Pruning sinaptico e ruolo dell’interazione neurone-glia Ilaria Chiaradia, Federica Rossi, Francesca Stabile
1.1. Introduzione
Alla nascita, la corteccia cerebrale umana conta circa 100 miliardi di neuroni. Dai primi stadi dello
sviluppo embrionale, fino a circa due anni d’età, il peso del cervello aumenta significativamente,
superando di 5 volte il peso iniziale e tale fenomeno è dovuto non tanto ad un aumento del numero
di neuroni, ma ad una crescita esponenziale del numero di sinapsi, nota come exuberant
synaptogenesis (Huttenlocher & Drabholkar, 1998), che porta ad un eccesso di sinapsi
funzionalmente non richieste. Synaptic pruning è il processo per cui le sinapsi in eccesso vengono
eliminate, aumentando l’efficienza del network neurale. Al decimo anno d’età, circa il 50 % delle
sinapsi presenti a due anni di vita sono state eliminate (Kolb & Whishaw, 2003) ed altre ne verranno
eliminate durante l’età adolescenziale. Questo processo ancora poco conosciuto prevede la
fondamentale interazione neurone-glia. E’ nota la proprietà degli astrociti nel SNC e delle cellule di
Schwann nel SNP di secernere molecole per favorire la formazione di contatti sinaptici durante lo
sviluppo embrionale, come trombospondine (Christopherson et al., 2005), glipicani (Allen et al.,
2012) o ancora TGF-beta promuovente la sinaptogenesi a livello della giunzione neuromuscolare
(Feng and Ko, 2008). Il processo di Synaptic pruning richiede due step principali:
1) SELEZIONE della sinapsi da eliminare, sinapsi con una debole attività di trasmissione e che non
sia stata potenziata da fenomeni di long term potentiation (LTP).
2) RIMOZIONE DELLA SINAPSI ed, eventualmente dell’assone. Richiede il contributo della glia,
in particolare dell’attività fagocitica delle cellule di Schwann perisinaptiche e della microglia, che
rimuovono i detriti dell’axosome shedding (Bishop et al., 2004). In aggiunta aumenta l’attività
lisosomale intrinseca del neurone (Song et al., 2008).
Fig.1 Step del processo di pruning
1.2. Ruolo dell’interazione neurone-glia nel pruning dei circuiti del SNC
Il raffinamento delle sinapsi glutammatergiche del SNC è stato ampiamente studiato nelle cellule
del Purkinje del cervelletto, le quali accolgono, sul loro albero dendritico, 300 sinapsi
glutammatergiche stabilite dalle fibre rampicanti. Ma durante il periodo post-natale si passa dalla
pluri innervazione alla mono innervazione, raffinamento operato sulla base della loro plasticità
calcio dipendente e del timing dei loro spike (Kawamura et al., 2013). I processi della glia di
Bergmann avvolgono la vasta maggioranza di tali sinapsi eccitatorie, partecipando ad un continuo
processo di raffinamento delle connessioni sinaptiche, tant’è che nel periodo post-natale aumenta
proprio la complessità dei processi della glia di Bergmann (Lippman et al., 2008). La riprova è stato
dimostrare che se ai recettori AMPA della glia di Bergmann viene aggiunta la subunità GluR2, che
li rende impermeabili al calcio, le cellule del Purkinje rimarranno innervate da più di una fibra
rampicante (Iino et al., 2001), in quanto GluR2 provoca la ritrazione del prolungamento gliale dalla
sinapsi.
1.3. Ruolo dell’interazione neurone-glia nel pruning dei circuiti del SNP
La fibra muscolare riceve innervazione multipla da diversi motoneuroni dopo la nascita, ma
gradualmente passa ad essere innervata da una sola fibra assonale, grazie al processo di pruning. E’
prevista una selezione dell’assone “vincitore” in base all’efficienza di attivazione della fibra
muscolare: motoneuroni che trasmettono l’impulso elettrico al muscolo più efficacemente, in modo
da determinare la sua contrazione, tendenzialmente non saranno eliminati (Buffelli et al., 2003).
Non solo, le sinapsi neuromuscolari sono rafforzate, stabilizzate dal legame al BDNF maturo
(Lohof et al., 1993), mentre il proBDNF è un segnale di ritrazione dell’assone. L’attività sinaptica è
molto importante perché permette di convertire il proBDNF in mBDNF. Il BDNF è prodotto soprattutto dalle cellule di Schwann perisinaptiche, le quali percepiscono
l’attività sinaptica, legando il neurotrasmettitore rilasciato dal motoneurone, il quale evoca il
rilascio di Ca2+ nella cellula di Schwann (Jahromi et al., 1992). In seguito all’aumento della
concentrazione di Ca2+ libero intracellulare, la cellula di Schwann perisinaptica può rilasciare
neurotrofine come NGF, BDNF, TGF-1 (Feng and Ko, 2008) che consolidano il contatto sinaptico,
oppure molecole come SPARC, che inducono un programma di eliminazione sinaptica a carico del
neurone (López-Murcia et al., 2015). Come risultato, questo particolare tipo di Schwann monitora
costantemente la forza delle sinapsi in competizione sulla fibra muscolare e può individuare le
sinapsi da eliminare (Darabid et al., 2014). Considerando la varietà di molecole secrete dalla glia,
presenti nel microambiente sinaptico, è possibile che questo gradiente influenzi il destino dei
contatti sinaptici.
2. Fasi dell’eliminazione sinaptica: funzioni coordinate dei neuroni e della glia
Per descrivere il meccanismo con cui la glia raffina le connessioni sinaptiche postnatali, sono stati
proposti due modelli: nel modello a due fasi, il pruning dei contatti sinaptici avviene tramite
fagocitosi delle cellule gliali a seguito di una fase di tagging attività-dipendente (Schafer and
Stevens, 2013); nel modello a tre fasi, viene aggiunta una fase intermedia di disassemblaggio
irreversibile.
1) TAGGING: I contatti sinaptici stabiliti durante lo sviluppo embrionale vengono selezionati per
l’eliminazione; una bassa attività di “firing” dei neuroni presinaptici e la generazione di basse
risposte postsinaptiche fungono da segnali marcatori delle sinapsi più deboli.
2) DISASSEMBLAGGIO IRREVERSIBILE: Le sinapsi marcate perdono la loro struttura
funzionale; un decremento nella forza sinaptica è associato alla perdita di funzione delle zone attive
(López-Murcia et al., 2015), alla formazione di corpi multivescicolari (Bishop et al., 2004) e
all’aumento dell’attività lisosomiale nei terminali (Song et al., 2008).
3) ELIMINAZIONE DEI RESTI SINAPTICI E FAGOCITOSI: Porzioni dei terminali sinaptici
vengono digerite nei compartimenti lisosomiali nei neuroni e/o fagocitati dalle cellule della glia; la
glia di Bergmann, gli astrociti e le cellule di Schwann perisinaptiche agiscono rispettivamente nel
cervelletto, nel nucleo genicolato e nella giunzione neuromuscolare.
I neuroni sono in grado di digerire le sinapsi retratte all’interno dei compartimenti neuronali (Riley,
1981); è stato infatti osservato un aumento dell’attività lisosomiale nelle regioni del sistema nervoso
in via di sviluppo che vanno incontro al pruning degli assoni. La giunzione neuromuscolare fornisce
prove che i percorsi neuronale e gliale possano coesistere: durante lo sviluppo, nella fase
dell’eliminazione sinaptica, c’è un aumento dell’attività lisosomiale nei neuroni, ma al tempo stesso
l’attività di fagocitosi delle cellule gliali sembra aiutare i neuroni nel corso del processo del
diradamento assonale. È possibile che più di un meccanismo di digestione avvenga in un periodo di
tempo limitato al fine di aumentare l’efficienza della rimozione. Meccanismi analoghi a quelli che
avvengono a livello della giunzione neuromuscolare sembrano operare anche nelle cellule di
Purkinje e nella glia di Bergmann del cervelletto (Song et al.,2008).
3. Glia e SNP
Molteplici studi prendono come modello la giunzione neuromuscolare. Durante le prime fasi, una
singola giunzione neuromuscolare è innervata da assoni di molteplici motoneuroni; questi vari input
vengono poi sfoltiti e rimarrà solo un assone il cui legame verrà fortificato. Un noto regolatore di
questo processo è l’attività neurale: gli input sinaptici più attivi hanno una maggiore probabilità di
permanere, mentre quelli con attività più debole verranno eliminati (Balice et al., 1994). Gli assoni
destinati all’eliminazione formano bulbi di retrazione contenenti materiale sinaptico di
degenerazione, gli assosomi. In questo processo, le cellule di Schwann avvolgono i bulbi di
retrazione inghiottonendo gli assosomi. I flussi intracellulari di calcio nelle cellule di Schwann
riflettono la forza sinaptica relativa delle innervazioni terminali che competono per lo stesso
territorio postsinaptico, suggerendo che le cellule di Schwann sono in grado di percepire la forza
relativa delle sinapsi.
3.1 Glia e pruning di circuiti sinaptici locali
La glia gioca un ruolo chiave anche nel pruning di circuiti sinaptici locali; questa più localizzata
eliminazione sinaptica avviene in assenza di una significativa degenerazione e coinvolge
l’eliminazione di terminali presinaptici in eccesso e/o spine dendritiche postsinaptiche (Luo et al.,
2005). I processi microgliali ispezionano attivamente l’ambiente extracellulare nel cervello: la
microglia interagisce con elementi sinaptici nell’ambiente extracellulare in modo dipendente
dall’attivazione neurale spontanea e guidata dall’esperienza. Per indagare su come l’esperienza
sensoriale regoli le interazioni tra sinapsi e microglia durante lo sviluppo, gli autori hanno utilizzato
la corteccia visiva primaria giovanile di topo: la microglia è stata vista contattare prevalentemente
spine dendritiche di minori dimensioni. Per testare i cambiamenti esperienza-dipendenti nelle
interazioni tra sinapsi e microglia, i topi venivano posizionati al buio durante il periodo di sviluppo
critico V1, e venivano in seguito esposti nuovamente alla luce: era possibile osservare la microglia
contattare più frequentemente gli elementi sinaptici in risposta a cambiamenti dell’esperienza
visiva, in comparazione con topi di controllo allevati in ambiente luminoso (Tremblay et al., 2010).
Molteplici evidenze affermano l’esistenza di molecole correlate con il sistema immunitario
coinvolte nel pruning sinaptico; tra queste troviamo C1q e C3, opsine che marcano il materiale
cellulare indesiderato per portarlo alla rimozione. È stato ipotizzato che queste due molecole
potrebbero marcare le sinapsi per la loro rimozione nel corso dello sviluppo del cervello, sinapsi che
poi verranno eliminate dalla microglia. Questi dati sono stati confermati da studi eseguiti su cellule
ganglionari retiniche di topo: topi mancanti della molecola C3 presentavano una riduzione del 50%
nella capacità della microglia di inghiottire gli input presinaptici (Alexander et al., 2012)
4. Molecole medianti la comunicazione tra neurone e glia durante il pruning
Le molecole secrete dalla glia sembrano essere particolarmente rilevanti nel condizionare la stabilità
sinaptica durante lo sviluppo post-embrionale: la produzione di SPARC da parte della glia periferica
è massima durante il raffinamento della connettività nelle giunzioni neuromuscolari (López-Murcia
et al., 2015). Al raggiungimento di un livello critico di concentrazione della proteina nello spazio
perisinaptico, i contatti sinaptici iniziano un processo di disassemblaggio. L’abilità delle cellule
della glia di modificare il citoscheletro dei neuroni durante lo sviluppo post-natale del sistema
nervoso periferico è anche esplicata attraverso l’espressione di neurofascina-155 da parte delle
cellule di Schwann: questa proteina è richiesta per una corretta distribuzione delle componenti
costituenti i neurofilamenti delle porzioni distali degli assoni motori ed è responsabile del timing
corretto per l’eliminazione della sinapsi (Roche et al., 2014).
5. Bulbo olfattivo: un caso particolare di rimodellamento delle sinapsi.
Nel bulbo olfattivo non è necessaria un’eliminazione delle sinapsi in fase post-natale per il corretto
processamento delle informazioni, la percezione degli odori è dovuta ai neuroni sensitivi localizzati
nell’epitelio olfattivo, questi estendono i loro assoni fino al bulbo olfattivo per formare sinapsi con
le mitral cells in strutture specializzate note come glomeruli. Nel bulbo olfattivo si verifica una
continua crescita durante lo sviluppo post-natale che risulta in un incremento di 4 o 5 volte del
numero dei glomeruli (Pomeroy et al., 1990). A modulare le oscillazioni dei glomeruli nel bulbo
olfattivo ci sono anche gli astrociti glomerulari tramite un meccanismo che tiene conto dei livelli di
ATP. Ogni glomerulo riceve afferenze solo dai neuroni sensitivi olfattivi che esprimono il recettore
per la stessa molecola, molte connessioni sono aberranti e devono essere raffinate dopo la nascita in
maniera dipendente dall’attività (Kerr and Belluscio, 2006) in modo che i glomeruli associati a più
d’un recettore olfattivo vengano eliminati. E’ altresì noto che l’esperienza sensoriale induce la
connettività, come dimostrato dall’esposizione cronica agli odori che porta alla formazione di
glomeruli sovrannumerari: l’esperienza sensoriale mette a punto un equilibrio tra formazione ed
eliminazione dei nuovi glomeruli.
5.1. Formazione di glomeruli sovrannumerari in seguito ad esposizione cronica agli odori.
Il ruolo dell’esperienza durante i primi stadi della formazione dei circuiti sensoriali è ancora
dibattuto da chi afferma che la precoce specificazione dei circuiti sia determinata dall’attività
spontanea delle prime formazioni neuronali, in ogni caso l’esperienza sensoriale probabilmente
influenza la formazione dei circuiti nel cervello più precocemente di quanto non si pensasse. Il
modello sperimentale utilizzato nel lavoro cui facciamo riferimento (Valle-Leija et al., 2012) è un
topo knock-in in cui le afferenze primarie dei glomeruli I7 ed M72 sono marcate con la proteina
verde fluorescente e con la β-galattosidasi, rispettivamente (I7tauGFP; M72tauLacZ). La
stimolazione specifica è stata ottenuta esponendo gli animali all’eptaldeide e all’acetofenone, i
ligandi affini dei recettori olfattivi di I7 ed M72 rispettivamente.
5.2. L’esposizione cronica ai ligandi affini durante i primi 20 giorni di vita post-natale induce la
formazione di glomeruli sovrannumerari odore-specifici.
Esponendo i topi con i recettori marcati come spiegato sia all’eptaldeide che all’acetofenone fino al
ventesimo giorno dopo la nascita si provoca l’aumento bilaterale del numero di glomeruli specifici
nel bulbo olfattivo. Questo effetto è odore-specifico infatti l’esposizione ad eptaldeide causa
l’aumento dei glomeruli I7 per essa specifici ma non dei glomeruli M72; analogamente,
l’acetofenone fa sì che aumentino i glomeruli M72 ma non i glomeruli I7 (Figura 1).
Fig 2. Immagine adattata da Valle.Leija et al.,
2012. La foto A è un esempio di glomeruli
I7tauGFP in topi non esposti all’odore, in B
troviamo gli stessi glomeruli esposti
all’eptaldeide, ligando affine dei recettori di I7.
Fig 3. Analogamente in C vediamo i glomeruli
M72 in topi non esposti e in D gli stessi
glomeruli in topi esposti all’acetofenone. I
grafici in E ed F mostrano come i ligandi
abbiano effetto solo sulla formazione di
glomeruli sovrannumerari per essi specifici.
A sostegno della specificità dell’effetto, c’è anche il fatto che l’aumento è dose- dipendente (Figura
2).
Fig 4. Il grafico mostra il numero medio di glomeruli I7 ed M72 in risposta a diverse dosi di eptaldeide.
E’ stato inoltre osservato che sia i glomeruli I7 che M72 sovrannumerari indotti dall’esposizione
cronica, non solo rimangono anche nell’età adulta senza prosecuzione dell’esposizione, ma vanno
incontro ad una crescita nelle dimensioni. La formazione di glomeruli specifici però non si verifica
in adulti esposti agli odori in maniera cronica per 20 giorni.
5.3. Durante l’esposizione cronica si verifica una riorganizzazione delle afferenze primarie locali
Negli animali esposti ad eptaldeide ci sono efferenze dal glomerulo più largo, il primo formato,
verso quelli che sembrano essere glomeruli secondari (Figura 6). Questo è vero in animali esposti
sia fra PD0 e PD5 (PD= post-natal day) che fra quelli esposti fra PD10 e PD15. La riorganizzazione
assonale dunque potrebbe contribuire alla formazione di ulteriori glomeruli e sembrerebbe che le
afferenze primarie nel bulbo olfattivo mostrino una fase protratta di crescita assonale che dura
almeno fino a due settimane dalla nascita.
Fig 5. Le afferenze primarie vengono redistribuite in vari modi tra il glomerulo più grande e quelli secondari negli animali esposti.
Per concludere si può dunque affermare che l’esperienza olfattiva precoce fornisce informazioni che
influenzano la formazione di glomeruli in maniera specifica per l’odore e per il circuito, queste
riorganizzazioni si verificano solo quando l’esposizione è attuata in età giovanile e sembra essere
anche dose-dipendente. Questi risultati possono in parte essere spiegati dalle differenze nella guida
assonale dovute alla disponibilità di molecole, diversi fattori infatti sono importanti per la crescita
assonale, l’arborizzazione, la disposizione spaziale e il numero dei glomeruli.
Prospettive future
Una precisa spiegazione del ruolo della glia nell’architettura dei circuiti neuronali insieme ad
implicazioni funzionali e associazioni utili possono essere dedotte da modelli animali di malattia e
di disordini dello sviluppo. I modelli murini della sindrome dell’X fragile si rivelano molto utili per
spiegare i difetti dello sviluppo del sistema nervoso, infatti i neuroni ippocampali mostrano una
differente arborizzazione e una carenza di sinapsi quando interagiscono con astrociti provenienti da
un topo affetto da questa sindrome. Il West Nile Virus causa una perdita dei terminali pre-sinaptici
nell’area ippocampale CA3 che sarebbe associata ad una pronunciata attività microgliale.
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