DNA - tandem | univr

Scientists with lab coats: Corso di
laboratorio Chimico-Biologico
Dott.ssa Valeria Berton
Università di Verona
Il DNA
Il DNA contiene l’informazione genetica di un organismo
Scritta in un codice chimico basato su 4 «lettere»: A, T, C, G
Le 4 lettere si chiamano nucleotidi, che sono uguali in tutti gli organismi che contengono il DNA
Nella cellula, il DNA viene «letto» e trascritto in RNA, una struttura simile al DNA
L’RNA viene tradotto in strutture diverse, dette amminoacidi
I 20 amminoacidi sono uniti in sequenza, formando una proteina
Diverse combinazioni dei 20 amminoacidi danno forma a diverse proteine
DNA  RNA  proteine
Dogma centrale
Com’è fatto il DNA
Basi
1 base + 1 gruppo fosfato + 1 zucchero = nucleotide
Gruppo fosfato
Base
Nucleotide
Zucchero
Gruppo fosfato
Zucchero
zucchero
fosfato
Adenina
Adenosina
Timina
Timidina
Citosina
Citidina
Guanina
Guanosina
base
nucleotide
Essential Cell Biology 4th edition
Com’è fatto il DNA
E’ composto da nucleotidi
Base: Adenina
Guanina
Citosina
Timidina
Nucleotide: Zucchero
Base
Gruppo fosfato
Uracile (RNA)
Zucchero: Deossiribosio
Ribosio (RNA)
Essential Cell Biology 4th edition
Com’è fatto il DNA
Basi: purine o pirimidine
Essential Cell Biology 4th edition
Il DNA
I nucleotidi
Due filamenti si legano tra loro
zucchero
fosfato
base
(guanina)
nucleotide
Il DNA è un polimero di nucleotidi
I nucleotidi sono monomeri
Il DNA è un polimero (composto
da diversi monomeri)
Si uniscono tra loro formando un filamento
Essential Cell Biology 4th edition
Il DNA
Più da vicino...
Adenosina e Guanosina (purine)
Timidina e Citidina (pirimidine)
Le varie componenti sono legate tra di loro da legami covalenti
I legami coinvolgono l’atomo di carbonio in 3’ e l’atomo di carbonio in
5’ dello zucchero
La sequenza dei nucleotidi nel filamento di DNA si «legge» sempre
dall’estremità 5’ all’estremità 3’
Essential Cell Biology 4th edition
Il DNA
Orientati in senso opposto
= Antiparalleli
Legami idrogeno tra le basi di
due filamenti
I due filamenti si attorcigliano
su loro stessi a formare una
doppia elica
Essential Cell Biology 4th edition
Essential Cell Biology 4th edition
Il codice genetico
4 nucleotidi
20 amminoacidi
migliaia di proteine
Il DNA deve essere accessibile all’occorrenza
Quando una cellula si duplica il DNA deve essere
- duplicato
- suddiviso (correttamente) tra le due cellule
il codice genetico
Il codice genetico
L’intero genoma umano è lungo circa 2 m
Il nucleo di una cellula umana ha un diametro di 5-8 um
1 cm
1 cm / 10
1 mm
1 mm / 1000
1 um
I cromosomi
Il DNA viene «ripiegato» da proteine specifiche, in modo da occupare meno spazio
Le strutture che si vengono a formare si chiamano cromosomi
Essential Cell Biology 4th edition
I cromosomi
DNA
DNA + istoni + proteine non istoniche = cromatina
cromatina
nucleosoma
Essential Cell Biology 4th edition
nucleosoma = 8 proteine istoniche (2 H2A + 2 H2B + 2 H3 + 2 H4)
DNA lungo 147 nucleotidi
Essential Cell Biology 4th edition
I cromosomi
da cromatina  fibra di cromatina
cromatina
=
cromatina + istone H1
fibra di cromatina
istone H1 modifica l’inclinazione del filamento di DNA appena esce dal
nucleosoma
permette la formazione di una fibra di cromatina più compatta
Essential Cell Biology 4th edition
I cromosomi
la fibra di cromatina è avvolta in una
serie di anse (loops)
meccanismi non ancora
identificati
i loops vengono ulteriormente
compattati per formare i cromosomi
ogni molecola di DNA diventa un cromosoma 10.000 volte più piccolo della molecola di partenza
Essential Cell Biology 4th edition
La replicazione
i cromosomi si
estendono nel nucleo
come sottili filamenti di
DNA
ogni cromosoma viene
duplicato
Essential Cell Biology 4th edition
i cromosomi vengono
segregati tra le due
cellule
1 copia/cellula
ritorno allo stato di
cromosomi estesi
La replicazione
1 cromosoma
2 cromosomi
1 cromosoma/cellula
duplicazione
fuso mitotico
Essential Cell Biology 4th edition
La replicazione
cromosomi in mitosi (compatti)
cromosomi in interfase (estesi)
Essential Cell Biology 4th edition
Replicazione del DNA
Ad ogni divisione cellulare, una cellula deve copiare (con precisione) tutto il corredo genetico
DNA: 2 filamenti, uno complementare all’altro
Replicazione semiconservativa
2 stampi
vecchio
nuovo
nuovo
vecchio
Essential Cell Biology 4th edition
Replicazione del DNA
I due filamenti della doppia elica sono tenuti insieme da legami idrogeno
Servirebbe una temperatura vicina ai 100°C per ottenere sufficiente energia per
spezzare i legami e separare i due filamenti di DNA
Proteine iniziatrici legano regioni specifiche del DNA, le origini di replicazione
Le proteine iniziatrici rompono i legami idrogeno tra le basi
Essential Cell Biology 4th edition
Replicazione del DNA
Il genoma umano è molto lungo
La replicazione inizia contemporaneamente in circa 10.000
origini di replicazione
Ad ogni origine di replicazione si formano 2 biforcazioni
La replicazione del DNA procede in direzioni opposte  bidirezionale
Essential Cell Biology 4th edition
Replicazione del DNA
Nuovi nucleotidi vengono aggiunti uno ad uno, formando il nuovo filamento
(new strand).
Ogni nucleotide aggiunto deve essere complementare al nucleotide presente
nel filamento stampo (template strand).
L’aggiunta dei nuovi nucleotidi avviene ad opera di un enzima: la DNA polimerasi.
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Replicazione del DNA
La DNA polimerasi è precisa: 1 errore di accoppiamento tra le basi ogni 10.000.000 di nucleotidi aggiunti
proofreading
Nucleotidi errato
La DNA polimerasi
aggiunge i nuovi
nucleotidi nel sito di
polimerizzazione P
Rimozione del nucleotide
Controlla e rimuove i nucleotidi nel
sito di editing E
Essential Cell Biology 4th edition
Aggiunta del nucleotide corretto
Replicazione del DNA
Conseguenze di mutazioni: Anemia falciforme
La funzionalità di una proteina è determinata dalla sequenza di amminoacidi che la
compongono
La sequenza di amminoacidi è determinata dalla sequenza di nucleotidi nel DNA
La mutazione di 1 nucleotide può cambiare 1 amminoacido nella proteina
 Può alterarne la funzionalità
L’emoglobina trasporta l’ossigeno nel sangue
La mutazione rende l’emoglobina meno solubile  forma aggregati  i globuli rossi
cambiano forma e diventano più fragili
 debolezza, capogiri, mal di testa
 i globuli rossi aggregati possono bloccare i vasi  l’afflusso di sangue
La mutazione provoca uno svantaggio
Ma aumenta la resistenza alla malaria!
Essential Cell Biology 4th edition
Replicazione del DNA
La replicazione del DNA inizia in diversi punti
Serve un segnale di inizio per l’inizio della replicazione: un primer
L’enzima primasi, cioè un’ RNA polimerasi, sintetizza un piccolo frammento di RNA
complementare allo stampo DNA
La DNA polimerasi comincerà la sintesi del nuovo filamento da quel primer
Essential Cell Biology 4th edition
Replicazione del DNA
Origine di replicazione 2
Origine di replicazione 1
La replicazione del DNA inizia in diversi punti
Primer di RNA
Nuovo filamento di DNA
DNA polimerasi
DNA polimerasi
La DNA polimerasi raggiunge il primer dell’origine di replicazione seguente
Nucleasi
DNA polimerasi
Una nucleasi degrada il primer di RNA
Polimerasi di riparazione
Una polimerasi di riparazione aggiunge i nucleotidi di DNA
DNA ligasi
Una DNA ligasi unisce i frammenti di DNA
Essential Cell Biology 4th edition
Replicazione del DNA
I due filamenti di DNA sono antiparalleli
Le DNA polimerasi avanzano lungo i filamenti
in direzioni opposte
Il DNA è composto da due filamenti separati
Quando la nucleasi degrada il primer di DNA,
rimane un «buco»
La fine dei filamenti di DNA (la fine dei cromosomi) è diversa dal resto della molecola di DNA
Non contiene sequenze che verranno tradotte in proteine, ma sequenze ripetute di nucleotidi
I telomeri
Essential Cell Biology 4th edition
Replicazione del DNA
Fine del cromosoma
La telomerasi si lega al filamento stampo
Aggiunge sequenze ripetute  allunga il filamento stampo
Una DNA polimerasi può legarsi e sintetizzare il frammento di DNA mancante
Essential Cell Biology 4th edition
Come «vedere» il DNA: la PCR
PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi)
da 1 filamento di DNA  miliardi di copie in poche ore
Necessari:
Campione di DNA
2 primers (sequenze complementari alla regione che vogliamo amplificare, 1 primer/filamento
DNA polimerasi
Nucleotidi (A, T, C, G)
Buffer
Acqua
Termociclatore
Come «vedere» il DNA: la PCR
Le varie componenti sono legate tra di loro da
diversi tipi di legame
- legami covalenti
- legami idrogeno
Essential Cell Biology 4th edition
Come «vedere» il DNA: la PCR
Temp Ambiente
90°C
Temp Ambiente
90°C
Doppia elica
Essential Cell Biology 4th edition
raffreddamento
Singoli filamenti
Doppia elica
Come «vedere» il DNA: la PCR
90°C
raffreddamento
Rinaturazione
Denaturazione
Doppia elica
Singoli filamenti
Doppia elica
DNA denaturato
Ibridizzazione
DNA rinaturato
Frammenti di DNA complementari
ad una regione specifica del
genoma
Ibridizzazione
Essential Cell Biology 4th edition
Come «vedere» il DNA: la PCR
Replicazione
Primer
DNA
polimerasi
DNA
polimerasi
DNA
polimerasi
DNA
polimerasi
DNA
polimerasi
Essential Cell Biology 4th edition
Come «vedere» il DNA: la PCR
Campione di DNA
Soluzione
Termociclatore
2 primers
Nucleotidi (A, T, C, G)
DNA polimerasi
Denaturazione
Rinaturazione
Sintesi del DNA
1 ciclo di PCR
1 copia di DNA
2 copie di DNA
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Come «vedere» il DNA: la PCR
1° ciclo
2° ciclo
3° ciclo
Essential Cell Biology 4th edition
La reazione è esponenziale: dopo 30 cicli di PCR si ottengono ~1.000.000.000 di copie della sequenza di DNA di interesse
A cosa serve la PCR
Diagnosi di malattie
Essential Cell Biology 4th edition
A cosa serve la PCR
Diagnosi di malattie e valutazione dell’efficacia terapeutica
Essential Cell Biology 4th edition
Come «vedere» il DNA
http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/quantitative-pcr-and-digital-pcrdetection-methods.html
La fluorescenza emessa
dal SYBR GREEN è
proporzionale al numero
di molecole di DNA
presenti ad ogni ciclo
La reazione si ferma, si arriva al plateau
Cindy J. Smith, A. Mark Osborn. FEMS
Microbiol Ecol (2009) 67 (1): 6-20.
Come «vedere» il DNA
Fluorescenza
più copie
meno copie
numero di cicli di PCR