BIO-FLASH ®
VEDI CAMBI RISALTATI
®
BIO-FLASH anti-HBs
3000-8581
100 tests
BIO-FLASH anti-HBs è un immunotest a chemiluminescenza simultaneo totalmente automatizzato per la
determinazione quantitativa degli anticorpi all’antigene di superficie dell’epatite B (anti-HBs) nel siero e nel
plasma umano con lo strumento BIO-FLASH.
Introduzione
L'epatite B è un'infezione del fegato prodotta dal virus dell'epatite B (HBV) e che rappresenta un grave problema di
salute globale. Il virus provoca una serie di malattie del fegato, che vanno dall’epatite acuta e cronica alla cirrosi e
al cancro epatico primario. Le malattie causate dal virus dell'epatite B hanno una distribuzione globale. Si stima
che circa un terzo della popolazione mondiale sia stato infettato da HBV. Di questa quantità, circa 350 milioni di
persone sono cronicamente infette e a rischio di grave malattia e di morte, soprattutto a causa di cirrosi epatica e
carcinoma epatocellulare. L’infezione da HBV varia notevolmente nelle diverse aree geografiche e la prevalenza di
HBV cronica può variare dallo 0,2% al 15%. Le principali modalità di trasmissione dell'HBV sono l'esposizione
perinatale alla madre infetta, orizzontale, parenterale e sessuale, i cui tassi relativi variano nelle diverse aree del
mondo. La trasmissione parenterale e la sessuale predominano nei paesi industrializzati, mentre la trasmissione
1,2
orizzontale e la perinatale predominano nei paesi in via di sviluppo.
Durante l’infezione virale appaiono diversi marcatori sierologici, tra i quali l’anti-HBs. La maggioranza (> 80%) dei
pazienti infettati da HBV presenta un episodio acuto, seguito da convalescenza e guarigione. In questi pazienti, gli
anticorpi contro l’antigene di superficie dell’epatite B (HBsAg) compaiono generalmente alcune settimane dopo
l’eliminazione dell’HBsAg dalla circolazione sanguigna e indicano la guarigione clinica e la successiva immunità
3
all’HBV, per cui la determinazione dell’anti-HBs rappresenta il miglior marcatore della guarigione e dell’immunità.
L’utilità della determinazione dell’anti-HBs ha incrementato l’uso di vaccini contro l’epatite B, come strumento nello
screening pre-immunizzazione (i soggetti dovrebbero essere negativi a HBsAg, anti-HBc e anti-HBs) e nel
3-7
monitoraggio della sieroconversione successiva all’immunizzazione.
Principio
Le microparticelle paramagnetiche e il tracciatore del BIO-FLASH anti-HBs vengono miscelate ed incubate
unitamente al campione. Gli anticorpi specifici anti-HBs eventualmente presenti nel campione si legano all’HBsAg
(sottotipi ad ed ay) che ricopre le microparticelle. Il tracciatore, consistente in HBsAg (sottotipi ad ed ay) marcato
con isoluminolo, si unisce agli anticorpi anti-HBs catturati dalle microparticelle. Dopo una separazione magnetica
ed un lavaggio volto ad eliminare il campione e il tracciatore residuo, si aggiungono i reagenti che attivano la
reazione chemiluminescente. Il luminometro del BIO-FLASH misura la luce emessa in unità relative di luce (URL),
che sono direttamente proporzionali alla concentrazione di anti-HBs del campione.
Il BIO-FLASH utilizza un metodo di riduzione dei dati con adattamento ad una curva logistica a 4 parametri (4PLC)
per generare una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM). Questa curva è predefinita, dipende dal lotto e viene
memorizzata nello strumento mediante il codice a barre della cartuccia. Con la misurazione dei calibratori (forniti in
un kit a parte), la CCM predefinita si trasforma in una nuova Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica
per lo strumento. Le concentrazioni dei calibratori sono incluse nei codici a barre delle provette dei calibratori.
Schema della reazione:
Attivatori
(Triggers)
URL
Particella magnetica
Campione
Tracciatore
Emissione di luce
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Componenti
Cartuccia reagenti
Il kit BIO-FLASH anti-HBs contiene una cartuccia reagenti per 100 determinazioni (REF 3000-8581).
Nota: il disegno della cartuccia è protetto da brevetto (US D565,741 / Disegno CE 000762992-0001)
Composizione della cartuccia reagenti:
La cartuccia è composta da 3 contenitori, così composti:
A.
1 contenitore cilindrico per la sospensione di
microparticelle ricoperte con HBsAg in tampone
fosfato. Contiene < 0,1% di sodio azide.
B.
Posizione vuota.
C.
1 contenitore opaco del tracciatore, consistente in
HBsAg marcato con isoluminolo. Contiene < 0,1%
di sodio azide.
D.
1 contenitore vuoto.
Preparazione
Si veda la seguente figura.
Cartuccia: le microparticelle sedimentano durante il trasporto e lo stoccaggio, pertanto si devono mescolare
affinché si risospendano.
La prima volta che si utilizza la cartuccia la si deve capovolgere con cura per 30 volte senza che si formi
schiuma (le bolle possono far sì che i sensori di liquido dello strumento diano letture errate).
Verificare che le microparticelle si siano risospese completamente. In caso contrario, continuare a
capovolgere la cartuccia finché le microparticelle non saranno risospese nella loro totalità.
Se le microparticelle non si risospendono o se si riscontra la rottura del sigillo dei reagenti, NON UTILIZZARE
LA CARTUCCIA.
Dopo che le microparticelle si saranno risospese, collocare la cartuccia su una superficie solida e rimuovere
con attenzione la linguetta rossa di sicurezza per il trasporto.
Mantenendo la cartuccia sulla superficie solida, stringere le due linguette situate ai lati del tappo perforatore
(parte grigia) e premere la parte superiore della cartuccia fino a raggiungere la posizione di bloccaggio. Una
volta raggiunta la posizione di bloccaggio, le strisce dovranno rimanere nascoste. Non capovolgere la
cartuccia aperta.
Lasciare riposare la cartuccia per 5 minuti prima di caricarla nello strumento.
Dopo aver caricato la cartuccia, lo strumento mescola il suo contenuto in modo automatico ad intervalli periodici.
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Precauzioni
I reagenti BIO-FLASH sono solo per uso diagnostico IN VITRO.
Uso esclusivo per utilizzatori professionali.
La sodio azide può reagire con i tubi e le tubature di scarico in piombo o rame, formando azidi metalliche altamente
esplosive. Al momento dello smaltimento dei residui di reagenti, sciacquare con abbondante acqua.
ATTENZIONE: MATERIALE A RISCHIO BIOLOGICO.
Tutti i materiali di origine umana impiegati nell’elaborazione di questo prodotto sono risultati negativi ai test degli anticorpi
anti-HIV-1/2 e anti-HCV, condotti mediante un metodo approvato dalla Food and Drug Administration (USA). L’HBsAg
utilizzato in questo reagente è stato inattivato a 60°C per 10 ore. Poiché non esiste un metodo analitico che possa
garantire la totale assenza di agenti infettivi, questo prodotto deve essere trattato con precauzione.
Smaltire tutti i materiali usati in appositi recipienti per materiale biocontaminante.
Si prega di non riutilizzare né reintrodurre alcun reagente nelle cartucce o nei contenitori.
Raccolta e conservazione dei campioni
Usare siero fresco (possono essere utilizzate anche provette con gel separatore di siero) o plasma (EDTA,
Li-eparina, Na-eparina, Na-citrato e ACD). Controllare altri anticoagulanti prima del loro uso. Gli anticoagulanti
liquidi come il Na-citrato esercitano un effetto diluente e possono ridurre la concentrazione dei campioni dei
pazienti. I campioni non devono essere inattivati mediante calore. Le particelle in sospensione devono essere
eliminate per centrifugazione. Consultare le direttive CLSI H18-A3 e H21-A5 per ulteriori informazioni relative a
manipolazione, trasporto, processo e conservazione dei campioni.
Siero
I campioni di siero possono essere conservati tra 2°C e 8°C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di
tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20°C. I campioni possono
essere congelati/scongelati al massimo 3 volte. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i
campioni non presentino bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell’analisi.
Plasma
I campioni di plasma possono essere conservati tra 2°C e 8°C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di
tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20°C. Scongelare il plasma a
37°C. Scongelare i campioni una volta sola. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i
campioni non presentino bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell’analisi.
Volume di campione
Il volume di campione necessario per condurre un’unica prova con BIO-FLASH anti-HBs varia in base al tipo di
recipiente utilizzato. Utilizzando il recipiente per campione raccomandato (REF 3000-8209), per un test saranno
necessari almeno 100 µL più il volume morto, equivalente a 200 µL.
Altri materiali
I seguenti materiali non vengono forniti con la cartuccia reagenti e devono essere acquistati separatamente.
REF 3000-8582
BIO-FLASH anti-HBs Calibrators (Calibratori)
REF 3000-8583
BIO-FLASH anti-HBs Controls (Controlli)
Se si desiderano ulteriori informazioni, leggere attentamente le relative istruzioni.
Non utilizzare altri calibratori. Le informazioni necessarie allo strumento BIO-FLASH per calibrare il test
BIO-FLASH anti-HBs sono incluse nei codici a barre dei contenitori.
L’uso di controlli di altri fabbricanti può originare risultati imprevisti.
Prima di processare campioni, calibratori o controlli, assicurarsi che nello strumento BIO-FLASH vi sia una quantità
sufficiente dei seguenti consumabili:
REF 3000-8206
BIO-FLASH Cuvettes (Cuvette)
Nota: Il disegno delle cuvette è protetto da brevetto (US D560,816 / Disegno CE 000762984-0001)
REF 3000-8204
BIO-FLASH Triggers (Attivatori)
REF 3000-8205
BIO-FLASH System Rinse (Soluzione del sistema)
REF 3000-8207
BIO-FLASH Sample Diluent (Diluente dei campioni, nel caso in cui sia stata attivata
l’opzione di re-run)
Strumento / conduzione del test
Nella Guida per l’Utente del BIO-FLASH si troveranno le istruzioni complete per condurre il test.
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Calibrazione
Il codice a barre della cartuccia contiene una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM), valida per il lotto di
reagenti. Tuttavia, per tutti i reagenti è necessaria una Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per
ciascun lotto e valida fino alla data di scadenza di quest’ultimo. Quando i risultati dei controlli escono dal range di
accettazione o quando sono state effettuate regolazioni sullo strumento, si deve ottenere una nuova CCL.
Per configurare una CCL, leggere attentamente la Guida per l’Utente del BIO-FLASH.
Controllo di qualità
Per effettuare un programma completo del controllo di qualità si raccomandano tre livelli di controllo. I controlli
BIO-FLASH anti-HBs negativo, positivo e positivo alto sono stati progettati per il suddetto programma. I controlli
devono essere analizzati almeno ogni 24 ore per giorno di uso. Assicurarsi che i risultati dei controlli si trovino
all’interno del range di accettazione, perché in caso contrario si potranno avere risultati non validi e l’utente dovrà
adottare misure correttive. In questo caso esaminare tutti i risultati ottenuti dall’ultima verifica positiva del controllo
di qualità dell’analita in questione. Può rendersi necessaria la ricalibrazione dello strumento. Nella Guida per
l’Utente dello strumento si troveranno ulteriori informazioni. Per l’individuazione e la risoluzione di situazioni
8
anomale relative al controllo di qualità consultare Westgard et al.
Conservazione e stabilità
I reagenti non ancora aperti si mantengono stabili fino alla data di scadenza riportata sull’etichetta della cartuccia
se conservati ad una temperatura di 2-8°C e in posizione verticale.
Una volta aperta, la stabilità della cartuccia caricata nello strumento BIO-FLASH o conservata a 2-8°C è di
12 settimane.
Tracciabilità dei calibratori e dei controlli
I valori sono espressi in mUI/mL e sono stati assegnati mediante svariati test con lo strumento BIO-FLASH,
impiegando lotti specifici di reagenti, rispetto a standard interni riferibili alla prima preparazione di riferimento
dell’immunoglobulina anti-epatite B della OMS (codice della Croce Rossa olandese: W1042).
Interpretazione dei risultati
La quantità di analita in ciascun campione si determina partendo dalla luce emessa (URL), mediante
interpolazione nella Curva di Calibrazione di Lavorazione memorizzata. I risultati del test BIO-FLASH anti-HBs
sono espressi in mUI/mL.
La misurazione quantitativa degli anticorpi anti-HBs, mediante il test BIO-FLASH anti-HBs, contribuisce a
determinare lo stato immunitario del paziente:
I campioni con una concentrazione < 10,0 mUI/mL si considerano non reattivi (negativi).
I campioni con una concentrazione ≥ 10,0 mUI/mL si considerano reattivi (positivi).
È generalmente accettato che un livello di concentrazione di anti-HBs pari o superiore a 10,0 mUI/mL per un
periodo di tempo prolungato sia indicativo di una guarigione da un’infezione pregressa o della protezione in
3-7
soggetti vaccinati.
Limitazioni
Il test non distingue tra una risposta immunitaria indotta da un vaccino o da un’infezione naturale da HBV; per
determinare ciò è necessario svolgere il test anti-HBc.
A fini diagnostici, i risultati del test BIO-FLASH anti-HBs devono essere utilizzati considerando altri dati, come ad
esempio la sintomatologia, l’anamnesi clinica ed altri marcatori dell’epatite, per la diagnosi di infezione acuta,
cronica o guarita. Sebbene i risultati quantitativi mostrino per la maggior parte dei campioni una buona correlazione
con altri test, esiste un certo grado di variabilità e persino variazioni significative in singoli campioni. Ciò è dovuto a
diverse cause, come la variabilità dell’HBsAg, che presenta diversi sottotipi antigenici, le caratteristiche degli
anticorpi anti-HBs contenuti nel campione (specificità ed affinità a diversi epitopi) e fattori relativi al test (metodo di
produzione, calcolo dei risultati, etc.).
Risultati attesi
La maggior parte dei pazienti affetti da infezione da HBV elimina il virus, sviluppa anticorpi anti-HBs e guarisce
completamente. La prevalenza di campioni positivi anti-HBs a causa di infezioni pregresse da HBV può variare dal
2
4% al 95%, in base all’area geografica. Il tasso di campioni positivi a causa della vaccinazione contro l’HBV varia
da paese a paese, in base alla portata dei programmi di immunizzazione. A partire dal 1982, anno dell’introduzione
del primo vaccino contro l’epatite B, sono stati vaccinati milioni di persone in tutto il mondo. Per questo motivo la
prevalenza dei portatori di HBsAg è in diminuzione, mentre sono in aumento gli anticorpi anti-HBs dovuti alla
vaccinazione.
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Caratteristiche funzionali
Nota: i seguenti dati sono rappresentativi; i risultati dei singoli esperimenti possono variare rispetto a tali dati.
Comparazione di metodi
BIO-FLASH anti-HBs è stato valutato in studi comparativi con altri test in commercio.
Valutazione
È stato valutato con BIO-FLASH anti-HBs un pannello di 717 campioni di differente provenienza che includeva
sieri positivi e negativi di anti-HBs. I risultati sono stati comparati con quelli ottenuti mediante un metodo EIA
anti-HBs disponibile in commercio.
Metodo di riferimento
BIO-FLASH
anti-HBs
POS
NEG
Totale
POS
NEG
Totale
197
3
200
0
517
517
197
520
717
Sono stati ottenuti i seguenti risultati di sensibilità e specificità relative e concordanza globale:
N
717
Sensibilità relativa
Valore
CI del 95%
98,5% 95,7% a 99,7%
Specificità relativa
Valore
CI del 95%
100,0% 99,3% a 100,0%
Concordanza globale
Valore
CI del 95%
99,6% 98,8% a 99,9%
Inoltre, trecentocinquanta (350) campioni del precedente pannello sono stati analizzati con un test a
chemiluminescenza anti-HBs (CLIA) disponibile in commercio. È stato stabilito un risultato di consenso,
considerando la concordanza tra almeno due test, incluso il test BIO-FLASH anti-HBs. Nel calcolo non è stato
incluso un campione per il quale non è stato possibile ottenere un consenso. Il riepilogo dei risultati del test
BIO-FLASH rispetto al consenso viene mostrato nella seguente tabella:
Consenso
BIO-FLASH
anti-HBs
POS
NEG
Totale
POS
NEG
Totale
197
2
199
0
150
150
197
152
349
Rispetto al consenso sono stati ottenuti i seguenti risultati di sensibilità e specificità relative e concordanza globale:
N
349
Sensibilità vs. consenso
Valore
CI del 95%
99,0% 96,4% a 99,9%
Specificità vs. consenso
Valore
CI del 95%
100,0% 97,6% a 100,0%
Concordanza vs. consenso
Valore
CI del 95%
99,4%
97,9% a 99,9%
Follow-up della sieroconversione
Sono stati eseguiti ulteriori studi di sensibilità testando i campioni di 12 follow-up della vaccinazione. I campioni
sono stati prelevati prima che i soggetti fossero vaccinati contro l’epatite B e un mese dopo la vaccinazione. I
risultati anti-HBs ottenuti sono stati comparati con un test a chemiluminescenza anti-HBs (CLIA) disponibile in
commercio. In tutti i casi i campioni di follow-up hanno presentato segni di sieroconversione.
Precisione
Si valutò, in conformità alle direttive CLSI EP05-A2, la precisione intra-test e totale (test per test e giorno per
giorno) in svariati test. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella:
Controllo negativo*
Controllo positivo
Controllo positivo alto
Intorno al valore di cut-off
Media
778 URL
44,7 mUI/mL
233,0 mUI/mL
9,4 mUI/mL
%CV (Intra-test)
7,4
2,3
1,9
7,1
%CV (Totale)
8,5
4,.0
3,1
8,0
*Il controllo negativo è prossimo al limite di quantificazione, per cui sono state calcolate le URL medie anziché la
concentrazione media.
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Riproducibilità
Si valutò la riproducibilità tra duplicati, tra lotti e tra strumenti, utilizzando il metodo di Passing & Bablok. I risultati si
mostrano nella seguente tabella:
N
Duplicato 2 vs. duplicato 1
Lotto 2 vs. lotto 1
Strumento 2 vs. strumento 1
50
50
40
Pendente
Valore CI del 95%
1,00
0,99
0,97
0,99 a 1,01
0,95 a 1,02
0,96 a 0,99
Intersezione
Valore CI del 95%
-0,12
-3,93
-3,61
-0,62 a 0,26
-7,58 a -0,21
-6,10 a -2,51
Valore
R
CI del 95%
1,00
1,00
1,00
1,00 a 1,00
0,99 a 1,00
1,00 a 1,00
Interferenze
Studi conformi alle direttive CLSI EP7-A2 hanno dimostrato che le seguenti sostanze potenzialmente interferenti
non alterano i risultati del BIO-FLASH anti-HBs:
Sostanza potenzialmente interferente
Emoglobina
Bilirubina indiretta
Bilirubina diretta
Trigliceridi
HAMA
Concentrazione
500 mg/dL
18 mg/dL
18 mg/dL
1.300 mg/dL
1 µg/mL
% Interferenza
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
Reattività crociata
Sono stati analizzati con BIO-FLASH anti-HBs un totale di 113 campioni positivi per una serie di cross-reagenti e
campioni di donne in stato interessante. Si suppone che un potenziale cross-reagente provochi una reattività
crociata, quando la diagnosi passa da negativa a positiva o viceversa. I campioni sono stati comparati con test
anti-HBs disponibili in commercio. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella:
Reattività crociata potenziale
ANA (anticorpi antinucleari)
anti-CMV (anticorpi contro il virus citomegalovirus)
anti-EBV (anticorpi contro il virus di Epstein-Barr)
anti-HAV IgG (anticorpi contro il virus dell'Epatite A)
anti-HAV IgM (anticorpi contro il virus dell'Epatite A)
anti-HDV IgG (anticorpi contro il virus dell'Epatite Delta)
anti-HEV (anticorpi contro il virus dell'Epatite E)
anti-HIV (anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana)
anti-HSV (anticorpi contro il virus Herpes simplex)
anti-Rubella (virus della Rosolia)
anti-Toxoplasma (Toxoplasma gondii)
anti-VZV (anticorpi di contro il virus della Varicella-Zoster)
IgG elevate
IgM elevate
Mononucleosis
Donne in gravidanza (incluse multipare)
Donne in gravidanza
RF (fattore reumatoide)*
RPR (Rapid Plasma Reagin)
Concordanza
5/5
10/11
5/5
6/6
5/5
2/2
2/2
4/4
2/2
11/11
5/5
4/4
4/4
4/4
4/4
5/5
10/10
15/15
9/9
*La concentrazione di RF nei campioni testati varia da 24 a 805 UI/mL.
Limite di rilevamento
In conformità alle direttive CLSI EP17-A, il limite di rilevamento (LR) si situa a 2,6 mUI/mL.
Limite di quantificazione
In conformità alle direttive CLSI EP17-A, il limite di quantificazione (LQ) si situa a 3,6 mUI/mL.
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Linearità
Il test BIO-FLASH anti-HBs è lineare tra 3,6 e 1900 mIU/mL comme valutato in conformità alle direttive CLSI EP6-A.
Tuttavia, la linearità si può ampliare fino a 38.000 mUI/mL mediante diluizione se si abilita l’opzione di re-run
automatico.
Se tale opzione non è abilitata, i campioni contenenti oltre 1900 mUI/mL verranno indicati come > 1900 mUI/mL.
Se l’opzione di re-run è attivata, lo strumento effettua una diluizione automatica e corregge il risultato finale per il
fattore di diluizione (20x), ampliando così il range di test fino a 38.000 mUI/mL. Per informazioni su come abilitare
l’opzione di re-run automatico consultare la Guida per l’utente del test BIO-FLASH.
Effetto prozona
Sperimentalmente, non è stato osservato alcun effetto prozona con un campione di 13.000 mUI/mL.
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