Analisi genetica del ciclo cellulare

Analisi genetica del ciclo cellulare
Sistema sperimentale basato sull’uso di
eucarioti semplici come i lieviti che sono
funghi unicellulari
Saccharomyces cerevisiae
Lievito che si riproduce per gemmazione (Budding yeast)
Schizosaccharomyces pombe
Lievito che si riproduce per scissione (Fission yeast)
1
Schema del ciclo cellulare di S. cerevisiae
Le cellule figlie al momento della nascita sono più piccole delle
cellule madri e devono crescere più a lungo in G1 prima di poter
avere dimensioni compatibili con la successiva fase S
2
Schema del ciclo cellulare di S. pombe
Le cellule più lunghe sono in procinto di entrare in mitosi,
mentre quelle più corte sono state appena prodotte dalla
citocinesi
3
Mancanza di nutrienti causa
meiosi e sporulazione
S. cerevisiae
Proliferazione
diploide
Proliferazione
aploide
Coniugazione dopo la
schiusa delle spore
Mancanza di nutrienti causa
coniugazione
S. pombe
Proliferazione
aploide
Proliferazione
diploide
Dopo la coniugazione si ha
meiosi e sporulazione
4
In organismi unicellulari la DIVISIONE CELLULARE
coincide con la RIPRODUZIONE
La mancanza di nutrienti potrebbe causare
l’arresto del ciclo cellulare, ma i lieviti posseggono
due meccanismi per impedire l’effetto letale della
mancanza di cibo:
 le cellule mantengono sempre una quantità
minima di nutrienti necessaria per affrontare
UNA replicazione, UNA mitosi e UNA divisione
cellulare;
 le cellule reagiscono alla mancanza di nutrienti
arrestando il ciclo cellulare in un punto preciso
5
Due parametri regolano la proliferazione cellulare:
✷Velocità di crescita (Vc)
✷Velocità di divisione cellulare (Vd)
Quando Vc = Vd le dimensioni cellulari rimangono
costanti durante ogni ciclo cellulare
Quando o se Vc > Vd si producono cellule sempre più
grandi ad ogni generazione
Quando o se Vc < Vd si producono cellule sempre più
piccole ad ogni ciclo di divisione
Poiché il ritmo di crescita è regolato dall’ambiente esterno
(nutrienti), la lunghezza del ciclo cellulare deve essere
regolabile in maniera corrispondente
6
Controllo delle dimensioni della cellula tramite
il controllo del ciclo cellulare
7
Yeast Size and Morphology Through the Cell Cycle
8
Growth Regulation in Yeast
Fission yeast grow in G1;
- G2/M highly regulated
Budding yeast grow in G1;
- G1/S highly regulated
S-phase regulation better understood in Budding yeast
where G1/S more highly regulated than in Fission yeast
9
Esistono dei punti di controllo delle dimensioni
sia in G1 che in G2
 In S. cerevisiae il punto di controllo della taglia in G1
(START) è il più importante: se una cellula passa il
punto di START supererà anche il punto di controllo in
G2. G1 è sensibile all’ambiente esterno.
 In S. pombe il punto di controllo in G2 (INGRESSO
MITOTICO) è il più selettivo per il controllo delle
dimensioni. G2 è sensibile all’ambiente esterno.

 Nei mammiferi il punto di controllo fondamentale
è in G1 ed è definito PUNTO DI RESTRIZIONE
10
S. pombe cell cycle
✸
✸
Mutants have been identified that are “stuck” at some point in this
cycle (= cell division cycle, or cdc mutants).
Such mutants are lethal, and are maintained as ts (temperature
sensitive) alleles.
11
I mutanti cdc possono essere selezionati solo
se il loro fenotipo è CONDIZIONALE, cioè se
il prodotto del gene smette di funzionare
soltanto in certe condizioni.
Di
solito
i
mutanti
condizionali
TEMPERATURA-SENSIBILI (ts).
sono
Un ceppo cdc-ts cresce a bassa temperatura
(CONDIZIONI PERMISSIVE) e non cresce
più a temperatura alta (CONDIZIONI NON
PERMISSIVE).
12
Both yeasts have been useful for the
identification of cell division cycle
(CDC) genes through conditionally lethal
mutation
 CDC-ts mutants fail to cycle at restrictive
temperature, but they DO grow. This
allows one to distinguish them from simple
lethals.
 Like any other ts mutation, the wild-type
allele at this locus can be cloned by
complementation with a plasmid library
13
Isolating Temperature Sensitive
Mutants in Haploid Yeast
14
Identificazione di mutanti
cdc-ts di S. cerevisiae
Isolamento del gene
CDC-28 wild-type
15
Alla temperatura permissiva il prodotto dei
geni cdc viene sintetizzato
Alla temperatura non permissiva (o restrittiva)
il gene non viene espresso
T. permissiva per S. cerevisiae
20-23 °C
T. restrittiva per S. cerevisiae
35-37 °C
16
Comportamento
di un mutante
cdc sensibile
alla
temperatura
17
The Behavior of a Temperature Sensitive cdc Mutant
cdc mutant growing
at permissive temp (23°C)
cdc mutant growth arrested
after 6 hrs at non-permissive
temp (36°C)
18
Da S. pombe sono stati isolati due tipi di mutanti con
difetti nei meccanismi di regolazione del ciclo cellulare
Tipo I
Mutanti cdc che, alla t. permissiva, non riescono
a passare attraverso una delle fasi del ciclo
cellulare; essi formano cellule più grandi che
non sono capaci di dividersi
mutante cdc 219
Rappresentazione schematica dei fenotipi mutanti
cdc 2 condizionali di S. pombe
cdc 2+
cdc 2cdc 2D
20
Screening of cdc mutants with different
phenotypes identified those that initiated
mitosis early
If mutations that block Mitosis are cdc2 (big)……
…… mutations that initiate mitosis early will be small
wild type
wee1
Probably Regulators
of mitosis
Screening for such mutants,
discover of the wee
mutants
From Nurse (2002) ChemBioChem 3:596
21
Da S. pombe sono stati isolati due tipi di mutanti con
difetti nei meccanismi di regolazione del ciclo cellulare
Tipo II
Mutanti wee che, alla t. permissiva, mancano delle
proteine che normalmente impediscono alle cellule di
dividersi se sono troppo piccole; essi formano cellule
più piccole
mutante wee 1
22
Rappresentazione schematica dei fenotipi mutanti
condizionali di S. pombe
cdc 2+
cdc 2cdc 2D
wee 1
23
La mutazione wee1 è recessiva ts
Alla t. permissiva (25 °C) il mutante wee1 ha la taglia
come il wild type
Alla t. restrittiva (37 °C) il mutante wee1 ha la taglia
ridotta
La durata del ciclo cellulare a 25 °C e 37 °C è uguale?
Le cellule del mutante wee1 sono più piccole perché il
ciclo cellulare è più corto?
24
Taglia minima richiesta per entrare in mitosi
25
 La mutazione wee1 influenza il ciclo cellulare
 Quale è la funzione della proteina Wee1?
 In quale momento del ciclo cellulare è necessaria
la sua presenza?
 Quale è la transizione che viene inibita dalla
proteina Wee1 mutante?
 La normale funzione della proteina Wee1 è di
ritardare l’ingresso in mitosi finchè le cellule non
hanno raggiunto la taglia necessaria.
 Wee1 agisce come un meccanismo omeostatico che
mantiene costante la taglia delle cellule.
26
Mutanti di S. pombe che influenzano la taglia
Ingresso normale in M
Blocco ingresso in M
Blocco ingresso in M
Accellerazione ingresso in M
Ingresso normale in M
La funzione di Cdc25 è quella di “superare” la
abilità di Wee1 di inibire l’ingresso in Mitosi
Cdc25 e Wee1 hanno un effetto antagonistico
27
La Mitosi viene indotta da un cambiamento
della quantità di Cdc2 o della sua attività?
Copie addizionali di Cdc2 e
Cdc13 non influenzano il ciclo
E’ importante la ATTIVITA’
piuttosto che la quantità
Copie addizionali di Wee1
causano un ritardo nell’ingresso
in M. Copie addizionali di Cdc25
anticipano M.
E’ importante la QUANTITA’ di
Cdc25 e di Wee1 piuttosto che
la attività.
28
Mutante cdc25-
Mutante cdc25D
Non entra in M
Prematuro ingresso in M
(cellule lunghe)
(cellule piccole)
La proteina Cdc25 stimola l’attività di MPF
Mutante wee1-
Mutante wee1D
Prematuro ingresso in M
Non entra in M
(cellule piccole)
(cellule lunghe)
La proteina Wee1 inibisce l’attività di MPF
29
attivatore
inibitore
30
 The real power of yeast genetics
emerged not from the identification of a
mutant here and there, but from the
possibility of getting multiple of alleles
of any one gene
 Even then, CDC genetics was mostly an
intellectual exercise until molecular
biology made it possible to clone the
genes, obtain their sequences, and
purify the corresponding gene products
31
32
Phosphorylation changes structure and
function
– phosphate group added by protein kinase
– phosphate group removed by phosphatase
Phosphorylation on:
Ser, Thr and Tyr
residues
33
Why is phosphorylation such a
common mechanism for regulating
the activity of proteins?
✼ Reversible
✼ Large negative charge of
phosphate group can cause
major changes in protein
structure
that
result
in
changes in function
34
Phosphorylation
 Addition of phosphate group to protein
 Catalyzed by protein kinases
 Reversible (phosphate group removed by
protein phosphatases)
 Regulates activity of protein
 Involved in cell signaling pathways
 Proteins can be phosphorylated at multiple
sites
35
Cdc2 was cloned and sequenced,
revealing a Protein Kinase
Cdc2
Cdc28
Kin28
Smk1
Hog1
. . . .10 . . . .20 . . . .30 . . . .40 . . . .50 . . . .60 . . . .70 . . . .80 . . . .90 . . . 100
1:---------------------------------MEN-YQKVEKIGEGTYGVVYKA---RHKLSGRIVAMKKIRLEDESEGVPSTAIREISLLKEVNDENN:
1:-----------------------------MSGELAN-YKRLEKVGEGTYGVVYKALDLRPGQGQRVVALKKIRLESEDEGVPSTAIREISLLKELKDDN-:
1:-----------------------------MKVNME--YTKEKKVGEGTYAVVYLGCQ---HSTGRKIAIKEIKTSEFKDGLDMSAIREVKYLQEMQHPN-:
1:MNCTLTDNTRAINVASNLGAPQQRTIFAKERISIPGYYEIIQFLGKGAYGTVCSVKFKGRSPAAR-IAVKKISNIFNKEILLKRAIRELKFMNFFKGHKN:
1:----MTTNEEFI-----------RTQIFGTVFEITNRYNDLNPVGMGAFGLVCSATDTLTSQP---VAIKKIMKPFSTAVLAKRTYRELKLLKHLR-HEN:
63
69
65
99
81
. . . 110 . . . 120 . . . 130 . . . 140 . . . 150 . . . 160 . . . 170 . . . 180 . . . 190 . . . 200
Cdc2
64:RSNCVRLLDILHAES-KLYLVFEFLDMDLKKYMDRISETGATSLDPRLVQKFTYQLVNGVNFCHSRRIIHRDLKPQNLLIDKEGNLKLADFGLARSFGVP:162
Cdc28 69:---IVRLYDIVHSDAHKLYLVFEFLDLDLKRYMEGIPKDQPLGAD--IVKKFMMQLCKGIAYCHSHRILHRDLKPQNLLINKDGNLKLGDFGLARAFGVP:164
Kin28 65:---VIELIDIFMAYDN-LNLVLEFLPTDL----EVVIKDKSILFTPADIKAWMLMTLRGVYHCHRNFILHRDLKPNNLLFSPDGQIKVADFGLARAIPAP:157
Smk1 100:IVNLIDLEIVTSSPYDGLYCYQELIDYDLAKVIH-----SSVQLSEFHIKYFLYQILCGLKYIHSADVIHRDLKPGNILCTLNGCLKICDFGLARGIHAG:194
Hog1
82:LICLQDIFL---SPLEDIYFVTELQGTDLHRLLQ-----TRPLEKQF-VQYFLYQILRGLKYVHSAGVIHRDLKPSNILINENCDLKICDFGLAR-----:167
Cdc2
Cdc28
Kin28
Smk1
Hog1
. . . 210 . . . 220 . . . 230 . . . 240 . . . 250 . . . 260 . . . 270 . . . 280 . . . 290 . . . 300
163:LRN---------YTHEIVTLWYRAPEVLLGSRHYSTGVDIWSVGCIFAEMIRRSPLFPGDSEIDEIFKIFQVLGTPNEEVWPGVTLLQDYKST-----FP:248
165:LRA---------YTHEIVTLWYRAPEVLLGGKQYSTGVDTWSIGCIFAEMCNRKPIFSGDSEIDQIFKIFRVLGTPNEAIWPDIVYLPDFKPS-----FP:250
158:HEI---------LTSNVVTRWYRAPELLFGAKHYTSAIDIWSVGVIFAELMLRIPYLPGQNDVDQMEVTFRALGTPTDRDWPEVSSFMTYNKLQI---YP:245
195:FFKCHSTVQ-PHITNYVATRWYRAPELLLSNQPYSKSVDIWAVGCILAEFYARKPVFMGRDSMHQIFEIIKVLGTPDKDILIKFGTIKAWNLGK-NSNNP:292
167:-------IQDPQMTGYVSTRYYRAPEIMLTWQKYDVEVDIWSAGCIFAEMIEGKPLFPGKDHVHQFSIITDLLGSPPKDVI---NTICSENTLKFVTSLP:257
Cdc2
Cdc28
Kin28
Smk1
Hog1
. . . 310 . . . 320 . . . 330 . . . 340 . . . 350 . . . 360 . . . 370 . . . 380 . . . 390 . . . 400
249:RWKRMDLHKVVPNGEEDAIELLSAMLVYDPAHRISAKRALQQNYLRDFH---------------------------------------------------:297
251:QWRRKDLSQVVPSLDPRGIDLLDKLLAYDPINRISARRAAIHPYFQES----------------------------------------------------:298
246:PPSRDELRKRFIAASEYALDFMCGMLTMNPQKRWTAVQCLESDYFKELPPPSD-PSSIKIRN--------------------------------------:306
293:VYKKIPWSNIFPFASHEAINLIESLLHWDSTHRLNVEQAISHPFLNEVRKPDDEPVCLQGPFDFTYESELNSMSKLRDYLVEEVKNFKTDLSSSSL----:388
258:HRDPIPFSERFKTVEPDAVDLLEKMLVFDPKKRITAADALAHPYSAPYHDPTDEPVA-DAKFDWHFNDADLPVDTWRVMMYSEILDFHKIGGSDGQIDIS:356
. . . 410 . . . 420 . . . 430 . . . 440 . . . 450 . . . 460 . . . 470 . . . .
Cdc2
:-------------------------------------------------------------------------------:
Cdc28
:-------------------------------------------------------------------------------:
Kin28
:-------------------------------------------------------------------------------:
Smk1
:-------------------------------------------------------------------------------:
Hog1 357:ATFDDQVAAATAAAAQAQAQAQAQVQLNMAAHSHNGAGTTGNDHSDIAGGNKVSDHVAANDTITDYGNQAIQYANEFQQ:435
36
Cdc28 is the Budding Yeast Cdc2 Homologue
- Cdc28 regulates entry into S-phase and mitosis
- Cdc28 is a protein kinase that complements cdc2ts
Cdc28 is 63% Identical to Cdc2
Cdc28
Cdc2
. . . .10 . . . .20 . . . .30 . . . .40 . . . .50 . . . .60 . . . .70 . . . .80 . . . .90 . . . 100
1:MSGELANYKRLEKVGEGTYGVVYKALDLRPGQGQRVVALKKIRLESEDEGVPSTAIREISLLKELKDDN----IVRLYDIVHSDAHKLYLVFEFLDLDLK: 96
1:----MENYQKVEKIGEGTYGVVYKARHKLSG---RIVAMKKIRLEDESEGVPSTAIREISLLKEVNDENNRSNCVRLLDILHAES-KLYLVFEFLDMDLK: 92
Cdc28
Cdc2
. . . 110 . . . 120 . . . 130 . . . 140 . . . 150 . . . 160 . . . 170 . . . 180 . . . 190 . . . 200
97:RYMEGIPKD--QPLGADIVKKFMMQLCKGIAYCHSHRILHRDLKPQNLLINKDGNLKLGDFGLARAFGVPLRAYTHEIVTLWYRAPEVLLGGKQYSTGVD:194
93:KYMDRISETGATSLDPRLVQKFTYQLVNGVNFCHSRRIIHRDLKPQNLLIDKEGNLKLADFGLARSFGVPLRNYTHEIVTLWYRAPEVLLGSRHYSTGVD:192
. . . 210 . . . 220 . . . 230 . . . 240 . . . 250 . . . 260 . . . 270 . . . 280 . . . 290 . . . 300
Cdc28 195:TWSIGCIFAEMCNRKPIFSGDSEIDQIFKIFRVLGTPNEAIWPDIVYLPDFKPSFPQWRRKDLSQVVPSLDPRGIDLLDKLLAYDPINRISARRAAIHPY:294
Cdc2 193:IWSVGCIFAEMIRRSPLFPGDSEIDEIFKIFQVLGTPNEEVWPGVTLLQDYKSTFPRWKRMDLHKVVPNGEEDAIELLSAMLVYDPAHRISAKRALQQNY:292
. .
Cdc28 295:FQES-:298
Cdc2 293:LRDFH:297
37
Limited biochemistry confirmed
that Cdc2 is a Protein Kinase
Functional characterization:
- Cdc2 immunoprecipitates have kinase activity
- this kinase activity peaks at G2/M
- the kinase activity from cdc2ts lysates
disappears at high temperature
Studies of genetic interactions suggested, however,
that Cdc2 did not function alone: Cdc13 mutations
had just the same phenotype as Cdc2, and mild
alleles of the two genes were additive, an example
of a “synthetic genetic interaction.”
38
Cloning and sequencing of Cdc13
showed that it was a cyclin
Cdc13 functions at the same time in mitosis as Cdc2
- Cdc13 required for Cdc2 function
CDC13 Cloning reveals that Cdc13 is a Cyclin
- Homology to Starfish Cyclin B (Tim Hunt)
- Cdc13 protein levels cycle
- correspond with Cdc2 activity
- Cdc13 is required for Cdc2 function in-vitro and in-vivo
Nurse and collaborators propose that Cdc2 is
Cyclin-Dependent Kinase, but clarifying this
with authority required biochemistry. 39
Cyclins
 Regulatory subunits of Cdk (cyclindependent kinase) complexes
(heterodimeric protein kinases)
 Turn on kinase activity
(phosphorylation)
 Levels vary cyclically during cell
cycle
 Degraded by proteolysis at specific
points in the cell cycle
40
Cdk (cyclin-dependent kinase)
complexes
• Heterodimeric (two different subunits)
protein kinases that regulate cell cycle
– Cyclin: regulatory subunit
– Cdk (cyclin-dependent kinase): catalytic subunit
• Phosphorylate proteins
involved in cell cycle
• Different Cdk complexes
for different cell-cycle
phases (G1, S, M)
41
La fosfatasi Cdc25 ha una azione
ATTIVATRICE su MPF
La chinasi Wee1 ha una azione
INIBITRICE su MPF
Ulteriori studi hanno rivelato
è una FOSFATASI e che la
che la Cdc25
Wee1 è una
CHINASI
42
43
Regolazione della attività di MPF di S. pombe
MPF
Wee1
CAK
Cdc25
Cdc13/Cdc2 (ciclinaB/CDK)
chinasi
(effetto inibitorio)
chinasi
(effetto attivatorio)
fosfatasi (effetto attivatorio)
44
Le attività di Cdc25 e di Wee1 sono regolate
durante il ciclo cellulare
INTERFASE
bassa [Cdc25]
alta [Wee1]
bassa [Wee1]
alta [Cdc25]
MITOSI
45
Ruolo del residuo di Tyr 15 fosforilato dalla Wee1
15
N
C Cdc2+
T Y G
mutagenesi sito-specifica
N
C Cdc2-F15Y
T F G



I mutanti Cdc2-F15Y
MPF è sempre attivo
Prematuro ingresso in
hanno fenotipo wee
Mitosi
46
Struttura della Cdk2 umana, omologa alla subunità
Cdc2 di MPF
 Zona di contatto
con la ciclina in
giallo
 Il T loop contiene
Thr stimolatoria
(T160)
 ATP
rappresentato con
sfere
47
Complesso Cdk2-ciclina A non fosforilato
(bassa attività)
Il legame della
ciclina A provoca
uno spostamento
del T loop che,
però, non
consente la
completa attività
chinasica
48
Complesso Cdk2-ciclina A fosforilato (elevata
attività)
La fosforilazione
della Thr
stimolatoria
aumenta la
affinità dei
substrati proteici
da fosforilare
49
Basi strutturali dell’attivazione della Cdk
50
Il modo in cui una Cdk agisce da
integratore di segnali
CAK attivatrice
Cdc25 attivatrice
Sito di attivazione
(Thr 161)
Sito di inibizione
(Tyr 15)
Wee1 inibitrice
51
Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae


Mutants have been identified that are “stuck” at some point in this
cycle (= cell division cycle, or cdc mutants).
Such mutants are lethal, and are maintained as ts (temperature
sensitive) alleles.
52
Mutanti cdc di S.cerevisiae
T. permissiva = 20-23 °C
T. restrittiva = 35-37 °C
Alla temperatura non
permissiva solo i mutanti cdc si
arrestano sempre allo stesso
punto del ciclo cellulare
Mutante cdc28ts di S. cerevisiae
Omologo di cdc2ts di S. pombe53
Dimostrazione sperimentale del punto di
START in S. cerevisiae
54
INTERFASE PRECOCE DI S. CEREVISIAE



ts
cdc7
Inizia la sintesi di DNA
Si forma la gemma
Si duplica il corpo del fuso polare
Mutanti che non iniziano la sintesi di
DNA alla T. restrittiva
ts
Mutanti che non formano la gemma
alla T. restrittiva
ts
Mutanti che non duplicano il corpo del
fuso polare alla T. restrittiva
ts
Mutanti che alla T. restrittiva
bloccano TUTTI gli eventi a valle
cdc24
cdc31
cdc28
55
Mappa logica del ciclo cellulare di S. cerevisiae
56
ts
I mutanti cdc7 ,
cdc24ts e cdc31ts
bloccano eventi a valle
individuali
cdc28ts è un
componente chiave del
macchinario del ciclo
cellulare
57
La scoperta del mutante cdc28 di S.
cerevisiae ha consentito di definire il punto
di START:
ts
 Lo START viene definito come il momento in cui
la replicazione del DNA, la formazione della
gemma e la duplicazione del corpo del fuso polare
diventano insensibili alla perdita di funzione di
Cdc28;
 Il punto di START rappresenta la fine di un
processo che impegna irreversibilmente le cellule
a replicare il proprio DNA;
 Quando le cellule oltrepassano il punto di START
sono irrevocabilmente destinate ad entrare in S
58
Cellule che completano un ciclo cellulare in un tempo
inferiore a quello richiesto per raddoppiare la propria
taglia diventerebbero progressivamente sempre più piccole
 Tutte le cellule eucariotiche replicano il proprio DNA e
segregano i cromosomi in tempi inferiori a quelli richiesti per
raddoppiare le proprie dimensioni
 Si impiega meno tempo a completare un ciclo di divisione
cellulare che a raddoppiare le dimensioni cellulari
59
Nel lievito S. cerevisiae la divisione produce due
cellule figlie di dimensioni differenti. Se fosse
necessario SOLO raddoppiare la taglia per poter
andare incontro ad un altro ciclo di divisione cellulare
si avrebbero degli effetti catastrofici!!
60
La crescita cellulare e il ciclo di divisione
cellulare sono coordinati
La cellula figlia deve
crescere più della cellula
madre per arrivare alla
taglia critica necessaria
per passare attraverso il
punto di START, quindi
l’intervallo G1 è più
lungo
61
I lieviti che si riproducono per gemmazione usano
il punto di START come punto di controllo delle
dimensioni e delle condizioni esterne. Cosa succede
se mancano i nutrienti?
 Le cellule mantengono sempre una quantità
di minima di nutrienti sufficiente per
affrontare UNA replicazione, UNA mitosi
ed UNA divisione cellulare;
 Le cellule reagiscono alla mancanza di
nutrienti arrestando il ciclo cellulare in un
punto preciso
62
Destino alternativo di S. cerevisiae in
prossimità del punto di START
63
La scoperta del mutante cdc28 di S.
cerevisiae ha consentito di definire il punto
in cui le cellule si bloccano e verificano se
ci sono tutte le condizioni per passare
attraverso il punto di START.
ts
Lo studio della coniugazione di cellule
aploidi di S. cerevisiae ha consentito di
chiarire quali sono i fattori in grado di
“regolare” il passaggio attraverso il punto
di START
64
Le cellule aploidi di lievito
producono fattori di
accoppiamento (feromoni) e
i loro recettori
In presenza di una
quantità sufficiente di
nutrienti le cellule si
moltiplicano come diploidi,
ma in loro assenza sono
indotte alla meiosi
65
Accoppiamento nel budding yeast
Affinchè avvenga la coniugazione è necessario:
Che le due cellule aploidi siano di “tipo” differente
Che le due cellule si trovino nella stessa fase del
ciclo cellulare (G1)
66
Quando i feromoni a e α legano i rispettivi
recettori attivano una trasduzione del segnale
intracellulare che prevede due differenti strade:
 Arresto del ciclo cellulare allo START
 Espressione di geni coinvolti nel processo
dell’accoppiamento
Questo meccanismo consente la coniugazione
solo alle cellule che sicuramente hanno già
duplicato correttamente il proprio DNA e che
sono in “sosta” allo START
67
PATHWAY DI SEGNALAZIONE
feromoni a o α legati
ai rispettivi recettori
Arresto in G1
(prima dello START)
Attivazione di geni di
accoppiamento
68
I mutanti resistenti
all’accoppiamento possono
essere distinti in due gruppi:
MUTANTI ARRESTO-DIFETTIVI
MUTANTI DI SEGNALAZIONE
69
Regulation of G1/S transition (start/restriction point)
Identification of yeast G1 cyclin
Genetic screen: add α-mating factor to yeast culture
Screen for ts mutants that continue to grow at 37oC
in presence of α-mating factor
CLN3 mutant: unable to respond to α-mating factor
mutant cells smaller than wild type
CLN3 cloned: weakly homologues to CyclinB
Levels of CLN3 affect ability of yeast to pass START
70
Dosage effect of CLN3
La selezione di mutanti
arresto-difettivi ha
portato all’isolamento
del gene CLN3
∆ cln3 indica assenza del
gene
CLN3-1D indica il mutante
in cui è presente una
delezione al C-ter che
stabilizza la proteina
71
N
C Cicline mitotiche
N
C Cicline G1
Box di distruzione riconosciuto dalla ubiquitina
Box di distruzione: sequenza PEST
Regione di elevata omologia fra le cicline
72
La ricerca di
mutanti capaci di
sopperire alcune
mutazioni cdc28ts
ha portato
all’isolamento di
altre cicline G1
CLN1 e CLN2
73
Dimostrazione che le cicline G1 regolano
l’ingresso in S in S. cerevisiae
✥ Delezione dei geni codificanti per le cicline G1 (CLN1,
2, 3)
✥ Trasformazione delle cellule prive di CLN1, 2 e 3
con vettore di espressione in cui CLN3 è sotto il
controllo del promotore forte GAL1 (inibito da
glucosio)
✥ Inibizione della espressione di CLN3 in presenza di
glucosio
✥ Espressione di CLN3 in assenza di glucosio
74
Proof that G1 Cyclins control Start
Inducible Cln3:
To examine cell cycle state:

stain with DNA dye

pass through fluorescence-activated cell
sorter
2 peaks: G1 cells (1N) and G2 cells (2N)
75
Il prodotto
dei geni
CLN1, 2 e 3 è
indispensabile
per passare
attraverso il
punto di
START
76
 Le cicline CLN1, 2 e 3
sono intercambiabili
 C’è bisogno almeno di
una ciclina G1 per
passare attraverso il
punto di START
77
Regolazione delle cicline G1
Loop di feedback positivo che prevede sia attivazione
post-trascrizionale che post-traduzionale
78
Destino alternativo di S. cerevisiae in
prossimità del punto di START
79
La attivazione di proteine G da parte dei
feromoni porta all’arresto del ciclo cellulare
Il pathway di segnalazione è molto complesso
e richiede molti componenti
Il pathway di segnalazione mediato da
feromoni in S. cerevisiae è molto simile a
quello delle cellule di mammifero che è
mediato da fattori di crescita
I feromoni e i fattori di crescita regolano la
stessa transizione G1/S
80
MECCANISMI DI SEGNALAZIONE
81
Attivazione mediata da proteine G trimeriche
82
cAMP:
secondo
messaggero
83
84
IP3 e DAG: secondi messaggeri
85
86
Via di
segnalazione
mediata da
Ras
87
Sinergia fra vie di trasduzione del segnale
88
Cascata di proteine chinasi che trasmette segnali a valle di
proteine G trimeriche nella via di segnalazione mediata da
feromoni in S. cerevisiae
89
Fattore di accoppiamento
Attivazione Prot. G trimerica
Attivazione cascata di Chinasi
Fus3
Far1
Far1-P
Stop allo START
Fus3-P
Ste12
Ste12-P
Trascrizione geni
per accoppiamento
90
91
Differenti pathways di segnalazione a confronto
92
 La mancanza di nutrienti causa l’arresto
in G0
 Selezione di mutanti che presentano
difetti nel meccanismo di monitoraggio
della disponibilità di nutrienti
 Questi mutanti bloccano il passaggio
attraverso lo START alla T. non
permissiva e si comportano come se le
cellule si trovassero in carenza di
nutrienti
93
Isolamento del mutante cdc35ts
Il prodotto di cdc35+ è la
adenilato ciclasi che
catalizza la formazione di AMP
ciclico a partire dall’ATP
L’AMP ciclico attiva la chinasi
dipendente da cAMP
94
di cdc35+ causano un abbassamento dei
livelli di cAMP e quindi una riduzione della attività
della chinasi cAMP-dipendente.
Mutazioni
Una
minore attività della chinasi cAMP-dipendente
causa una diminuzione della velocità di sintesi proteica
La velocità di sintesi delle cicline G1
determina la possibilità o meno di passare
attraverso il punto di START
95
+
La attività della adenilato ciclasi Cdc35 + è
regolata da Ras (p21Ras)
96
Small GTP-binding proteins: active in the GTP-bound form
1. Intrinsic GTPase activity is poor
2. The catalytic cycle is regulated by other proteins:
GEFs (Guanine nucleotide exchange factors)
and
GAPs (GTPase-activating proteins)
Stimulated by GAP
Stimulated by GEF
97
La attività di Ras (p21Ras)
+
è regolata da Cdc25
Il prodotto di cdc25+ è la
proteina
che
scambia
nucleotidi
guanilici
(GEF).
Mutanti cdc25ts si bloccano
allo START (G0) perché Ras
si accumula nella sua forma
inattiva Ras-GDP
98
+
La attività di Cdc35 + è regolata da Ras
(p21Ras)
Velocità della
sintesi proteica OK
Cicline G1
Crescita OK
La capacità delle cellule
di arrestare il ciclo
cellulare in mancanza di
nutrienti è controllata
dalla attività di almeno
due proteine (cdc25+ e
cdc35+)
99
Pathway di segnalazione mediato dalla
mancanza di nutrienti (arresto in G0)
Cdc25
p21Ras-GTP
Cdc35
ATP
(proteina che scambia nucleotidi guanilici)
(Proteina G monomerica)
(adenilato ciclasi)
cAMP
Chinasi cAMP-dipendente
Effetto sulla velocità della sintesi
proteica
Sintesi cicline G1 OK
Crescita e progressione del ciclo cellulare
100
Destino di S. cerevisiae durante la
transizione G1/S
Arresto in G0
Arresto in G1
G1
Sporulazione (cellule diploidi)
Accoppiamento (cellule aploidi)
101