Biotecnologie Screening delle genoteche con le sonde geniche

Biotecnologie
Screening delle genoteche con le sonde geniche
Giancarlo Dessì
http://www.giand.it
Licenza Creative Commons BY-NC-SA
(BY: attribuzione, NC: uso non commerciale, SA: condividi allo stesso modo)
Scopo di questa tecnica è l’estrazione o
isolamento di un gene o di una specifica
sequenza di DNA da una genoteca.
La tecnica si basa sui seguenti presupposti:
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•
si conosce almeno in parte la sequenza nucleotidica di uno dei
filamenti del frammento cercato (DNA bersaglio)
•
si dispone di una sequenza complementare costruita
artificialmente impiegando nucleotidi marcati con isotopi
radioattivi (sonda genica)
•
un frammento di DNA può essere linearizzato e separato nei
suoi due filamenti singoli con tecniche di denaturazione
•
la sonda genica si “appaia” spontaneamente al filamento
complementare del frammento ricercato (ibridazione).
Le genoteche
Una genoteca è una raccolta di geni o frammenti di DNA contenuti alla
rinfusa in un insieme di vettori di clonazione (plasmidi, cosmidi, fagi, ecc.).
Essa è rappresentativa quando contiene almeno una copia di tutte le
possibili sequenze.
Esistono due tipi di genoteche rappresentative:
1) Genoteca genomica. Contiene l’intero genoma di un
organismo, perciò comprende sia il DNA intronico sia
quello esonico.
2) Genoteca di DNA complementare (cDNA). Contiene
solo i geni di espressione del tessuto a cui si riferisce e,
quindi, solo DNA esonico. Da tessuti diversi dello stesso
organismo si ottengono genoteche di cDNA differenti.
Genoteca genomica
Genoteca di cDNA
Si estrae il DNA da un campione di cellule
dell’organismo e si frammenta con uno o
più enzimi di restrizione.
Si estrae il RNA messaggero (mRNA) da
un campione di cellule di un tessuto
dell’organismo.
Con gli stessi enzimi di restrizione, si
incorporano i frammenti in vettori di
clonazione (es. plasmidi ).
Con l’impiego dell’enzima trascrittasi
inversa si costruisce un filamento di DNA
complementare al mRNA. Il filamento di
RNA viene poi distrutto e sostituito da un
filamento di DNA complementare a quello
ottenuto con la trascrittasi inversa.
Questi vengono amplificati sfruttando la
capacità delle cellule procariote di
assumere materiale genetico dall’esterno
(es. per trasformazione batterica) e di
replicarli più volte al loro interno.
Dalla moltiplicazione di ciascuna cellula si
ottiene un clone , ovvero un insieme di
cellule
che
contengono
lo
stesso
frammento di DNA clonato.
L’estrazione dei vettori di clonazione, dopo
l’amplificazione, permette la raccolta in una
sola provetta di tutti i frammenti di DNA,
ciascuno contenuto all’interno di un
vettore.
La provetta contenente l’intero DNA
distribuito alla rinfusa nei plasmidi clonati
rappresenta la genoteca genomica .
Figura 1
Il materiale ottenuto, detto cDNA, contiene
solo il DNA dei geni codificanti funzionali
per il tessuto specifico. Non contiene
pertanto DNA intronico e i geni “disattivati”.
Usando gli enzimi di restrizione, i
frammenti di cDNA vengono incorporati in
vettori di clonazione (es. molecole di DNA
fagico ).
Questi vengono introdotti nelle particelle
virali e amplificati sfruttando la capacità dei
batteriofagi di moltiplicarsi attraverso le
cellule di Escherichia coli .
Dalla infezione fagica di ciascuna cellula si
ottiene un clone, ovvero un insieme di
particelle virali che contengono lo stesso
frammento di DNA clonato.
La raccolta dei vettori di clonazione, dopo
l’amplificazione, contenente l’intero cDNA
distribuito alla rinfusa nei fagi clonati
rappresenta la genoteca di cDNA di uno
specifico tessuto.
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Figura 1 . Costituzione di una biblioteca genomica.
1: prelievo di un campione di cellule. 2: estrazione del DNA. 3: trattamento con enzimi di
restrizione e inclusione in plasmidi usati come vettori di clonazione. 4: inclusione dei plasmidi
ricombinati in cellule batteriche. 5: amplificazione del DNA ricombinato per moltiplicazione
delle cellule. 6: estrazione dei plasmidi e costituzione della genoteca.
La scelta del vettore di clonazione e del metodo di amplificazione
dipende dalle dimensioni dei frammenti di DNA genomico o
complementare.
I plasmidi sono infatti usati per frammenti di piccole dimensioni e sono
perciò poco adatti per costituire genoteche di organismi superiori.
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Le sonde geniche
Una sonda genica è un filamento singolo di DNA, costruito
artificialmente sulla base di una sequenza predefinita di
basi.
Per gli scopi che si propone l’utilizzo delle sonde geniche,
il filamento è costruito con nucleotidi marcati con l’isotopo
radioattivo 32 P o con altri metodi di marcatura.
Le sonde geniche sono a filamento singolo .
Per evitare l’accoppiamento spontaneo dei filamenti o il
loro ripiegamento, la sequenza di basi non deve perciò
contenere tratti reciprocamente complementari.
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AATCCTGGCCCATCAATCCGTGAGTTAAATTGATGGGCTTAAGGGGGTATTCC
Questo frammento, ad esempio, non può essere impiegato come sonda genica
perché le due sequenze evidenziate in blu sono reciprocamente complementari.
Queste sequenze provocherebbero l’accoppiamento spontaneo di due frammenti
distinti (Figura 2 ) oppure il ripiegamento del filamento per l’accoppiamento
spontaneo dei due tratti complementari (Figura 3 ).
Figura 2 . Appaiamento spontaneo dei frammenti in
corrispondenza di sequenze complementari.
Le sonde geniche hanno lunghezze da
poche decine a qualche migliaio di paia
di basi (bp).
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Figura 3 . Ripiegamento
del frammento per
appaiamento di sequenze
complementari.
Denaturazione e ibridazione
La struttura del DNA a doppio filamento avvolta a
spirale è resa possibile dai legami a idrogeno che si
instaurano tra le basi azotate.
Sulla stabilità di questa struttura influiscono diversi
fattori.
Fattori destabilizzanti .
Fattori stabilizzanti .
- alta temperatura (>90°C)
- lunghezza del doppio filamento
- pH elevato (>pH 11)
- frequenza degli accoppiamenti guanina-citosina
- concentrazione salina
Denaturazione o melting
Consiste nella destabilizzazione della struttura: la doppia elica si svolge e i legami a
idrogeno si rompono causando la separazione dei due singoli filamenti.
Il fenomeno è indotto artificialmente sottoponendo il DNA a riscaldamento, a temperature
generalmente superiori a 90°C.
Ogni molecola di DNA ha una sua specifica temperatura di melting , in relazione agli altri
fattori stabilizzanti e destabilizzanti.
La denaturazione è una trasformazione reversibile .
L’abbassamento di temperatura fino a valori di 45-65°C
permette l’appaiamento spontaneo dei filamenti singoli e
il riavvolgimento della doppia elica.
Ibridazione
Fenomeno per cui, in opportune condizioni di temperatura e concentrazione salina, un
filamento singolo di DNA (DNA bersaglio ) è appaiato spontaneamente da un altro
frammento di DNA a singolo filamento in un tratto di sequenza complementare ( Figura 4 ).
Le molecole di DNA a doppia elica ottenute dall’ibridazione sono dette eteroduplex .
Il fenomeno è sfruttato per individuare una specifica sequenza di basi con l’uso delle
sonde geniche.
Figura 4 . Molecola eteroduplex ottenuta per ibridazione.
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Screening di una genoteca (metodo del colony blot )
I batteri contenenti i geni clonati vengono inoculati in una capsula
Petri su un apposito terreno di coltura. Ogni cellula contiene un
frammento della genoteca, tuttavia non si conosce la posizione delle
cellule contenenti il gene da isolare.
Dopo l’incubazione, da ogni cellula si sviluppa una colonia.
Tutte le cellule di una colonia contengono lo stesso
frammento di DNA clonato .
Nella foto, colonie di Escherichia coli, incubate in una
capsula Petri.
(Fonte: Wikimedia Commons, autore: Madeleine Price
Ball, licenza Creative Commons BY-SA 3.0)
Si stende sulle colonie un filtro di
nitrocellulosa o di nylon
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Le cellule assorbite dal filtro vengono distrutte (lisi)
e il DNA liberato sottoposto a denaturazione.
Il filtro viene bagnato con
una soluzione contenente
la sonda genica specifica,
marcata con 32P.
Dopo il lavaggio, sul filtro restano
solo le sonde geniche che si sono
appaiate al DNA bersaglio del
frammento cercato (ibridazione ).
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Si sovrappone al filtro una pellicola sensibile ai raggi X.
La pellicola sarà impressionata in corrispondenza delle aree
in cui si sono concentrate le sonde geniche marcate con
l’isotopo radioattivo (autoradiografia ).
Il confronto tra le aree della pellicola impressionate e la
piastra Petri di origine permette di localizzare le colonie
contenenti il frammento di DNA bersaglio.
A questo punto si prelevano le cellule dalle colonie
individuate e si procede alla loro moltiplicazione allo
scopo di amplificare il frammento di DNA bersaglio.
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