Lavoro di diploma di Fabrizio Vanzetta SSMT, 2005.

Gennaio - Giugno 2005
VALUTAZIONE DELL’ ATTIVITÀ ANTIPROLIFERATIVA E
CITOTOSSICA DI UN FARMACO ANTITUMORALE
Fabrizia Vanzetta, 3LM
Scuola Superiore Medico Tecnica
Lavoro svolto presso il
Laboratorio di Oncologia Sperimentale
Istituto Oncologico della Svizzera Italiana (IOSI), Bellinzona
Responsabile
Dr. Carlo V. Catapano
INDICE
RIASSUNTO ............................................................................................................................ 4
INTRODUZIONE ...................................................................................................................... 5
SR271425.............................................................................................................................................. 5
Colture cellulari ................................................................................................................................... 5
Tests utilizzati...................................................................................................................................... 7
MTT..................................................................................................................................................................7
Test clonogenico ...........................................................................................................................................7
Ciclo cellulare.................................................................................................................................................7
MATERIALI E METODI............................................................................................................ 9
Colture cellulari ................................................................................................................................... 9
Come manipolare le cellule: sterilità ...........................................................................................................9
Ambiente di lavoro ....................................................................................................................................9
Attrezzatura e soluzioni ............................................................................................................................9
Manipolazione............................................................................................................................................9
Espansione della coltura ............................................................................................................................10
Messa in coltura ......................................................................................................................................10
SR271425............................................................................................................................................ 10
MTT ..................................................................................................................................................... 10
Test clonogenico............................................................................................................................... 11
Ciclo cellulare .................................................................................................................................... 11
RISULTATI............................................................................................................................. 13
MTT ..................................................................................................................................................... 13
Linee polmonari ...........................................................................................................................................13
Linee ovariche..............................................................................................................................................14
Test clonogenico............................................................................................................................... 15
Ciclo cellulare .................................................................................................................................... 16
COMMENTI AI RISULTATI - DISCUSSIONE ........................................................................ 18
MTT ..................................................................................................................................................... 18
Test clonogenico............................................................................................................................... 18
Ciclo cellulare .................................................................................................................................... 18
CONCLUSIONE ..................................................................................................................... 19
BIBLIOGRAFIA...................................................................................................................... 20
RINGRAZIAMENTI ................................................................................................................ 21
ALLEGATI.............................................................................................................................. 22
Allegato 1 ........................................................................................................................................... 22
Terreni di coltura..........................................................................................................................................22
2
Sistemi tampone......................................................................................................................................22
Allegato 2 ........................................................................................................................................... 23
Tabella delle IC50 ..........................................................................................................................................23
3
RIASSUNTO
Lo scopo di questo lavoro di diploma è
stato valutare l’attività di un potenziale
farmaco antitumorale su linee cellulari di
tumore ovarico e polmonare.
Molti composti di questo genere, capaci di
legarsi al DNA e quindi d’interferire con la
trascrizione di geni, sono tuttora in fase di
sperimentazione
come
farmaci
antitumorali nel laboratorio di Oncologia
Sperimentale dell’Istituto Oncologico della
Svizzera Italiana, Bellinzona.
Oggetto del presente studio è il composto
SR271425, un derivato del tioxantone.
Studi preclinici compiuti sia in vivo che in
vitro hanno dimostrato l’elevata attività di
questo farmaco su diversi modelli tumorali
murini ed umani.
L’ipotesi di lavoro è che SR271425,
legandosi al DNA, possa interferire
selettivamente con la trascrizione di geni
critici per la proliferazione e la
sopravvivenza di cellule tumorali. Per
questo motivo è stata testata la
citotossicità del farmaco su un pannello di
linee di tumori ovarico e polmonare
utilizzando un test colorimetrico (MTT
assay) ed un test clonogenico.
In un secondo tempo sono state
analizzate alterazioni del ciclo cellulare
utilizzando metodiche citofluorimetriche.
In futuro, si valuteranno gli effetti del
farmaco sulla trascrizione di geni espressi
ad alti livelli in cellule di tumore ovarico e
polmonare.
The aim of this diploma work has been to
evaluate the activity of a potential
anticancer drug on ovarian and lung
cancer cell lines.
Many compounds that are able to bind
DNA, and therefore to interfere with gene
transcription, are currently in experimental
phase as anticancer drugs in the
laboratory of Experimental Oncology,
Oncology Institute of the Southern
Switzerland, Bellinzona.
The object of this study is the compound
SR271425, a derivate of thioxantone.
Preclinical studies done both in vivo and
in vitro have demonstrated the high level
of activity of this drug on many models of
murine and human tumors.
The
working
hypothesis
is
that
SR271425, in binding DNA, interferes
selectively with the transcription of genes
critical in the proliferation and survival of
tumor cells. Therefore at the beginning
the cytotoxicity of the drug on ovarian and
lung tumor cell lines was tested using a
colorimetric assay (MTT assay) and a
clonogenic assay.
After that alterations of the cell cycle were
assessed with cytofluorimetric methods.
Future studies will assess the effects of
the drug on transcription of genes overexpressed in ovarian and lung cancer
cells.
4
INTRODUZIONE
L’obiettivo di questo lavoro è valutare l’attività antiproliferativa e citotossica del composto
SR271425, e studiarne i meccanismi d’azione.
Partendo dall’ipotesi che il farmaco, legandosi al DNA, possa interferire selettivamente con la
trascrizione di geni critici per la proliferazione e sopravvivenza di cellule tumorali, si è
proceduto nel seguente modo: sono stati valutati gli effetti su crescita e sopravvivenza di linee
cellulari derivate da tumori dell’ovaio e del polmone dapprima usando un test colorimetrico
(MTT assay) e successivamente un test clonogenico. In seguito sono state studiate le
alterazioni del ciclo cellulare e l’eventuale presenza di apoptosi usando metodiche
citofluorimetriche.
SR271425
L’SR271425 è un derivato del tioxantone (1), composto ad attività antitumorale attualmente in
fase di sperimentazione clinica. Studi preclinici, compiuti sia in vitro che in vivo su modelli
animali, ne hanno dimostrato l’elevata attività antitumorale. E’ noto che, come altri composti
della stessa famiglia, è in grado di legarsi al DNA, ma non si conoscono ancora i meccanismi
d’azione alla base del suo effetto antitumorale. A concentrazioni terapeuticamente rilevanti
non sembra inibire nè enzimi coinvolti nel metabolismo del DNA nè altri bersagli solitamente
colpiti dai farmaci antitumorali, quali topoisomerasi I e II o elicasi; è anche improbabile che il
composto possa alchilare il DNA (1).
L’ipotesi di partenza di questo lavoro è che il farmaco, legandosi al DNA, possa inibire la
trascrizione di geni critici per la proliferazione e sopravvivenza di cellule tumorali.
Dai tests di proliferazione cellulare eseguiti al National Cancer Institute (NCI, Bethesda USA)
su un campione di 60 linee cellulari, un trattamento di 48h con SR271425 ha dato come
risultato un’IC50 media 1 di 1.7 µM, con un range compreso tra 0.28 µM e 10 µM. Le linee
tumorali più sensibili al farmaco sono risultate quelle di polmone e colon (1).
Colture cellulari
Nel corso degli ultimi anni le colture cellulari hanno giocato un ruolo chiave nello sviluppo di
nuovi farmaci antitumorali; questo tipo di studi ha infatti permesso di ampliare le conoscenze
sull’uptake ed il flusso dei farmaci all’interno della cellula, sui loro effetti sul metabolismo
cellulare, sulla capacità d’interagire con i recettori cellulari, etc (2).
Colture cellulari, combinate per esempio con metodi colorimetrici in grado di misurare l’attività
antiproliferativa, costituiscono la base fondamentale per lo screening su larga scala di nuovi
composti citotossici e citostatici. Tests clonogenici sono spesso utilizzati per misurare la
1
IC50 è la concentrazione dell’agente citotossico alla quale la metà delle cellule non prolifera (2).
5
sopravvivenza delle cellule e la loro capacità di proliferare a seguito dell’ esposizione con il
farmaco citotossico (2).
Nuovi e promettenti approcci prevedono l’utilizzo di
colture tridimensionali allo scopo di misurare la
capacità di diffusione del farmaco ed il suo potenziale
d’azione in un ambiente che si avvicina molto a quello
del tumore vero e proprio (2).
Una coltura cellulare deriva da cellule isolate da tessuti
fatte crescere in un terreno di coltura che offra loro le
condizioni ed i nutrienti necessari per la crescita (3, 4;
vedi allegato 1). Al normale terreno di coltura è
possibile aggiungere antibiotici al fine di preservare la
coltura cellulare da eventuali contaminazioni batteriche
o da micoplasma (5); anche se questo non sempre è
FIGURA 1: Linea cellulare di tumore
polmonare A549 (6).
vantaggioso in quanto potrebbe mascherare una
contaminazione,
impedendone
una
rapida
identificazione.
Si possono distinguere due tipi di colture cellulari: in sospensione, come nel caso delle cellule
ematopoietiche, ed in adesione. Queste ultime provengono da tessuti solidi, per proliferare
necessitano di una superficie alla quale attaccarsi e crescono formando un monostrato (4).
FIGURA 2: Andamento delle cellule in coltura in
funzione del tempo. Modificato da (3).
Lo sviluppo delle cellule in coltura può essere diviso in tre fasi (figura 2). Una prima fase di
stasi in cui le cellule si adattano alla nuova condizione e superano lo stress dato dalla
manipolazione; una seconda fase di crescita esponenziale ed una terza in cui le cellule
giungono a confluenza e vanno incontro alla morte per inibizione da contatto e per mancanza
di sostanze nutritive (3).
6
Tests utilizzati
MTT
Questo tipo di test consente di valutare l’attività citotossica di un farmaco; tanto più un
farmaco è attivo da questo punto di vista, tanto più alto sarà il numero di cellule che smetterà
di proliferare e lo farà in modo dipendente dalla dose.
Il saggio si basa sul principio che le cellule proliferanti sono in grado di trasformare i sali di
tetrazolio (MTT; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) in formazano
(cristalli blu-neri). Il risultato del test viene valutato misurando allo spettrofotometro le densità
ottiche emesse dai diversi pozzetti (3). Nei pozzetti più scuri ci saranno le cellule che stanno
proliferando, mentre nei pozzetti più chiari le cellule si saranno fermate sotto l'effetto del
farmaco.
Questo tipo di test è relativamente rapido e conveniente, perché viene realizzato dalla semina
alla misura delle densità ottiche nella stessa piastra ed i dati ottenuti allo spettrofotometro
possono essere analizzati in modo semplice e veloce (7). Grazie alla sua semplicità e
convenienza viene utilizzato per lo screening su larga scala di farmaci (2).
FIGURA 3: Esempio di MTT. Da sinistra il controllo, al quale seguono concentrazioni crescenti di
farmaco. Si può notare la diminuzione della proliferazione cellulare in rapporto alla concentrazione
di farmaco, grazie alla diminuzione della colorazione nera nei pozzetti.
Test clonogenico
Questo test serve a valutare la capacità delle cellule tumorali di formare colonie anche in
presenza del farmaco. Le cellule vengono seminate a basse concentrazioni e subito trattate
con dosi crescenti di farmaco; dopo diversi giorni si conta il numero di colonie formate.
Rispetto all’ MTT richiede un tempo maggiore e permette di valutare l’azione del farmaco a
lungo termine (2).
Ciclo cellulare
L’analisi del ciclo cellulare (figura 5) è importante per lo studio dell’attività di un farmaco,
permette infatti di capire quale può essere il meccanismo d’azione del farmaco in una
determinata linea cellulare. L’analisi del campione viene effettuata usando la citometria di
flusso: singole cellule scorrono in fila grazie ad un flusso laminare e vengono colpite da un
raggio di luce. In questo modo è possibile valutarne la grandezza, la densità e, a dipendenza
della colorazione utilizzata, anche il contenuto di DNA e proteine (5). Per determinare il
7
contenuto di DNA, e quindi riconoscere la fase del ciclo in cui si trova la cellula (figura 4), il
colorante maggiormente utilizzato è lo ioduro di propidio che s’intercala al DNA e viene
eccitato a 488 nm con un laser ad argon. Per fare in modo che il colorante penetri nella
cellula, è necessario permeabilizzare e fissare le cellule prima della colorazione (5).
FIGURA 4: Schema del ciclo cellulare (8).
FIGURA 5: Istogramma del ciclo cellulare
analizzato con il citometro di flusso, con le fasi
G1, S e G2 (9).
Come si può vedere nella figura 5, le cellule nella fase G2 hanno un contenuto di DNA doppio
rispetto alla fase G1. Questo perché le cellule che si trovano in fase G1 non hanno ancora
duplicato il DNA (2n) 2 , mentre nella fase G2 (precedente alla mitosi) la duplicazione è
avvenuta e le cellule hanno un contenuto di DNA pari a 4n. Nella fase S la quantità di DNA è
intermedia rispetto a G1 e G2; vi sono infatti cellule che non hanno ancora duplicato
completamente il loro DNA (10).
Farmaci che danneggiano il DNA bloccano le cellule in punti di controllo del ciclo cellulare, in
particolare in fase G1 ed in fase G2 (2). Questo blocco viene attivato dalla cellula per favorire
la riparazione del danno prima di procedere con la duplicazione.
2
n= un corredo cromosomico, 23 cromosomi.
8
MATERIALI E METODI
Colture cellulari
Le linee cellulari tumorali di polmone e d’ovaio (LGC Promochem/ATCC, Molsheim Cédex F)
sono state coltivate in fiasche con una superficie d’adesione di 25 cm2, con terreno RPMI
1640 (RPMI + 25 mM HEPES + L-glutamina; Invitrogen AG, Basel CH) ed aggiunta del 10%
di FBS (Siero Bovino Fetale; Invitrogen AG, Basel CH). Sono state cresciute in incubatore a
37°C con un apporto del 5% d’anidride carbonica (CO2).
Come manipolare le cellule: sterilità
Ambiente di lavoro
Condizione fondamentale per lavorare con le colture cellulari è la sterilità. Per questo è
necessario utilizzare cappe a flusso laminare con filtri appositi, all’interno delle quali si
possono aprire le fiasche contenenti le cellule, così come le bottiglie con il terreno di coltura e
altre soluzioni che devono rimanere sterili.
La cappa a flusso laminare delimita un’area di lavoro sterile; il flusso d’aria crea infatti una
barriera nella parte anteriore della cappa, dove si trova l’operatore (5), che serve a prevenire
l’entrata di contaminanti trasportati dall’aria nella cappa.
L’area di lavoro all’interno della cappa dovrebbe essere pulita regolarmente con etanolo al
70% (5).
Generalmente questo tipo di cappe sono equipaggiate anche con lampade ad ultravioletti (5),
da accendere 35 minuti a fine giornata per sterilizzare.
Attrezzatura e soluzioni
Tutto l’equipaggiamento utilizzato per le colture cellulari deve essere sterile.
Normalmente le pipette utilizzate sono di plastica, acquistate già sterili ed impacchettate
singolarmente, monouso, così come le fiasche di coltura. Tutto il materiale non sterile, come
ad esempio i puntali per le pipette, deve essere autoclavato.
I terreni di coltura, il siero ed altre soluzioni, si possono acquistare sterili e pronti all’uso.
Manipolazione
Tutto ciò che viene a contatto con le cellule deve essere aperto esclusivamente nella cappa a
flusso laminare. Questo vale per il terreno di coltura ed altre soluzioni, così come per le
pipette ed altro materiale sterile.
All’interno della cappa le bottiglie con le soluzioni possono rimanere aperte (5), i tappi si
possono posare sulla superficie di lavoro ma solo capovolti, altrimenti i bordi si
contaminerebbero. Per evitare contaminazioni involontarie è comunque buona regola
chiudere sempre le bottiglie e le fiasche di coltura dopo ogni operazione.
Inoltre è consigliabile controllare giornalmente al microscopio le cellule in coltura per
osservare la crescita ed assicurarsi che non siano contaminate in modo evidente da batteri
(5).
9
Espansione della coltura
Quando le cellule ricoprono l’80% della superficie della fiasca e sono ancora in attiva
proliferazione, è necessario espandere la coltura, evitando così che le cellule subiscano
modificazioni a causa dell’inibizione da contatto.
Dopo avere tolto il terreno di coltura dalla fiasca, la superficie sulla quale aderiscono le cellule
è stata lavata con 5 ml di PBS 1X sterile (pH 7.4 ± 0.05, NOMgCl2, NOCaCl2; Invitrogen AG,
Basel CH) a temperatura ambiente. Con l’aggiunta di 500 µl di tripsina (tripsina 0.5% EDTA;
Fluka Chemie GmbH, Buchs CH) ed un’incubazione di 5 minuti a 37°C, le cellule sono state
staccate dalla fiasca. A questo punto sono state recuperate con 5 ml di terreno 3 e trasferite in
una provetta sterile da 15 ml. E’ stata eseguita una centrifugazione di 8 minuti a 1500 rpm per
rimuovere eventuali detriti cellulari e cellule morte. Dopo l’eliminazione del sovranatante le
cellule sono state risospese con 5 ml di terreno fresco.
Messa in coltura
Con il materiale risospeso sono state preparate due nuove fiasche per portare avanti la linea
e, nel caso servissero anche per un trattamento, sono state contate utilizzando il contatore
automatico Z2 Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton CA, USA).
SR271425
Il farmaco è fornito come polvere di colore giallo in un contenitore che lo protegge dalla luce e
deve essere conservato a 4°C. Ha una massa molecolare di 413.54 g/mol.
E’ solubile in cloroformio e dimetil-sulfossido (DMSO), difficilmente solubile in etanolo e
metanolo, e praticamente insolubile in acqua (1).
Per i nostri studi SR271425 è stato ricostituito in DMSO sterile (Fluka Chemie GmbH, Buchs
CH) alla concentrazione 20 mM (soluzione madre), dalla quale è stata effettuata una
diluizione a 1 mM sempre utilizzando DMSO sterile. Queste due soluzioni sono state
conservate a -20°C e scongelate secondo necessità.
MTT
Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti, 100 µl per pozzetto, alla
concentrazione necessaria (1.5x104 cellule/ml), facendo in modo che alla fine
dell’esperimento non fossero giunte a confluenza.
Dopo 24 h dalla semina per le linee polmonari e 72 h per le linee ovariche 4 , le cellule sono
state trattate con il farmaco a differenti concentrazioni (linee ovariche: 0.5 µM, 1 µM, 1.5 µM,
2 µM, 3 µM; linee polmonari: 0.25 µM, 0.5 µM, 1 µM, 1.5 µM, 2 µM).
3
4
Il terreno deve sempre essere ambientato in precedenza a 37°C.
Tempo necessario affinché possano aderire alla piastra.
10
Partendo dalla concentrazione 1 mM in DMSO, il farmaco è stato diluito serialmente con
terreno RPMI 1640 e 100 µl di ogni diluizione sono stati aggiunti ai rispettivi pozzetti, dopo
avere aspirato il terreno presente. La prima fila di pozzetti è stata tenuta come controllo non
trattato aggiungendo solo terreno di coltura.
Dopo 72 h è stato eseguito il saggio colorimetrico con l’aggiunta di 10 µl di soluzione MTT (5
mg/ml di PBS 1X sterile; Fluka Chemie GmbH, Buchs CH) ad ogni pozzetto. Dopo 4 h
d’incubazione a 37°C e 5% CO2, sono stati aggiunti 100 µl di soluzione di lisi (25% SDS,
0.025 N HCl) per ogni pozzetto. La piastra è stata incubata per 2 h a 37°C e 5% CO2. Infine è
stata eseguita la lettura delle densità ottiche a 570 nm con lo spettrofotometro Microplate
Reader AD 340 (Beckman Coulter, Fullerton CA, USA).
Dopo aver analizzato i dati è stata calcolata l’IC50 con il programma Rbioconductor.
Test clonogenico
Le cellule sono state seminate in piastre da 12 pozzetti a bassa concentrazione (IGROV1 e
SKOV3: 300 cellule/ml; A549: 200 cellule/ml), per fare in modo che aderissero al pozzetto
singolarmente. Subito dopo averle seminate, è stato aggiunto il farmaco con tre diverse
concentrazioni (1 µM, 2 µM, 4 µM), lasciando la prima fila non trattata come controllo.
Quando colonie formate da un numero maggiore di cinque cellule erano visibili al microscopio
nei pozzetti di controllo, è stato rimosso il terreno, i pozzetti sono stati lavati con PBS 1X ed è
stato aggiunto il colorante cristal violetto (1 g cristal violetto (Fisher Scientific Winiger, Wohlen
CH) in 100 ml EtOH 20%, filtrato). Dopo un’incubazione di 5 minuti, il colorante è stato
rimosso e le piastre sono state lavate in un becker con acqua corrente demineralizzata.
Ciclo cellulare
Le cellule sono state seminate in quattro fiasche con una superficie d’adesione di 25 cm2 ad
una concentrazione che, alla fine dell’esperimento, permettesse di avere a disposizione un
milione di cellule in ogni fiasca per l’analisi con il citometro di flusso (IGROV1: 2.5x104
cellule/ml, SKOV3: 1.5x104 cellule/ml, A549: 5.0x104 cellule/ml). Dopo 24 h dalla semina per
le linee polmonari, e 72 h per quelle ovariche, le cellule sono state trattate con le stesse
concentrazioni di farmaco stabilite già per il test clonogenico (1 µM, 2 µM, 4 µM), tenendo una
fiasca non trattata come controllo. Dopo 24 h dal trattamento è stato rimosso il terreno da
ogni fiasca e conservato in quattro provette separate, dopodiché le fiasche sono state lavate
con PBS sterile 1X e le cellule sono state staccate dalle fiasche con 500 µl di tripsina. Dopo 5
minuti d’incubazione a 37°C e 5% di CO2, le cellule sono state recuperate con 5 ml di terreno
ed aggiunte alle provette corrispondenti (contenenti già il terreno rimosso in precedenza). E’
stata eseguita una centrifugazione di 10 minuti a 1500 rpm, rimosso il sovranatante e le
cellule sono state lavate con 5 ml di PBS 1X con aggiunta dell’1% di FBS. A questo punto le
cellule sono state contate e, dopo una seconda centrifugazione di 10 minuti a 1500 rpm e
rimozione del sovranatante, sono state risospese con EtOH 80% conservato a -20°C (1 ml
11
per milione di cellule), aggiunto goccia a goccia agitando continuamente. Le cellule sono
state fissate per almeno un’ora a -20°C.
Dopo il periodo di fissazione è stato eseguito un lavaggio con PBS 1X con aggiunta dell’1% di
FBS (due volumi rispetto all’EtOH utilizzato), ed una centrifugazione di 10 minuti a 2000 rpm.
Le cellule sono state risospese con 2 ml di PBS 1X con l’aggiunta dell’1% di FBS e trasferite
nelle provette per FACS. E’ stata eseguita un’ultima centrifugazione di 10 minuti a 2000 rpm e
dopo la rimozione del sovranatante le cellule sono state risospese con una mix contenente
250 µl di Ribonucleasi A 150 KU 5 (Fluka Chemie GmbH, Buchs CH) e 250 µl di ioduro di
propidio 100 µg/ml (Fluka Chemie GmbH, Buchs CH). Dopo 15 min d’incubazione a
temperatura ambiente e al buio, le cellule sono state analizzate al citometro di flusso
FACScalibur (Becton Dickinson, Basel CH).
L’analisi dei dati è stata eseguita con il programma ModFit LT 3.0.
5
Unità di Kunitz.
12
RISULTATI
MTT
Linee polmonari
Le concentrazioni di farmaco utilizzate per eseguire questo test sono state scelte in base ai
risultati ottenuti dal National Cancer Institute. Partendo da questi dati abbiamo utilizzato una
serie di concentrazioni comprese tra 0.25 e 2 µM. Dopo un primo screening queste
concentrazioni sono risultate valide e sono state adottate per i successivi esperimenti.
Dai risultati dell’MTT ottenuti con le quattro linee polmonari (figura 6) si può vedere che A549
(IC50 0.95 µM) e H460 (IC50 0.88 µM) sono più sensibili, mentre H441 (IC50 2.73 µM) e H358
(IC50 3.15 µM) sono più resistenti al trattamento (vedi allegato 2).
Lo scopo di questo test era verificare l’attività di SR271425 e stabilire le concentrazioni da cui
partire per i tests seguenti (test clonogenico e ciclo cellulare).
A
B
A549
H460
120
% crescita cellulare
% crescita cellulare
120
100
80
60
40
20
100
0
80
60
40
20
0
Controllo
0.25
0.5
1
1.5
2
Controllo
Concentrazioni farmaco (µM)
0.25
0.5
1
1.5
2
Concentrazioni farmaco (µM)
D
C
H358
H441
140
% crescita cellulare
% crescita cellulare
120
100
80
60
40
20
120
100
80
60
40
20
0
0
Controllo
0.25
0.5
1
1.5
Concentrazioni farmaco (µM)
2
Controllo
0.25
0.5
1
1.5
2
Concentrazioni farmaco (µM)
FIGURA 6: Attività antiproliferativa in linee tumorali polmonari A549 (A), H460 (B), H441 (C) e H358 (D). Le
cellule sono state incubate con concentrazioni crescenti di SR271425. Dopo 72 h è stata misurata la capacità
proliferativa delle cellule mediante un saggio di MTT. I grafici rappresentano la media ± deviazione standard dei
campioni in triplicato.
13
Linee ovariche
Le linee ovariche scelte per questo studio sono interessanti in quanto rappresentano tre
diversi stati del gene p53: SKOV3 (nulle; 11), A2780 e IGROV1 (wild type; 12, 13), OVCAR5
(mutate; 12). Questo ci permette di studiare un eventuale coinvolgimento di p53 nella risposta
al trattamento (14). Dato che l’ipotesi è che SR271425 si leghi al DNA, le linee con p53 wild
type dovrebbero risultare più sensibili al trattamento.
Dai dati ottenuti si può osservare che delle quattro linee, le SKOV3 sono risultate essere le
meno sensibili, con un’inibizione del 50% superiore a 4 µM, mentre nelle altre linee l’inibizione
si ha a concentrazioni inferiori a 2.5 µM (vedi allegato 2).
Le concentrazioni di farmaco sono state scelte in seguito ai primi tests eseguiti sulle linee di
polmone. Non mostrando quest’ultime una risposta significativa a 0.25 µM, abbiamo deciso di
togliere questa concentrazione e di aggiungerne una maggiore (3 µM).
B
A
A2780
IGROV1
120
% crescita cellulare
% crescita cellulare
120
100
80
60
40
20
100
80
60
40
20
0
0
Controllo
0.5
1
1.5
2
Controllo
3
0.5
1.5
2
3
2
3
D
C
OVCAR5
SKOV3
120
120
100
100
% crescita cellulare
% crescita cellulare
1
Concentrazioni farmaco (µM)
Concentrazioni farmaco (µM)
80
60
40
20
80
60
40
20
0
0
Controllo
0.5
1
1.5
Concentrazioni farmaco (µM)
2
3
Controllo
0.5
1
1.5
Concentrazioni farmaco (µM)
FIGURA 7: Attività antiproliferativa in linee tumorali ovariche IGROV1 (A), A2780 (B), SKOV3 (C) e OVCAR5 (D).
Le cellule sono state incubate con concentrazioni crescenti di SR271425. Dopo 72 h è stata misurata la capacità
proliferativa delle cellule mediante un saggio di MTT. I grafici rappresentano la media ± deviazione standard dei
campioni in triplicato.
14
Test clonogenico
Abbiamo eseguito il test con tre linee cellulari, scegliendole in base alla risposta mostrata
nell’MTT: una linea polmonare ed una ovarica, A549 e IGROV1, risultate più sensibili al
farmaco; ed una linea ovarica, SKOV3, risultata meno sensibile al farmaco.
Le concentrazioni di farmaco sono state scelte in base ai risultati ottenuti dall’MTT.
Come si può vedere dalle figure 8, 9, e 10, l’SR271425 inibisce totalmente la crescita delle
colonie di A549 e IGROV1 già a 2 µM, mentre per SKOV3 l’inibizione a 2 µM non è ancora
completa.
Per questo test abbiamo scelto differenti concentrazioni iniziali di cellule a dipendenza
dell’efficienza di formare colonie della linea utilizzata.
Controllo
1 µM
2 µM
4 µM
FIGURA 8: Test clonogenico effettuato con con cellule di tumore ovarico
IGROV1. Concentrazione iniziale di cellule: 300/pozzetto. Trattamento con tre
differenti concentrazioni di farmaco per una durata di 8 giorni.
Controllo
1 µM
2 µM
4 µM
FIGURA 9: Test clonogenico effettuato con con cellule di tumore ovarico
SKOV3. Concentrazione iniziale di cellule: 300/pozzetto. Trattamento con tre
differenti concentrazioni di farmaco per una durata di 8 giorni.
Controllo
1 µM
2 µM
4 µM
FIGURA 10: Test clonogenico effettuato con cellule di tumore polmonare A549.
Concentrazione iniziale di cellule: 200/pozzetto. Trattamento con tre differenti
concentrazioni di farmaco per una durata di 8 giorni.
15
Ciclo cellulare
A
B
C
SKOV3 CONTROLLO
5000
4000
2000
20
40
60
Channels (FL3-H)
80
100
120
3000
1000
0
0
1000
0
0
0
20
40
60
Channels (FL3-H)
80
100
120
100
120
100
120
5000
Number
3000
G1: 63.8%
S: 29.2%
G2: 7.0%
1000
0
20
IGROV1 2 µM SR271425
40
60
Channels (FL3-H)
80
100
0
120
20
SKOV3 2 µM SR271425
40
60
Channels (FL3-H)
80
100
120
A549 2 µM SR271425
G1: 69.5%
S: 23.9%
G2: 6.6%
0
0
0
1000
1000
2000
4000
Number
3000
2000
3000
G1: 69.5%
S: 16. 1%
G2: 14.4%
2000
G1: 61.0%
S: 23.5%
G2: 15.5%
Number
Number
4000
4000
5000
6000
5000
6000
80
0
0
80
60
Channels (FL3-H)
2000
3000
2000
1000
1000
60
Channels (FL3-H)
40
4000
5000
Number
G1: 51.3%
S: 31.8%
G2: 16.9%
0
40
20
A549 1 µM SR271425
4000
5000
4000
Number
2000
3000
G1: 61.5%
S: 24.4%
G2: 14.1%
20
0
SKOV3 1 µM SR271425
6000
IGROV1 1 µM SR271425
0
G1: 62.4%
S: 29.9%
G2: 7.8%
Number
3000
Number
G1: 49.0%
S: 31.0%
G2: 20.0%
1000
2000
3000
Number
G1: 56.8%
S: 28.5%
G2: 14.7%
A549 CONTROLLO
2000
4000
4000
5000
5000
6000
IGROV1 CONTROLLO
0
20
40
60
Channels (FL3-H)
80
100
120
0
20
60
Channels (FL3-H)
80
100
0
120
20
SKOV3 4 µM SR271425
40
60
Channels (FL3-H)
80
100
120
A549 4 µM SR271425
6000
Number
G1: 90.3%
S: 2.0%
G2: 7.7%
0
0
0
1000
2000
4000
3000
2000
G1: 79.6%
S: 6.0%
G2: 14.5%
2000
G1: 62.2%
S: 20.9%
G2: 16.9%
Number
4000
Number
4000
6000
5000
IGROV1 4 µM SR271425
40
0
20
40
60
Channels (FL3-H)
80
100
120
0
20
40
60
Channels (FL3-H)
80
100
120
0
20
40
60
Channels (FL3-H)
80
100
120
FIGURA 11: Analisi del ciclo cellulare eseguita con le linee ovariche IGROV1 (A) e SKOV3 (B), e la linea
polmonare A549 (C) dopo un trattamento di 24 h e colorazione con ioduro di propidio. L’analisi è stata
eseguita con il citometro di flusso.
16
Abbiamo eseguito il test con le stesse linee cellulari utilizzate in precedenza per il test
clonogenico.
Nella figura 11 si può vedere che il farmaco induce un blocco in fase G1 nelle linee con p53
wild type IGROV1 (aumento da 56.8% a 79.6%) e A549 (aumento da 62.4% a 90.3%) e alla
concentrazione 4 µM la fase S scompare in entrambe le linee. Per la linea ovarica SKOV3
con p53 nullo, abbiamo osservato qualitativamente la stessa risposta ottenuta con le due
linee polmonari, ma quantitativamente più debole. Questi dati sono dunque in accordo con
quelli ottenuti con gli altri tests, MTT e clonogenico.
17
COMMENTI AI RISULTATI - DISCUSSIONE
MTT
L’esecuzione di questo test ci ha permesso di verificare l’attività di SR271425, stabilendo le
concentrazioni da cui partire per i tests previsti.
Dai risultati si può vedere che il farmaco è attivo ed inibisce la proliferazione delle cellule in
modo dipendente dalla dose.
Alcune linee cellulari utilizzate sono risultate più sensibili di altre, com’è il caso per le A549
(p53 wild type; 15), H460 (p53 wild type; 15) per le linee polmonari (figura 6). H358 (p53
nulle; 15) e H441 (p53 mutate; 16) sono sembrate invece più resistenti al trattamento (figura
6).
Tra le linee di tumore ovarico si nota particolarmente la scarsa sensibilità di SKOV3 (p53
nulle), con un’inibizione del 50% superiore a 4 µM, mentre nelle altre linee l’inibizione si ha a
concentrazioni attorno a 2 µM (figura 7).
Test clonogenico
Con questo test abbiamo voluto verificare la capacità delle cellule tumorali di formare colonie
dopo il trattamento con il farmaco.
Grazie a questo test possiamo anche affermare che il farmaco ha un effetto prolungato nel
tempo.
I risultati di questo test concordano dunque con quelli ottenuti con l’MTT.
Ciclo cellulare
Dall’analisi del ciclo cellulare (figura 11), si può notare chiaramente come il farmaco induca
un blocco in G1 e, ad alte concentrazioni, la scomparsa della fase S nelle linee cellulari
IGROV1 e A549, entrambe con p53 wild type. E’ interessante notare la differenza quantitativa
con la linea ovarica SKOV3, con p53 nullo. Con questa linea otteniamo lo stesso tipo di
risposta riscontrata con IGROV1 e A549, ma qualitativamente più debole. Questo conferma la
maggiore resistenza di questa linea ovarica a SR271425.
I dati ottenuti concordano con l’ipotesi che il farmaco si lega al DNA e attiva p53. E’ infatti in
fase G1 che le cellule con p53 intatto si bloccano per cercare di riparare un danno. Questa
fase è dunque un punto di controllo nel quale la cellula può fermare la duplicazione del DNA,
prima di entrare in mitosi. La diminuzione della fase S si osserva perché le cellule vengono
bloccate in G1 e non passano oltre.
I risultati ottenuti con SKOV3 ci fanno pensare che il farmaco non induca solamente
l’attivazione di p53, ma che ci sia anche un altro meccanismo alla base del suo
funzionamento ed effetti sul ciclo cellulare.
18
CONCLUSIONE
Grazie a questi studi preliminari abbiamo potuto verificare l’attività di SR271425 ed osservare
il suo influsso sul ciclo cellulare di tre differenti linee tumorali.
E’ nostra intenzione osservare il comportamento nel test clonogenico e nel ciclo cellulare
anche della linea tumorale H441, essendo essa p53 mutata.
Per confermare un coinvolgimento di p53 nella risposta al farmaco, verrà studiata
l’espressione di p53 proteina e di proteine da essa regolate (p21, bax, ecc.) dopo trattamenti
a diversi tempi (14).
Inoltre verrà studiata un’ eventuale presenza di apoptosi cellulare trattando le cellule per
tempi più o meno lunghi e studiando l’attivazione di proteine che sono notoriamente coinvolte
nel processo apoptotico (parp, caspasi; 7).
In futuro, si valuteranno gli effetti di SR271425 sulla trascrizione di geni espressi ad alti livelli
in cellule di tumore ovarico e polmonare.
Questi risultati ci permetteranno di identificare le condizioni sperimentali da utilizzare in studi
futuri sui meccanismi d’azione del farmaco ed in studi clinici.
19
BIBLIOGRAFIA
(1) Dati forniti dalla ditta produttrice (Sanofi-Synthelabo, Malvern, PA USA)
(2) Baguley, B., C., Kerr, D., J.; Anticancer Drug Development; Academic Press (2002)
(3) Mariottini, G. L., Capicchioni, V., Guida, L., Mattioli, F., Penco, S., Romano, P., Scarabelli,
L.; Introduzione Alle Colture Cellulari; Morgan (2003)
(4) Guenzi, S.; Terreni, reagenti e supplementi per Tissue Culture; Biotecnologie 2000 (2004)
(5) Spector, D. L, Goldman, R., D. Leinwand, L., A.; Cells, A Laboratory Manual. Volume 1:
Culture and Biochemical Analysis of Cells; Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)
(6) http://www.amaxa.com/a549.html
(7) Roche Applied Science; Apoptosis, Cell Death and Cell Proliferation; Third edition
(8) Roche Applied Science Lab FAQS; second edition
(9) http://science.cancerresearchuk.org/sci/facs/facs_major_apps/cell_cycle_analysis/
(10) Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J., D.; Molecular Biology of
the Cell, Third Edition; Garland Publishing
(11) Sasaki, H., Sheng, Y., Kotsuji, F., Tsang, B., K.; Down-regulation of X-linked Inhibitor of
Apoptosis Protein Induces Apoptosis in Chemoresistant Human Ovarian Cancer Cells;
Cancer Research 60, 5659-5666 (2000)
(12) Mitsuuchi, Y., Johnson, S., W., Selvakumaran, M., Williams, S., J., Hamilton, T.,C.,
Testa, J., R.; The Phosphatidylinositol 3-kinase/AKT Signal Transduction Pathway Plays
a Critical Role in the Expression of p21WAF1/CIP1/SDI1 Induced by Cisplatin and
Paclitaxel; Cancer Research 60, 5390-5394 (2000)
(13) Casalini, P., Botta, L., Menard, S.; Role of p53 in HER2-induced Proliferation or
Apoptosis; The Journal of Biological Chemistry 276, 12449-12453 (2001)
(14) Bode, A., M., Dong, Z.; Post-Translational Modification of p53 in Tumorigenesis; Nature
Reviews Cancer 4, 793-805 (2004)
(15) Fukazawa, T., Walter, B., Owen-Schaub, L., B.; Adenoviral Bid Overexpression Induces
Caspase-dependent Cleavage of Truncated Bid and p53-independent Apoptosis in
Human non-small Cell Lung Cancers; The Journal of Biological Chemistry 278, 2542825434 (2003)
(16) Khan, Q., A., Anderson, L., M.; Hydrocarbon Carcinogens Evade Cellular Defense
Mechanism of G1 Arrest in Nontransformed and Malignant Lung Cell Lines; Toxicology
and Applied Pharmacology 173, 105-113 (2001)
20
RINGRAZIAMENTI
Ringrazio di cuore le seguenti persone:
La mia famiglia e Lorenzo, che in questi mesi mi sono stati particolarmente vicini.
Prof. Franco Cavalli, per avermi dato la possibilità di svolgere il mio lavoro di diploma presso
il Laboratorio di Oncologia Sperimentale dell’Istituto Oncologico della Svizzera Italiana.
Dr. Carlo Catapano, per avermi seguita ed aiutata durante lo svolgimento del mio lavoro di
diploma.
Veronica Albertini, per la sua disponibilità, il suo aiuto, i suoi preziosi insegnamenti ed il
supporto ricevuto durante lo svolgimento di questo lavoro.
Sara Napoli, per avermi gentilmente aiutata con l’analisi al FACS.
Claudio Realini, per i dati forniti e la disponibilità mostrata nei miei confronti.
Tutto il personale del laboratorio di Oncologia Sperimentale dell’Istituto Oncologico della
Svizzera Italiana, per la cortesia e la disponibilità mostrata nei miei confronti.
Andrea Boffini, per l’aiuto ed i consigli che mi ha dato.
Susan Gilbert, per le correzioni effettuate alla traduzione inglese del riassunto.
Francesco Bezzola, per avere messo a disposizione le sue ore di lezione permettendomi di
redigere il lavoro.
Daniela Marcacci, per l’interesse dimostrato per questo lavoro.
21
ALLEGATI
Allegato 1
Terreni di coltura
I terreni di coltura si possono trovare in commercio e contengono le componenti nutritive
necessarie alla crescita e sopravvivenza delle cellule: glucosio, aminoacidi, sali inorganici e
vitamine (4, 5). Ce ne sono di diversi tipi (RPMI 1640, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, e
altri ancora) (4) a dipendenza delle cellule che s’intende coltivare, avendo queste esigenze
nutritive differenti l’una dall’altra.
Il glucosio è la fonte principale di energia e di carbonio per la cellula (4).
Gli aminoacidi sono necessari alla sintesi delle proteine; tredici sono considerati essenziali e
devono essere presenti nel terreno, tra questi si possono citare per esempio la tirosina e la
cisteina, sintetizzate solamente dagli epatociti (5) e la glutamina necessaria come fonte
energetica per la cellula (3).
I sali inorganici forniscono ioni sodio (Na+), calcio (Ca2+), potassio (K+), magnesio (Mg2+),
cloruro (Cl-), solfato (SO42-), fosfato (PO42-), carbonato (CO32-), che servono a mantenere
l’equilibrio osmotico all’interno della cellula; hanno inoltre una funzione tampone (3, 4).
Le vitamine sono utilizzate come catalizzatori o come substrati per alcune funzioni
metaboliche (4).
Il siero (Siero Bovino Fetale, FBS) viene aggiunto direttamente al terreno di coltura in
percentuale del 10%. Contiene i fattori di crescita, i fattori d’adesione ed altri elementi
importanti per la crescita delle cellule (la transferrina, l’albumina, il colesterolo), acidi grassi
ed elementi minerali in tracce (rame, zinco e cobalto) (3, 4).
Sistemi tampone
Il pH di un terreno di coltura per molte cellule dovrebbe essere compreso tra 7.2 e 7.4 (5), ed
è necessario un sistema tampone per mantenere questo pH costante.
Molti terreni di coltura per questo scopo contengono bicarbonato di sodio (NaHCO3) (5). Il pH
è mantenuto dal giusto rapporto tra il livello di CO2 nella fase gassosa ed il livello di
bicarbonato nel terreno. Il tappo della fiasca deve quindi permettere lo scambio di gas tra
fiasca ed incubatore (5).
Spesso al terreno è aggiunto un indicatore di pH, come il rosso fenolo (4), grazie al quale è
possibile osservare un eventuale cambiamento di pH. Dopo qualche giorno di coltura il colore
del terreno vira perché le cellule in attiva crescita usano il glucosio per ottenere energia
producendo così acido lattico e CO2 che acidificano il terreno.
In molti terreni in aggiunta al bicarbonato viene utilizzato l’HEPES, una molecola organica con
potere tampone, in grado di aumentare la capacità tamponante del bicarbonato e stabilizzare
ulteriormente la coltura (4).
22
Allegato 2
Tabella delle IC50
LINEA
CELLULARE
IC50 µM ± DEVIAZIONE
STANDARD
A549
0.95 ± 0.1
H460
0.88 ± 0.1
H441
2.73 ± 0.5
H358
3.15 ± 1.1
IGROV1
2.23 ± 0.5
A2780
1.76 ± 0.5
SKOV3
4.38 ± 1.1
OVCAR5
2.17 ± 0.5
23