‒A
S‒A
F‒A
Val, V
I‒V
S‒V
F‒V
Gly, G
I‒G
S‒G
F‒G
Ala, A
1 Stadio
2 Stadio
3 Stadio
Sintetizzatore per Sintesi Automatizzata in Soluzione
1. Sistema ISRA
• Requisiti: Tutte le procedure di
una sintesi di laboratorio
devono essere automatizzate:
• pesatura, sintesi, lavorazione,
analisi HPLC, diario di lab.
• L'automazione di tale processo
completo è estremamente
difficile. Nessuna soluzione
commerciale.
• Vantaggio: completamente
automatico, sintesi parallele
laboratorio, operativo 24 h al
giorno
7 Asta di trasfer. lid
1 robot
8 magazzino lid
2 HPLC
9 stazione essic.
3 sostegno iniziale
10 colonne essic.
4 sostegno per filtro
5 stazione di filtrazione 11 sostegno freddo
12 bilancia
6 stazione di chiusura
sintesi
13 separazione di fase
14 rivelatore di fase
15 centrifuga
16 stazione hand over
17 evaporatore
18 blocchi reazione
Lavorazione
Attilio Citterio
Analisi
19 stazione pipet.
20 supporto reagenti
21 supporto reagenti
22 HPLC-transfer
23 stazione vortexer
Robot per Trattamento Liquidi
10 mL Loop
Deviatori
Baccio
Robotico
Valvola a 6-Vie
X Puntale
Y
Z
Sistema Solvente
Siringhe
Attilio Citterio
Filtrazione
• Rimozione sali
• Cattura di
composti covalenti
e Ionici
• Rimozione Resina
Teste dei
Robot
Piatto filtrante
Piatto Sorgente
Attilio Citterio
Piatto di Destinazione
Estrazioni
Liquido-Liquido
1
1. Estrattore posizionale a
Solvente Pesante
2. Estrattore posizionale a
Solvente Leggero
3. Rivelatore di Liquido
nell'estrazione a
Solvente Leggero
Attilio Citterio
2
1
3-1 3-2 3-3
2
3
Cromatografia e SPE
• Gel di Silice
• Gel di Silice Fluoroso
C18
• Scambio Ionico
1. Scioglie i campioni in 2. Trasferisce a
un adatto solvente
piccole
cromatografiche
Attilio Citterio
3. Eluisce i prodotti
puliti e/o raccoglie
le frazioni
Depositore Robotico per Piatti da TLC
Macchie rivelate
Attilio Citterio
Ottimizzazioni di Reazioni e Chimica
Combinatoriale
• Combinatorial Methods for High-Throughput Materials Science,
MRS Proceedings Volume 1024E, Fall 2007
• "Design, Synthesis, and Evaluation of Small-Molecule Libraries.”
Ellman, J. A. Acc. Chem. Res. 1996, 29, 132 -143.
• Combinatorial Chemistry, Nicholas K. Terrett, Oxford University
Press, London, 1998
• Combinatorial methods for development of sensing materials,
Springer, 2009. ISBN 978-0-387-73712-6
• QSAR and Combinatorial Science, 24, Number 1 (Feb. 2005)
Attilio Citterio
Migliori Processi – Più Controlli
anche in Fase di Sviluppo
PC
INTERFACCIA
ELETTRONICA

SINTESI
PARALLELE
REATTORI SU SCALA
DA BANCO e PILOTA
Attilio Citterio
REATTORI
ADIABATICI
Chimica Semi Batch
 Sistemi più comuni.
 Alimentazione dei liquidi
automatizzata, controllo di
T, P e agitazione
distillazione liquidi.
 Interfaccia utente: flessibile,
vari sensori
 Utili per analisi
termodinamiche e di
sicurezza (calorimetria,
reazioni fuggitive)
Attilio Citterio
Controllo in Tempo Reale
Tabellare
Quadro
MIMIC + Dati
Visione
Grafica
Attilio Citterio
Controllo
Unità su Scala Pilota
 Reattore per alte pressioni da 20 L.
 Continuo e Semi-batch con varie
alimentazioni di:
- liquidi volatili
- composti piroforici
- gas infiammabili
PARR
 Prerogative
- a prova di esplosione
 Interfaccia standard.
 Sistemi di reattori tubulari sono
modulabili e di varie dimensioni e
diametri, ingegnerizzati per varie
pressioni e temperature.
Attilio Citterio
Progettazione Fattoriale (Disegni Sperimentali)
nell'Ottimizzazione di Processi Chimici
3
2.5
Disegni sperimentali:
2
4
2
2
• Progettazione fattoriale completa
con repliche
vs.
• ANOVA ad Un-Fattore :
• Separa la variazione totale
osservata in una serie di misure in:
6
4
6
1.5
2
local
minimum
1
0
4
2
2
-2
0.5
0
0
-0.5
2
2
-1
-2
0
-4
-6
-1.5
-2
-2
0
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
local
minimum
•
•
Variazione in un sistema
• Dovute a errori random di
misura
Variazione tra i sistemi
• Dovute alle reali differenze +
errore random
• E' la variazione(2) statisticamente >
variazione(1)?
• Disegno sperimentare a Un-fattore
Attilio Citterio
School of Industrial and Information Engineering
Course 096125 (095857)
Introduction to Green and Sustainable Chemistry
A.A. 2015/2016
Chimica Sintetica Combinatoriale
Prof. Attilio Citterio
Dipartimento CMIC “Giulio Natta”
http://ISCaMaP.chem.polimi.it/citterio/
Chimica Combinatoriale:
Esplorazione della Diversità Molecolare
Consiste nella progettazione e preparazione di “librerie” (“libraries”) di
prodotti a struttura simile, basate su di una molecola modello (“lead”), in
modo da poter verificarne le proprietà biologiche e nella ottimizzazione
delle stesse nello sviluppo di nuovi farmaci per l’industria farmaceutica.
Si tratta di una strategia con cui si possono preparare potenzialmente un
gran numero di composti in modo rapido e simultaneo (“libraries”), oltre
che singoli prodotti (“parallel synthesis”) o come miscele di essi
(“combinatorial synthesis”), mediante la combinazione di un gruppo o
gruppi di reattivi in solo pochi stadi sintetici consistenti in trattamenti di
dissoluzione o adsorbimento in fase solida, che permette una
delucidazione strutturale rapida (“deconvolution and tagging”), un
riconoscimento accelerato delle relazioni struttura-attività (“SAR”) e la
possibilità di automatizzazione.
Tecnica inventata nei tardi anni 1980 e inizio anni 1990.
Attilio Citterio
Approccio alla Sintesi Combinatoriale
Identificazione di un
Target Biologico
+
Sviluppo di un saggio
Screening ad alto
rendimento
Selezione
Struttura capofila
Librerie Random
Chimica Combinatoriale
Librarie Mirate
Ottimizzazione capofila
Sviluppo
Attilio Citterio
+
Sintesi Combinatoriali
•
Si effettuano reazioni multiple in un unico recipiente, generando un’ampia
varietà di diversi prodotti noti come libreria combinatoriale. Normalmente la
reazione è la stessa, ma i reagenti sono differenti. Il numero dei composti
possibili è: b·x (x = N° degli stadi)
•
Progettazione della sintesi combinatoriale: sequenziale (a) o templata (b)
A
A
B
C
templato
Libraria Lineare
B
Libraria a Templato
C
•
La generazione sintetica della diversità molecolare era concettualmente e
sperimentalmente radicata nella sintesi in fase solida di peptidi: La sua
estensione ad altre classi di molecole organiche si è avuta solo dopo il 1990.
Attilio Citterio
Sintesi Combinatoriali
Fonti di Diversità Chimica :
Nessuna variazione
consentita
illimitata!
Attilio Citterio
Sintesi Combiatoriale Mista
Obiettivi:
• Usare una via sintetica standard per produrre un'ampia gamma di
diversi analoghi dove ciascun recipiente di reazione contiene una
miscela di prodotti
• Le identità delle strutture in ogni recipiente non sono note con
certezza
• Utile per trovare un composto capostipite
• Capace di sintetizzare un gran numero di composti velocemente
• Ogni miscela è testata per l'attività come miscela
• Le miscele inattive sono conservate in librerie combinatoriali
• Le miscele attive sono studiate ulteriormente per identificare il/i
componenti attivi.
Attilio Citterio
Approccio Cambinatoriale
Sintesi combinatoriale
Sintesi tradizionale
A
+
B
AB
A1
B1
A2
B2
A3
B3
.
.
.
.
An
Bm
A1
A2
An
n H m prodotti
 1 chimico =
50 composti/l’anno
B1 B2
 103-104 composti/esperimento
Attilio Citterio
Bm
Approccio Combinatoriale (2)
Screening ad alta
efficienza che usa
Metodi
Combinatoriali
Vaglio di Primo Stadio
Test per solo una o due
proprietà
100-1000
campioni
alla set.
10-100
campioni
alla settimana
Screening
convenzionale
che usa Metodi
Consolidati
1-10
campioni
alla settimana
1-2 campioni
al mese
Attilio Citterio
Vaglio di Secondo Stadio
Test per altre proprietà chiave
Materiali Rapidamente
Identificati
Campioni con proprietà attese
Candidati per Scale-up
I materiali più promettenti si usano
in esperimenti su scala pilota
Sintesi Combiatoriale Mista
La procedura del Metodo Combinatoriale "Mix and Split" implica cinque sintesi
separate usando come strategia quella di mescolare e separare.
Esempio - Sintesi di tutti i possibili tripeptide usano 3 amminoacidi (i metodi di
Standard avrebbe implicato 25 sintesi separate).
Lam, K. S.; Lebl, M.; Krchn¡ak, V. The
“One-Bead-One-Compound”
Combinatorial Library Method. Chem.
Rev. 1997, 97, 411-448.
“Separare"
"Accoppiare"
RIUNIRE
"Ricombinare"
RIUNIRE
27 tripeptidi
Numero di leganti = Nn dove N=numero di molecole di riferimento & n =
numero di cicli; Quando N=100 e n=6: 1,000,000,000,000 possibili strutture
Attilio Citterio
Metodo Pin di Geysen (per Sintesi Parallele di Peptidi)
Resine legate a spilli in un
formato a batteria 8  12
Reagenti o solventi di
lavaggio in un piatto da 96
postazioni
Immergere per fare le
reazioni o lavare le resine
Kit disponibile
www.mimotopes.com
Attilio Citterio
Tecnica delle Bustine da Te per la Sintesi
Parallela di Peptidi
Richard A. Houghten, PNAS USA 1985, 82, 5131-5135
LATO
FRONTE
Lavaggio e deprotezione:
condotte assieme
Chiusura
Accoppiamento:
Separare le bustine
raggruppando in base all'AA
da accoppiare.
Ogni gruppo è accoppiato
separatamente
Apertura
a rete
Resina
Etichetta
Attilio Citterio
Tecnica SPOT per la Sintesi Parallela di Oligonucleotidi
Ronald Frank et al. Nucl. Acids Res. 1983, 11, 4365-4377
Metodo del disco a filtra : un oligo per disco
lavaggio, deprotezione e ossidazione:
Tutto assieme
Accoppiamento:
Inserire i dischi in quattro contenitori differenti
contenenti i precursori dA, dC, dT, dG
In base alla sequenza oligo di ogni disco.
Metodo SPOT : un oligo per disco
lavaggio, deprotezione e ossidazione:
Tutto assieme
Accoppiamento:
Pipettare la soluzione di accoppiamento
contenente i precursori dA, dC, dT, dG nei
dischi in base alla sequenza.
Attilio Citterio
Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Scaffolds
•
•
Per esplorare lo spazio conformazionale si usano preferibilmente gli
‘Spider’ scaffolds
Consentono di variare i gruppi funzionali attorno alla molecola per
aumentare la probabilità di trovare adatte interazioni di legame a H
regioni di
legame
SITO di
LEGAME
DEL
RECETTORE
Esplorazione della
libreria di composti
Il peso molecolare degli scaffold deve essere abbastanza basso da
permettere delle variazioni di funzionalità, senza dare prodotti con MW > 500.
Attilio Citterio
Pianificazione di Sintesi Combinatoriali: Scaffolds
Scaffolds Tadpole
• variazione limitata a una specifica regione attorni alla molecola
• Minore probabilità di interazioni favorevoli con un sito di legame
'Spider' Scaffold con
sostituenti 'dispersi'
'Tadpole' scaffold con
sostituenti 'addensati'
Scaffolds Privilegiati
• scaffolds che sono comuni in chimica farmaceutica e che sono
associati con diversi intervalli di attività
• benzodiazepine, idantoine, benzenesolfonammidi, ecc..
Attilio Citterio
Pianificazione di Sintesi Combinatoriali:
Esempi di Librerie di Scaffold
O
R
Me
O
HOOC
R'
R2
N
X
R
Ar
Benzodiazepine
Dipeptidi
Idantoine
•
•
•
•
-Lattami
N
R3
Piridine
Buoni scaffolds
Tipo Spider
Basso peso molecolare
Varietà di vie sintetiche disponibili
Attilio Citterio
Pianificazione di Sintesi Combinatoriali:
Scaffolds - cattivi esempi
H
R5 O
H
C
R4 O
C
H
C
O
H
O R3
H
C
C
H
O R2
H
C
O R1
Tipo Spider e basso MW - buone premesse
Ma gruppi OH multipli
Difficile variare R1-R5 indipendentemente
Glucosio
MW relativamente alto
Limitato N° di gruppi funzionali per avere MW < 500
Relativamente poche posizioni su cui legare
facilmente i sostituenti
Steroide
Scaffold tipo Tadpole
Ristretta regione di variabilità
Indolo
Attilio Citterio
Chimica Combinatoriale
Ricerca bersaglio
Libreria Random
Ricerca capostipite
HTS: 1° Bersaglio
Libreria Mirata
Struttura Bersaglio
O
O
O
H 2N
R1
HN
S
O
H 2N
N
H
S
O
HN
R2
S
O
HN
R3
Cl
5000 composti
EC50 10 M
F
500 composti
EC50 20 nM
Programma Finale di Ottimizzazione
Attilio Citterio
Chimica Combinatoria Dinamica:
Esempio - Leganti per l'anidrasi carbonica
• Reazione - formazione reversibile di immine
Aldeide
Aimmna primaria
Immina
• Reazione condotta in presenza di anidrasi carbonica
• Tre aldeidi e quattro ammine presenti come precursori modello
• Il sodio cianoboroidruro aggiunto per ‘congelare’ la miscela
NaBH3CN
Ammina secondaria
Immina
•
•
•
Prodotti quantificati e identificati
Gli esperimenti sono ripetuti in assenza del target per identificare il
prodotto(i) amplificati
Il prodotto amplificato non è necessariamente presente in grandi
quantità
Attilio Citterio
Chimica Combinatoria Dinamica:
Esempio - Leganti per l'anidrasi carbonica
Substrati modello indagati
HO2 C
O
CHO
H
N
H 2N
HO2 C
Aldeidi
ammine
prodotto amplificato
NaBH3CN
Composto Attivo
Ammina secondaria Derivata
Attilio Citterio
Screening ad Alta Produttività
Sistemi di screening molecolare
•
Parametro da misurare: Legame
recettore
anticorpo
DNA
•
legante
antigene
proteina che lega il DNA
Riduzionismo:
esplorazione di problemi complessi
per riduzione a parti semplici
Animali
Organi
Tessuti
Parametro da misurare: funzione enzimatica
Cellule
Turnover del substrato
Modificazione di una molecola target
Organelli
Molec
ole
Sistemi di screening subcellulari
Interazioni o saggi enzimatici con componenti subcellulari quali
Preparazioni di membrane o frazioni cellulari
Sistemi di screening cellulari
•
Parametri da misurare: Eventi Cellulari
Secrezione
Attivazione di flussi intracellulari di ioni
Generazione di molecole messaggere
Stimolo dell'espressione genica
Attilio Citterio
Significativamente più complesso
CC Bibliografia
1. Comprehensive survey of combinatorial library synthesis: 1998, 1999, 2000, And 2001,
2002, 2004, 2005, 2006, J. Comb. Chem.
2. Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries, A Handbook, Ed. Gunther Jung, 1996,
VCH, Weinheim, New York, Basel
3. Combinatorial chemistry : synthesis and application / edited by Stephen R. Wilson,
Anthony W. Czarnik. New York ; Chichester : Wiley, 1997.
4. Combinatorial Chemistry and Molecular Diversity in Drug Discovery; Gordon, E. M.;
Kerwin, J. F., Eds.; Wiley-Liss: New York, NY, 1998.
5. Combinatorial Chemistry-Synthesis, Analysis, Screening, Ed. Gunther Jung, Wiley-VCH
Verlag GmbH, Weinheim, 1999.
6. Combinatorial strategies in biology and chemistry / Annette Beck-Sickinger, Peter
Weber, translated by Michael Soderman and Allan Wier. New York : Wiley, 2002.
7. Experimental design for combinatorial and high throughput materials development /
James N. Cawse. New York, Chichester : Wiley, 2002.
8. Sherrington, D. C. (2001). "Polymer-supported reagents, catalysts, and sorbents:
Evolution and exploitation - A personalized view.“ Journal of Polymer Science Part aPolymer Chemistry 39(14): 2364-2377.
9. D. Hudson. Matrix assisted synthetic transformation: a mosaic of diverse Contributions.
II. The pattern is completed. J. Comb. Chem. 1999, 1, 403-457.
Attilio Citterio