fibrosi cistica

MODULO DI GENETICA
a.a. 2015-2016
Talassemie
Fibrosi Cistica
05.11.2015
Cristina Bombieri
DISTURBI
EREDITARI
DELL'EMOGLOBINA
****
TALASSEMIE
Bianco e Silvestroni nel loro laboratorio di Roma.
(Nat Rev Genet 2004; 5, 625-6321)
Antonio Cao – Università di Cagliari
Identificazione di geni responsabili
di malattie mendeliane
IERI
OGGI
HGP
(Human Genome Project)
&
Exome sequencing
(es. Talassemie)
(es. Fibrosi Cistica)
(Gelehrter, Collins, Ginsburg; Genetica Medica; Masson 1999)
(ri-sequenziamento
regioni codificanti)
L’emoglobina
2
2
1
1
Struttura della molecola
http://www.daviddarling.info/encyclopedia/H/hemoglobin.html;
http://www.talassemiaricerca.unife.it/emoglobine.html
Classe 




Classe 


(Purves, Savada, Orians, Heller; Biologia – L'informazione e l'eredità; Zanichelli, 2005)
(ca 30 Kb)
(ca 60 Kb)
(lunghezzza media 140-145 aminoacidi)
Ontogenesi emoglobina
L'ordine dei geni in ogni cluster corrisponde all'ordine della loro
espressione durante lo sviluppo
(Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)
EVOLUZIONE SUPERFAMIGLIA DELLE GLOBINE NEI VERTEBRATI
catene globiniche mostrano
una forte omologia di
sequenza ad indicare una
loro origine evolutiva comune
T.Strachan and A.Read - Genetica umana molecolare – I ed. italiana (IV ed USA) Zanichelli 2012
GENI OMOLOGHI: ORTOLOGHI E PARALOGHI
T.Strachan and A.Read - Genetica umana molecolare – I ed. italiana (IV ed USA) Zanichelli 2012
DIVERGENZA FUNZIONALE DEI GENI DUPLICATI:
ORIGINE DI GENI PARALOGHI
Mutazione nella regione codificante di una delle due copie e acquisizione di una
nuova funzione
Mutazioni in regioni regolatrici di entrambe le copie: profili di espressione differiscono
(espressione avviene in cellule, tessuti o stadi di sviluppo diversi) nei due geni figli
T.Strachan and A.Read - Genetica umana molecolare – I ed. italiana (IV ed USA) Zanichelli 2012
Disturbi ereditari dell’emoglobina
• Varianti strutturali (difetti QUALITATIVI):
emoglobina S (An. Falciforme), emoglobina C, … >200 varianti rare
1,5: marcatore peso molecolare
2: adulto normale
3: neonato normale
4: omozigote HbS, An. Falciforme
6,8: eterozigote HbS, portatore
7: eterozigote composto HbS/HbC
(http://web.indstate.edu/thcme/mwking/ hemoglobin-myoglobin.html)
FALCEMIA (HbS): Glu6Val; GAG > GTG
HbC:
Glu6Lys; GAG > AAG
Le prime malattie molecolari descritte -> Genetica Medica
(Weatherall, Nat Rev Genet 2004; 5:625)
Disturbi ereditari dell’emoglobina
• DIFETTI QUALITATIVI
(Varianti Strutturali)
Es. HbS, Falcemia
• DIFETTI QUANTITATIVI
Talassemie: 
HPFH: Persistenza ereditaria di emoglobina fetale ()
Le prime malattie molecolari descritte -> Genetica Medica
(Weatherall, Nat Rev Genet 2004; 5:625)
P. Turnpenny & S. Ellard. Emery's Elements of
Medical Genetics. Elsevier ChurchillLivingstone, 12th ed., 2005
Talassemie:
alterato rapporto catene /non
°,  = sintesi assente
+, + = ridotta sintesi
Anemia con microcitemia e riduzione numero e dimensioni dei globuli rossi
(Gelehrter, Collins, Ginsburg; Genetica Medica; Masson 1999)
Talassemie: terminologia clinica
• Major (maggiore), Grave, Trasfusione dipendente
es. Morbo di Cooley (Thal ); Idrope fetale (Thal );
• Intermedia, non trasfusione dipendente;
– es. Thal + con mutazioni lievi che conservano consistente
produzione residua di catene beta
– Thal + / Thal 
– Thal Mut HPFH
• Minor (minore): portatore, non affetto, “microcitemico”.
 Talassemia
Malattia da HbH (-/--; talassemia intermedia): Anemia
piuttosto marcata; quadro clinico non è estremamente
grave
Idrope fetale (--/--; talassemia major); tessuti anossici,
scompenso cardiaco, edema pervade tutti i tessuti.
Letale per il feto o subito dopo la nascita.
Delezione di geni  in seguito a
crossing over ineguale
(Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)
Distribuzione mondiale della alfa-Talassemia
 Talassemia
• “Anemia Mediterranea” perchè diffusa più frequentemente nei
paesi del Mediterraneo: Nord-Africa, Medio-Oriente, India,
Asia centrale e sudest Asiatico.
• Ridotta o assente sintesi di catene 
• Eterogena dal punto di vista molecolare
• Identificate >200 mutazioni che producono il fenotipo
talassemico (sostituzioni nucleotidiche, piccole inserzioni o
delezioni; meno frequenti le grosse delezioni):
– MutazioniCausano assenza totale di produzione
delle catene 
– Mutazioni : Causano riduzioni più o meno marcate
nella produzione delle catene 
Incidenza  Talassemia
circa 1% popolazione mondiale portatore di -talassemia
(ca 90.000.000 individui)
Affetti circa 400.000
Italia: 5-6000 affetti
Regioni più colpite: Sardegna, Sicilia e Delta Po.
Sardegna regione con più alta incidenza: circa 1000 affetti e
frequenza portatori 11%.
Patofisiologia della beta-talassemia
Ridotta o assente sintesi di catenedi classe 
Eccesso catene 
Catene  non formano tetrameri, ma si legano alla membrana dei GR e dei
precursori danneggiandola, ad alte concentrazioni formano aggregati tossici
 0 0 - TALASSEMIA MAJOR
(MORBO O ANEMIA DI COOLEY)
Si manifesta in genere entro i primi due anni di
vita. Eritropoiesi inefficiente, anemia,
ipertrofia del tessuto ematopoietico con
deformazioni scheletriche, ipertrofia del
fegato e della milza che si riattivano come
organi ematopoietici
Talassemia major + HPFH
forma fetale persistente 22 (Hb F)
attenuazione fenotipo talassemico
 0 + o  + +
TALASSEMIA INTERMEDIA
Quadro clinico più attenuato che
compare nell'infanzia o anche più
tardi, con anemia lieve o
moderata, talvolta ritardi nella
crescita e anomalie ossee.
Eterozigote  0+ o  ++
TALASSEMIA MINOR:
portatore sano o
oligosintomatico; microcitemico
COMPLICANZE
DA TALASSEMIA
MAJOR NON
CURATA
Mutazioni comuni per la betatalassemia in Sardegna
°6 (-A)
°39 (C>T)
GAG (Glu) … G-G
(95.7%)
…. Gene normale … CAG (Gln)
…. °39
… UAG (stop)
FRAMESHIFT
(90%)
Mutazione IVS1-110G>A (+)
(Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)
Mutazioni comuni per la betatalassemia in Sardegna
°6 (-A)
°39 (C>T)
GAG (Glu) … G-G
(95.7%)
…. Gene normale … CAG (Gln)
…. °39
… UAG (stop)
FRAMESHIFT
ETEROGENEITÀ'
(90%)
GENETICA, ALLELICA:
Alleli multipli allo stesso locus genico
Mutazione IVS1-110G>A (+)
(Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)
Mutazioni comuni per la betatalassemia in Sardegna
°39 (C>T)
°6 (-A)
Talassemia Major,
GAG (Glu) … G-G
forma grave
(95.7%)
…. Gene normale … CAG (Gln)
…. °39
… UAG (stop)
FRAMESHIFT
(90%)
Talassemia
intermedia,
forma lieve
Mutazione IVS1-110G>A (+)
(Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)
Mutazioni comuni per la betatalassemia in Sardegna
°39 (C>T)
°6 (-A)
Talassemia Major,
GAG (Glu) … G-G
forma grave
(95.7%)
…. Gene normale … CAG (Gln)
…. °39
… UAG (stop)
FRAMESHIFT
Variabilità espressione
(90%)
Talassemia
intermedia,
forma lieve
fenotipica
RELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO
ORDINE DI DOMINANZA DEGLI ALLELI:
wt >  + >  0
Mutazione IVS1-110G>A (+)
(Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)
ETEROGENEITÀ CLINICA (FENOTIPICA):
mutazioni a carico dello stesso gene possono causare
malattie distinte
Gene HBB (beta-globina)
CCT GAG GAA
pro GLU glu
CCT GtG GAA
pro VAL glu
ANEMIA
FALCIFORME
BetaTALASSEMIA
CCT G-G G AA
pro gly-FS
PLEIOTROPIA: mutazione in un gene può avere più di
un effetto fenotipico distinto nello stesso organismo
Delezioni geni gruppo beta globinici
Emoglobina Lepore
(asintomatico)
(-Talassemia intermedia)
(Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)
Distribuzione mondiale delle mutazioni della
beta-Talassemia
Colocalizzazione di malaria e alcune
emoglobinopatie
MALARIA
TALASSEMIA
(Fantoni et al. Biologia Cellulare e Genetica – Ed. Piccin 2009)
Incidenza
della 
talassemia in
Italia
E’ indicata la
frequenza degli
eterozigoti
Bodmer e Cavalli, Genetica Evoluzione Uomo, vol2, Mondadori 1977.
Frequenza di
diverse
mutazioni per
la  talassemia
in Italia
Bianco – Silvestroni; Le Talasemie; Ist It Med Sociale, 1998
Diminuzione dei nati con
Talassemia in Sardegna
Programma di screening dei portatori iniziato nel 1975
(Cao, Am J Hum Genet, 54:397; 1994)
Genotipo-Fenotipo in Talassemia e An. Falciforme
a-talassemia
Fa
ia
r
tto
m
i
al
t
en
i
b
B-talassemia
O
An. Falciforme
Variabilità fenotipo
HPHF
Geni modificatori
BCL11A
HBS1L-MYB
(HFE?)
…...
beta-Talassemia e Anemia
Falciforme mostrano una
ampia variabilità fenotipica
(= gravità manifestazioni
cliniche),
non
sempre
riconducibile alle mutazioni
a carico del gene bglobinico
FIBROSI CISTICA
Gli organi colpiti dalla FC
• Vie aeree: ostruzione e infezione,
cause della maggior parte dei
decessi
• Pancreas: occlusione dotti e
insufficienti enzimi digestivi in
85% dei pazienti
• Intestino: occlusione fecale in
10% dei neonati
• Apparato riproduttivo: 95% dei
maschi assenza dotti deferenti.
Possibile tappo mucoso uterino
• Ghiandola sudoripara: eccesso di
cloro nel sudore, test diagnostico
fondamentale
(Cummings – Eredità – EdiSES, 2004)
Fibrosi Cistica
• Più comune malattia AR nelle popolazioni di origine caucasica
(molto rara nelle altre popolazioni)
• Nati/anno Italia: oltre 200
• Affetti circa 5000-6000 (40% adulti)
• Portatori: oltre 2.200.000
• (Nota: estrapolazioni dai dati di screening neonatale 19932000 nel Veneto-Trentino Alto Adige: incidenza osservata
FC=1/2705 nati, frequenza dedotta portatori = 1/26,5)
• Sopravvivenza: mediana 30 anni (> 60 anni per alcuni
pazienti)
• Legge prevenzione e cura FC (screening e DPN)
Incidenza della fibrosi cistica in diversi
gruppi etnici:
INCIDENZA (alla nascita) = numero casi FC / totale dei nati vivi
Può variare anche di molto tra diversi gruppi etnici presenti in
uno stesso paese (Lancet 373:1891-1904;2009).






Europa
– (Finlandia
America (caucasici)
Afro-Americani
Ispano-americani
Asiatico-americani
….
1/2500-3500
1/15000)
1/3300
1/15300
1/8-9000
1/32100
Identificazione del gene CFTR
mediante clonaggio posizionale
Clonaggio di posizione per la identificazione del
gene della fibrosi cistica
600 Kb
MetH
marker
950 Kb
IRP
gene
candidato
scartato
J3.11
marker
gene CF
• 1985: linkage al cromosoma 7
• 1987: errata identificazione del gene
• 1989: identificazione del gene CFTR
(Science 245: 1059, 1989)
Il gene e la proteina CFTR (Cystic Fibrosis
Transmembrane Regulator)
•
•
•
•
•
Cromosoma: 7q31
Gene: 200 kb
27 esoni
mRNA: 6129 bp
Proteina: 1480
aminoacidi,
(http://www.cfgenetherapy.org.uk/cysticfibrosismore.htm;
http://homepages.strath.ac.uk/~dfs99109/BB310/CFgene.html)
Normal
CF
H2O
Cl-
Cl-
Cl-
H2O
Cl-
FC e mutazioni
• note >1600 mutazioni; non tutte patologiche, di molte non si
conosce il significato funzionale (alcune molto dubbie)
• Vario tipo: puntiformi, piccole del/ins, grossi riarrangiamenti, ...
• Differente distribuzione geografica delle mutazioni (molte sono
popolazione-specifiche)
• Non è stato identificato il 100% delle mutazioni patologiche (6098% secondo la popolazione)
• Poche decine di mutazioni frequenti:

F508del 35-90%

altre <20% circa;

>parte hanno freq. <1%
Distribuzione mutazioni FC
(Zielenski e Tsui, Ann Rev Genetics 29: 783, 1995).
Le mutazioni più frequenti della
Fibrosi Cistica
F508
G542X
G551D
W1282X
N1303K
R553X
Mondo
(%)
Italia
(%)
Veneto
(%)
67
3.4
2.4
2.1
1.8
1.3
51
4.8
0.08
1.2
4.8
1.1
48
2.7
0.4
0.9
4
1.3
CF Mutation Database: http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr
Mutazioni CF in Veneto e Trentino AA
Mutazione
F508
R1162X
2183AA->G
N1303K
G542X, 711+5G->A
1717-1G->A
G85E, R553X, altre2
Altre 5
Totale (16 mutazioni)
Hum. Genet. 1995; 95:397
Frequenza % Freq. Cumulativa %
47,6
47,6
9,8
57,3
9,3
66,7
4,0
70,7
2,7
76,0
2,2
78,2
1,3
83,6
0,9 e 0,4
86,7
86,7
Rischio residuo dopo analisi negativa di
mutazione per Fibrosi Cistica
Mutazioni
identificate
Rischio di
essere
portatore
ccr
Rischio di
avere un figlio
affetto; un
genitore
negativo
¼ ccr
Rischio di
avere un figlio
affetto; due
genitori
negativi
( ¼ ccr)2
(d)
0
(1/26,5)
n.a.
(1/2705)
86,7%
1/193
1/772
1/148.996
95%
100%
1/546
0
1/2.186
0
1/1.194.892
0
ccr=2pq(1-d)/2pq(1-d)2; (…) = dati screening neonatale Veneto-Trentino
RISCHIO DI PORTATORE
Gruppo etnico*
Ebrei-Ashkenazi
Europei-caucasici
Ispano-americani
Afro-americani
Asiatico-americani
Detection
rate
Carrier Risk
(NO test mut)
Carrier Risk
(test mut neg**)
97%
80%
57%
69%
++
1/29
1/29
1/46
1/65
1/90
1/930
1/140
1/105
1/207
++
*POPOLAZIONE AMERICANA
**Pannello mutazioni consigliato da ACMG;
storia familiare negativa per CF
Identificazione delle coppie a rischio di
Fibrosi Cistica con analisi di mutazioni
Mutazioni
due genitori un genitore
identificate con mutazione negativo
(d)
(d)2
2d(1-d)
due genitori
negativi
(1-d)2
0
0
0
100%
70%
49%
42%
9%
86.7%
75.2%
23.0%
1.8%
95%
100%
90.2%
100%
9.5%
0
0.3%
0
Rischio di avere figli affetti
Gruppo etnico di
entrambi i partner
NO
TEST
P1 neg
P2 no test
P1 pos P1 + Partners
P2 neg P2 no entrambi
negativi
test
Ebrei-Ashkenazi
Europei-caucasici
Ispano-americani
Afro-americani
Asiatico-americani
1/3.300 1/107.800 1/3720 1/116 1/3.459.600
1/3.300 1/16.240 1/560 1/116
1/78.400
1/8.464 1/19.320 1/420 1/824
1/44.100
1/16.900 1/53.820 1/828 1/260 1/171.396
1/32.400
++
++
1/360
++
Rischio figlio affetto = ¼ x rischio carrier P1 x rischio carrier P2
P1 e P2 carrier => rischio figlio affetto = 1/4
Classificazione delle mutazioni del
gene della Fibrosi Cistica
Difetto
risultante
Sintesi
Assente
Maturazione Regolazione Conduzione Quantità
assente
alterata
alterata
ridotta
Le mutazioni della fibrosi cistica (gene CFTR) sono state suddivise in 5 classi in base
al loro effetto funzionale (Modificato da Zielenski e Tsui, Ann Rev Genetics 29: 796, 1995).
Correlazione fra genotipo e
funzionalità pancreatica esocrina
Funzione
Tipo di
mutazioni
Esempi
Insufficienza
Grave/Grave F508 /F508
F508 / R1162X
Sufficienza
Grave/Lieve
Lieve/Lieve
F508 / R117H-5T
3849+10KbC-T / R334W
Mutazioni CFTR e CF

I148T o 3199del6: qual è la vera mutazione?

R117H-7T e R117H-5T

Alleli complessi: F508del-R553Q
Note 75-95% mutazioni CF:
dove sono le altre mutazioni CF?
mutazioni non identificabili con i metodi correnti (es. grossi
riarrangiamenti)
•
•
mutazioni in zone solitamente non indagate (introni, promotori)
•
mutazione in zone di regolazione lontane dal gene (es. lattasi)
•
altri meccanismi mutazionali (vedi caso mut. dinamiche)
•
mutazioni apparentemente neutrali (ESE)
•
altri geni?
Complessità in una malattia
monogenica
La fibrosi cistica presenta un'ampia variabilità nella gravità
dell’espressione clinica (configurazione, gravità, età di
insorgenza)
in
particolare
delle
manifestazioni
polmonari, anche tra pazienti con le stesse mutazioni
CFTR o addirittura appartenenti alla stessa famiglia
Cosa può spiegare
le modificazioni del fenotipo?
–
eteogeneità allelica, ma solo parzialmente
–
modulazione di un secondo sito nello stesso gene
F508del (grave); F508del-R553Q (gravità minore)
– R117H-IVS8_5T (FC);
R117H-IVS8_7T (nonFC)
splicing alternativi o anomali
–
–
–
altri meccanismi mutazionali
–
controlli epigenetici
–
Fattori ambientali (es. infezioni)
–
Mutazioni in altri geni (Geni Modificatori)
Complessità in una malattia
monogenica: Geni modificatori
• Impossibile predire fenotipo CF in base alle sole mutazioni CFTR
• Variabilità nella gravità dell’espressione clinica della malattia si ha anche
tra pazienti con lo stesso genotipo CFTR o addirittura appartenenti alla
stessa famiglia
• Queste osservazioni suggeriscono l’esistenza di altri geni che modulando
l’espressione di CFTR o interferendo con percorsi metabolici comuni
altererebbero il quadro clinico in FC
Gene CFTR + molti altri geni -> una malattia
Geni Candidati
regolazione dell’equilibrio
rimodellamento tissutale
•
proteasi-antiproteasi
•
difesa dell'ospite / infezioni
•
infiammazione
•
stress ossidativo e del metabolismo degli xenobiotici
e
del
altri trasportatori e proteine che interagiscono con CFTR
(canali epiteliali del sodio, ENaC; canali del cloro, ORCC;
scambiatore Na/H, NHE)
•
controllo di espressione genica, processamento proteina, altri
canali ionici epiteliali, controllo produzione muco, clearance
mucociliare (es. chaperonine come HSP70, calnexina, CHIP,
sembra partecipino attivamente a sintesi e degradazione di
CFTR)
•
CF e geni modificatori
IFRD1
11p13
20q13.2
EHF/APIP?
2002;3:779-789
Studio dei geni modificatori con la stessa strategia
usata per le malattie complesse
GWAS
Fenotipi CFTR-relati
un gene -> molte malattie
= entità cliniche associate a disfunzioni del gene CFTR, che
tuttavia non soddisfano i criteri diagnostici standard per FC
Complessità in una malattia monogenica:
fenotipiCF-relati (CFTR-patie)
• CAVD (assenza congenita vasi deferenti)/azoospermia ostruttiva:
• 80% almeno 1 mutazione
• 50-60% 2 mutazioni
• pancreatite:
• 30% almeno 1 mutazione
• 10-15% 2 mutazioni
• bronchiettasie:
• 10-50% almeno 1 mutazione
> mutazioni CF-lievi o non causa di CF; no mutazioni specifiche
un gene -> molte malattie
Trascritti CFTR e fenotipi correlati
% mRNA
CFTR normale
100%
Fenotipo
Normale
Normale
azoospermia
azoospermiaostruttiva
ostruttiva
bronchiectasie
bronchiectasiediffuse
diffuse
aspergillosi
aspergillosipolmonare
polmonare
pancreatite
pancreatitecronica
cronica
poliposi
poliposinasale
nasale
rinosinusite
rinosinusitecronica
cronica
0%
(Estivill; Nat Genet 12:346; 1996)
Genotipo
CFTR
N/N
N / 5T
N / CFl
N / CF
5T / 5T
CFl / 5T
CF / 5T
CFl / CFl
CF(fibrosi
CF(fibrosicistica)-PS
cistica)-PS
CF
CFad
adesordio
esordiotardivo
tardivo
CF / CFl
CF
CF(fibrosi
(fibrosicistica)-PI
cistica)-PI
CF / CF
nessun gene è un'isola
Malattie Genetiche