Come gli ormoni scatenano una
risposta nella cellula bersaglio
La capacità delle cellule di ricevere e rispondere a segnali che arrivano
dall’esterno della membrana plasmatica è un processo fondamentale
per la vita. Negli organismi pluricellulari le cellule con funzioni diverse si
scambiano un gran numero di informazioni e di segnali.
Ogni segnale, che rappresenta un informazione per la cellula, è rilevato
da RECETTORI specifici e trasformato in una risposta cellulare
attraverso un processo chimico.
Questa conversione è chiamata TRASDUZIONE DEL SEGNALE.
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Le vie di trasduzione del segnale seguono percorsi diversi che prevedono :
1. Rilascio del primo messaggero: qualunque tipo di stimolo determina
il rilascio di una molecola segnale, denominata primo messaggero.
2. Riconoscimento del primo messaggero: recettore-ligando
3. Trasferimento del messaggio all’interno della cellula, tramite il
secondo messaggero
4. Attivazione di effettori che alterano direttamente la risposta
fisiologica
5. Spegnimento del segnale
Le vie di transduzione sono altamente SPECIFICHE ed estremamente
sensibili.
La SPECIFICITA’ è determinata dalla COMPLEMENTARIETA’ ormonerecettore (enzima-substrato).
CARATTERISTICHE FONDAMENTALI DEL SISTEMA DI TRASDUZIONE
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Gli ormoni del I gruppo, come gli ormoni steroidei, essendo altamente idrofobici a6raversano la membrana plasma8ca per diffusione semplice e si legano a specifici rece6ori proteici nel nucleo. I rece6ori degli ormoni steroidei agiscono sopprimendo la trascrizione di geni bersaglio. Il legame del rece6ore con l’ormone cambia la c o n f o r m a z i o n e d e l r e c e 6 o r e rendendolo capace di reagire con s p e c i fi c h e s e q u e n z e s u l D N A , denominate elemen8 di risposta ormonale (HRE) alterando così l’espressione genica. La specificità dell’interazione ormone-reccettore è sfruttata dal farmaco
tamoxifene, usato per il trattamento del cancro al seno. Il farmaco compete
con l’estrogeno per il legame al recettore, ma il complesso tamoxifenerecettore non ha alcun effetto sull’espressione genica
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ORMONI DEL SECONDO GRUPPO
Sono solubili in acqua non possono attraversare la membrana e quindi
posseggono tutti recettori che si trovano sulla membrana cellulare.
I diversi ormoni differiscono per il tipo di risposta cellulare.
Prenderemo in considerazione alcuni sistemi fra i più rappresentativi di
trasduzione del segnale, classificati secondo il tipo di recettore.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Recettori accoppiati alle proteine G
Recettori con attività tirosin chinasica
Recettori con attività guanilil ciclasica
Canali ionici controllati
Recettori di adesione
Recettori nucleari
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I recettori accoppiati alle proteine G o GPCR fanno parte di una grande
famiglia di recettori localizzati sulla membrana plasmatica con sette eliche
transmembrana (recettori a serpentina)
Quasi la metà di tutti i farmaci
presenti sul mercato hanno come
bersaglio un recettore GPCR.
Il recettore β-adrenergico, che
media i messaggi dell’adrenalina,
è il bersaglio dei β-bloccanti,
prescritti per svariate condizioni
patologiche quali ipertensione,
aritmie cardiache, ansietà ed
emicrania.
Il recettore β-adrenergico è il prototipo di tutti i recettori GPCR
L’ADRENALINA è un ormone secreto dalle ghiandole surrenali dei
mammiferi in risposta a fattori di stress che provengono dall’esterno o
dall’interno di un organismo. La sua azione induce una vasta gamma di
effetti, a cui ci si riferisce come “risposte combatti o fuggi”, tra cui
l’accelerazione del battito cardiaco, dilatazione della muscolatura
liscia delle vie respiratorie, demolizione del glicogeno e degli acidi
grassi.
Il segnale trasmesso dall’adrenalina inizia quando l’ormone si lega al
suo recettore β-adrenergico. Il legame dell’adrenalina induce nel
recettore una modificazione conformazionale che determina
l’attivazione di una proteina che si trova sul lato citoplasmatico della
membrana :
la PROTEINA G STIMOLATORIA o Gs.
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Il recettore transmembrana lega il
segnale extracellulare (l’ormone) e
modificata la sua conformazione
diventa capace di reagire con una
proteina G posta sul lato citosolico
della membrana.
La proteina G, è costituita da tre
subunità: α (che contiene una molecola
di GDP), β e γ; quando il recettore
cambia la sua conformazione proteica
provoca una riduzione di affinità della
subunità α per il GDP, che viene
sostituito dal GTP.
Questo evento
porta la proteina G a frantumarsi in una
subunità αs (attiva) ed una una β γ.
Un singolo complesso ormone-recettore
può stimolare lo scambio nucleotidico
di molti eterotrimeri di proteina G
La subunità α con il GTP
legato è ora capace di
legare una proteina
enzimatica di membrana,
l’AMPciclasi, rendendola
cataliticamente più attiva.
L’AMPciclasi catalizza la
reazione di formazione del
cAMP (AMP ciclico) da ATP
Il risultato netto è che il legame dell’adrenalina con il recettore sulla
superficie cellulare aumenta la velocità di produzione del cAMP ,
secondo messaggero ( messaggero cellulare), all’interno della cellula.
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Si conoscono ad oggi circa 100 proteine chinasi diverse sia cAMP
dipendenti che cAMP indipendenti.
Sebbene presentino omologie nella sequenza e nella struttura del sito
attivo differiscono per quantità di subunità, per la Km per l’ATP e per
specificità di substrato
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Come viene spento il segnale iniziato
dall’adrenalina?
La durata del periodo in cui le subunità
rimangono dissociate e attive dipende
dalla subunità αs .
Questa subunità ha infatti un’attività
GTP-idrolitica intrinseca (GTPasica)
che dopo un certo intervallo idrolizza il
GTP a GDP.
Le subunità si riassociano e la proteina
G diventa pronta per un altro recettore
che la stimoli.
In generale, i meccanismi che
estinguono un’attivazione non sono
meno importanti di quelli che
l’alimentano.
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Nella cascata enzimatica
tutti gli enzimi attivati
vengono spenti mediante
l’azione di FOSFATASI1
Un altro meccanismo che
pone fine alla risposta
scatenata dall’adrenalina
è quello di rimuovere il
secondo messaggero,
attraverso l’azione
idrolitica della
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Anche il recettore attivato, ancora legato all’ormone, deve essere
riportato allo stato iniziale, per impedire che la proteina G rimanga
permanentemente attiva.
due modalità:
I° l’ormone si dissocia dal
recettore, ma questo dipende
dalla concentrazione
dell’ormone nel plasma.
II° il complesso ormonerecettore può essere
disattivato da una
fosforilazione da parte di una
chinasi.
La chinasi del recettore β-adrenergico fosforila la coda carbossi-terminale
del complesso ormone-recettore, ma non quella del recettore libero.
Infine una molecola di β-arrestina si lega al recettore fosforilato, diminuendo
la sua capacità di attivare le proteine G.
Questo segnale diminuisce l’intensità della risposta anche quando il segnale
persiste nel tempo.
Le proteine GPRC agiscono sull’adenilato ciclasi e la loro
azione può essere sia attivatoria che inibitoria .
Due sistemi in parallelo attivatorio e inibitorio comprendono
un recettore Rs o Ri ed un complesso regolatorio Gs e Gi
Le proteine G differiscono nella subunità αs e αi
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Una seconda classe di GPCR molto numerosa comprende recettori che
attraverso una proteina G sono accoppiati ad una FOSFOLIPASI C (PLC) di
membrana, enzima specifico per il fosfolipide di membrana
Fosfatidilinositolo 4,5 bis fosfato (PIP2)
Quando l’ormone si lega al suo specifico recettore
di membrana abbiamo.
1. Il complesso ormone-recettore determina lo
scambio GDP-GTP di una proteina G (Gq)
attivandola
2. La Gq attivata, attiva a sua volta la PLC
specifica per il PIP2
3. La PLC catalizza la scissione del PIP2 con la
formazione di due messaggeri cellulari:
l’inositolo 1,4,5 trifosfato (IP3) e
diacilglicerolo.
5. L’inositolo diffonde nel citosol si lega ed apre un
canale per il Ca2+ sul RE dove lo ione si era
accumulato ad opera di trasportatori come la Ca2+
ATPasi.
6. Calcio e
diacilglicerolo
(DAG) vanno ad
attivare una
proteina chinasi C
(PKC) sulla
membrana
plasmatica.
animazione
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1. La concentrazione di calcio nella cellula è
mantenuta a livelli molto bassi per evitare la
precipitazione di composti fosforilati o
carbossilati, che formano sali di calcio poco
solubili.
2. La concentrazione plasmatica del calcio si
mantiene molto bassa, intorno a 100 nM, ne
deriva che piccole variazioni di concentrazione
possono essere prontamente avvertite.
3. Il calcio può fare da sei a otto legami di
coordinazione con l’ossigeno di gruppi
carbossilici di proteine determinando la
formazione di legami crociati tra diversi gruppi
di una stessa proteina con il risultato di una
consistente modificazione strutturale.
4. La Calmodulina è una proteina ubiquitaria che
fa da sensore per il calcio in quasi tutte le
cellule eucariotiche.
La calmodulina è una piccola proteina con
quattro siti di legame per il calcio.
A concentrazioni citosoliche di 500 nM, il
Ca2+ si lega alla proteina attivandola.
La calmodulina ha un motivo strutturale
noto come mano EF (EF-hand) che lega lo
ione calcio.
Sette atomi di ossigeno si coordinano con
ciascun calcio nelle 4 subunità mano EF che
costituiscono la calmodulina.
Il complesso calcio-calmodulina stimola diversi enzimi, pompe e altre
proteine bersagli, ,inducendo modificazioni conformazionali.
La calmodulina è, per esempio, regolatrice della chinasi b muscolare.
Il calcio innesca la contrazione muscolare e nello stesso tempo
attraverso la calmodulina attiva la demolizione del glicogeno per
fornire energia al muscolo che deve contrarsi.
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Alcuni segnali che agiscono attraverso la fosfolipasi C, l’IP3 e il Calcio
Acetilclina
Istamina
Agonisti α adrenergici
Ormone che rilascia le gonadotropine
(GRH)
Angiotensina II
Ormone che rilascia la tireotropina (TRH)
ossitocina
Fattore di crescita derivato dalle piastrine
Serotonina
Peptide che rilascia la gastrina
Vasopressina
auxina
L’azione di alcuni composti chiamati promotori tumorali è da
attribuirsi ai loro effetti sul PKC. Essi legano l’enzima come il
diacilglicerolo ma diversamente da questo secondo messaggero
naturale non sono prontamente rimossi dal metabolismo cellulare. La
proteina PKC rimanendo costantemente attiva interferisce con i
normali processi della crescita e della divisione cellulare.
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Questa classe di
recettori possiede una
attività chinasica
intrinseca e trasduce il
segnale extracellulare
con un meccanismo
molto diverso dalle
GPCR.
Questi recettori hanno
u n d o m i n i o
extracellulare che lega
il segnale ed un sito
attivo enzimatico nella
parte citosolica, i due
d o m i n i s o n o
interconnessi da un
s e g m e n t o
intramembrana.
In questo tipo di
regolazione abbiamo che:
1. L’attività tirosinchinasica è attivata da
ligando
2. Le chinasi coinvolte
fosforilano soltanto
residui di tirosina
3. L’interazione ligandorecettore, fosforilando
le tirosine , da inizio ad
una cascata che può
coinvolgere diverse
tirosin-chinasi
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Un esempio di questa via di trasduzione del segnale inizia con l’INSULINA
ormone che viene rilasciato dal pancreas in risposta ad un aumentato
livello di glucosio nel sangue.
Sintetizzato come unico
polipeptide viene poi glicosilato
e scisso nelle subunità α e β che
si assemblano in un tetramero
unito da ponti disolfuro.
Il dominio citosolico delle
subunità β è una tirosinchinasi
Le due catene α si avvicinano le une alle
altre per formare il sito di legame per
un’unica molecola di insulina.
Ciascuna catena β è invece una proteina
chinasi che catalizza il trasferimento di un
gruppo fosforico dall’ATP al gruppo
idrossilico di tre tirosine vicine all’estremità
carbossiterminale della stessa catena β .
Questa autofosforilazione apre un sito attivo
che permette la fosforilazione di altri residui
di tirosina di altre proteina bersaglio.
La stimolazione del recettore dell’insulina da inizio
ad una cascata di reazioni di fosforilazione di
proteina
Attraverso questa cascata di attivazioni chinasiche
vengono regolate sia l’attività di enzimi del
metabolismo che l’espressione genica.
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2. Il recettore dell’insulina (INS-R)
attivato fosforila attivando il
substrato 1 dell’insulina (IRS-1)
3. IRS-1 attivato diventa il punto
focale per la formazione di un
complesso proteico.
L’IRS-1 si lega alla proteina Gbr-2
la cui funzione è quella di
avvicinare l’IRS-1 alla proteina Sos.
L’Sos agisce da fattore di scambio
di nucleotidi per cui la proteina
Ras (piccola proteina G) che
conteneva GDP ora contiene GTP.
4. Nella forma GTP attiva la
proteina Ras attiva una proteina
Chinasi Raf-1. La Raf-1 attiva
fosforila un’altra chinasi MEK che a
sua volta fosforila una proteina
chinasi ERK
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La ERK (chinasi regolate da segnali
extracellulari) attivata media alcuni
effetti biologici dell’insulina entrando nel
nucleo e fosforilando dei fattori di
transizione che modulano la trascrizione
genica.
La ERK fa parte di una grande famiglia di
chinasi chiamate MAPK (proteine chinasi
attivate da mitogeni: segnali
extracellulari che inducono la mitosi e la
divisione cellulare)
MEK appartiene invece alle MAPKK
Questa via di segnalazione mediata da Ras determina : l’aumento di sintesi
proteica che favorisce la crescita e il differenziamento cellulare; risposta
coerente con le funzione dell’insulina come segnale di riserve energetiche
abbondanti
La cascata enzimatica sia dell’insulina
determina un’ amplificazione del segnale
ormonale.
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Come per le proteine
G anche la proteina
Ras ha un’attività
GTPasica intrinseca
che determina lo
spegnimento del
segnale. In questo
caso però essendo
l’attività troppo
lenta la Ras è aiutata
nella sua funzione
idrolitica da una
proteina GAP.
La via di segnalazione
dell’insulina si biforca al
livello dell’IRS-1, infatti
questa proteina può prendere
contatto con un altro enzima:
FOSFOINOSITOLO 3-CHINASI.
Questo enzima fosforila il
fosfatidilinositolo 4,5bisfosfato (PIP2) che diventa
fosfatidilinositolo 3,4,5trifosfato (PIP3). A sua volta
il PIP3 formato attiva una
proteina chinasi, la PDK1.
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La PDK1 catalizza la fosforilazione, ATP dipendente, di una proteina
chinasi B (PKB), nota anche come Ark, che diffonde nella cellula andando
a fosforilare bersagli proteici come i componenti che stimolano la
traslocazione delle vescicole contenenti GLUT4 alla membrana plasmatica,
aumentando l’assorbimento del glucosio nel sangue e nello stesso tempo
attiva enzimi che stimolano la sintesi del glicogeno.
Anche in questo caso la cascata enzimatica
ha inizio quando l’insulina si lega al
recettore. Il segnale viene amplificato a
diversi livelli della cascata.
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In alcuni tessuti come il muscolo l’insulina promuove il reclutamento dei
TRASPORTATORI DI GLUCOSIO INSULINO SENSIBILI (GLUT4)
L’insulina legata al suo recettore è internalizzata. Una volta nella
cellula l’insulina è degradata per l’azione di enzimi lisosomiali. Anche i
recettori possono venir degradati ma per la maggior parte vanno a
ripopolare la membrana cellulare . Un livello elevato di insulina
promuove la degradazione dei recettori , facendone diminuire il numero
sulla superficie della membrana cellulare.
21
animazione
Regolazione dell’espressione genica
Le cellule di un organismo pluricellulare sono diverse l’une dalle
altre pur avendo lo stesso patrimonio genetico perché
sintetizzano e accumulano diversi RNA e proteine.
Oggi sappiamo che il differenziamento cellulare dipende
generalmente da cambiamenti nell’espressione genica.
Una cellula può modificare l’espressione dei
suoi geni in risposta a segnali esterni.
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Regolazione dell’espressione genica
L’espressione genica può essere controllata in diversi momenti durante il
passaggio dalla trascrizione dell’RNA alla sintesi della proteina.
Solo il controllo della trascrizione garantisce che non
avvenga la sintesi di intermedi inutili.
Analisi genetiche sui batteri ( adattamento di E.coli al mezzo di
coltura) svolte negli anni ’50 hanno fornito le prime prove
dell’esistenza di proteine regolatrici dei geni chiamate fattori di
trascrizione, che accendono e spengono serie specifiche di geni.
Regolazione dell’espressione genica
Per distinguere, a livello del DNA, i componenti del circuito
regolatorio dai geni che essi regolano, si usano i termini geni
regolatori e geni strutturali.
Un gene strutturale è
un qualsiasi gene
che codifica per
proteine strutturali,
enzimi, etc.
Un gene regolatore è
un gene che codifica
per una proteina o un
RNA in grado di
r e g o l a r e
l’espressione genica
attraverso il legame
con particolari siti del
DNA (per esempio
promotori).
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Regolazione dell’espressione genica
Nei batteri, il modo classico di controllare l’espressione genica è la
regolazione negativa. Una proteina repressore impedisce che il gene
venga espresso.
Gli elementi a monte del gene strutturale sono: il promotore e
l’operatore che è la sequenza riconosciuta e legata dal repressore.
La capacità del gene strutturale di essere trascritto sta nel
riconoscimento da parte della polimerasi del suo promotore.
La presenza del repressore, legato all’operatore, non permette all’RNA
polimerasi di iniziare la trascrizione e il gene è quindi spento fino a che
non arriva un fattore esterno ad attivarlo.
Regolazione dell’espressione genica
Un modo alternativo di controllare l’espressione genica è la
regolazione positiva. Questo sistema è utilizzato nei procarioti con la
stessa frequenza della regolazione negativa, mentre negli eucarioti è la
via preferenziale.
I geni controllati dalla
regolazione positiva
sono sempre attivi.
Poiché il repressore
non riesce a legare
l’operone, l’RNA
polimerasi può legare il
p r o m o t o r e e
trascrivere i geni
strutturali.
I geni sono sempre trascritti fino a che un intervento esterno non
modifica il repressore inattivo attivandolo.
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Regolazione dell’espressione genica
Molti sono i fattori, chiamati fattori di trascrizione, che si
legano a siti vicini al promotore, permettendo all’RNA pol di
iniziare la trascrizione.
Regolazione dell’espressione genica
Al contrario degli eucarioti, i geni dei procarioti sono spesso
organizzati in gruppi (cluster) che includono geni con funzioni
correlate (geni codificanti per enzimi della stessa via metabolica).
L’unità comprendente i geni strutturali e gli elementi che controllano
la loro espressione (promotore, operone, gene regolatore) è chiamata
operone, il cui cluster è trascritto come un unico RNA policistronico a
partire da un unico promotore regolato.
L’operone lac
contiene i geni
codificanti gli
enzimi necessari
per
metabolizzare i
β-galattosidi
come il lattosio.
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Regolazione dell’espressione genica
I geni lac sono controllati da una regolazione negativa. Il repressore lac
è il prodotto del gene lacI. Il prodotto di questo gene (proteina) si lega
ad un operatore (Olac) che si trova fra il promotore e I geni lac. Il
legame del repressore all’operatore impedisce all’RNA pol di iniziare la
trascrizione.
Il repressore lacI è un tetramero proteico costituito da subunità
identiche. Ne esistono una decina di copie in una cellula batterica ed è
trascritto come RNA monocistronico, con un suo promotore che ha
un’affinità normale con l’RNA pol.
Regolazione dell’espressione genica
I geni lac rappresentano un esempio di sistema inducibile, presenti nei
batteri. Questi sistemi permettono alla cellula di reagire ai cambiamenti
dell’ambiente e alle fluttuazioni dei nutrienti. Nel caso del sistema lac,
non c’è necessità di sintetizzare enzimi che degradano il lattosio in
assenza di substrato, ma non vengono sintetizzati. In questo caso
quindi il lattosio è l’induttore.
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Regolazione dell’espressione genica
La β-galattosidasi idrolizza il legame del
lattosio a galattosio e glucosio
La permeasi è necessaria per il
trasporto di lattosio
La tiogalattoside transacetilasi
sembra avere un ruolo di
detossificazione di composti che
possono essere trasportati dalla
permeasi
Regolazione dell’espressione genica
L’induttore del sistema lac è una piccola molecola simile al lattato,
l’isopropiltiogalattoside (IPTG). L’IPTG non si lega all’enzima o al
promotore per indurre la trascrizione, ma al repressore lac I.
L’induttore IPTG agisce cambiando la conformazione del repressore
in modo che non si possa più legare all’operatore.
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Regolazione dell’espressione genica
CH3
S
H
C
H
CH3
isotiogalattoside
Regolazione dell’espressione genica
Quando I batteri possono scegliere fra differenti sorgenti di carbonio,
preferiscono utilizzare il glucosio che altri zuccheri. In questa
situazione, il glucosio reprime l’espressione degli enzimi capaci di
metabolizzare altri zuccheri (repressione da glucosio).
Uno dei metodi che ha il glucosio per reprimere altri operoni è
l’esclusione dell’induttore. Il fattore chiave è il PTS , che trasporta
gli zuccheri nella cellula. Una componente di questo fattore, in
seguito al trasporto del glucosio, viene modificata, si lega alla lac
permeasi bloccando il trasporto di lattosio.
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Regolazione dell’espressione genica
I principi generali che governano l’espressione genica nei
procarioti si applica anche ai geni degli eucarioti.
L’espressione di geni specifici può essere attivamente inibita
o stimolata mediante gli effetti indotti da proteine che si
legano al DNA attivando o inibendo la trascrizione di
determinati geni.
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