Risposta delle piante agli
stress
Stress
• Condizioni esterne che influiscono
negativamente sulla crescita, sviluppo o
produttività della pianta
•Lo stress scatena un grande numero di
risposte della pianta:
–altera l’espressione genica
–altera il metabolismo cellulare
Tipi di Stress
•Biotico - imposto da altri organismi
•Abiotico – insorge da un eccesso o
deficit nell’ambiente fisico o chimico
Gli stress biotici e abiotici possono ridurre la
media della produttività della pianta dal 65%
all’ 87%, in dipendenza della pianta
Risposta della Pianta agli
Stress Abiotici
• insorgono da un eccesso o deficit
nell’ambiente fisico o chimico
Condizioni ambientali che
possono causare Stress
•
•
•
•
•
allagamenti
siccità
Eccesso di salinità nel suolo
Alte e basse temperature
Contenuto non adeguato di minerali nel
suolo
• Troppa o poca luce
• inquinamento
La resistenza o la suscettibilità delle piante
allo stress dipende da:
Caratteristiche Caratteristiche
dello stress
della pianta
Stress
ambientale
Severità
Organo o
tessuto
Durata
Stadio di
sviluppo
Esposizioni
Genotipo
Risposta
Risultato
Resistenza
Sopravvivenza
e sviluppo
Suscettibilità
Morte
Meccanismi di resistenza allo stress
• Meccanismi di evitamento
– Prevengono l’esposizione
allo stress
•Meccanismi di tolleranza
–Consentono alla pianta di
sopportare lo stress
Se le condizioni di stress vengono
raggiunte in modo ‘progressivo’
Acclimatazione
La pianta modifica la sua
fisiologia in risposta allo
stress
Risposta molecolare della pianta
allo Stress
Produzione di
molecole
segnale
Modificazione
della
trascrizione
Eventi
fisiologici
e di
sviluppo
Modificazione
del
metabolismo
cellulare
Molecole segnale coinvolte
nella regolazione delle
risposte della pianta agli
stress
•
•
•
•
Acido abscissico (ABA)
Acido Jasmonico
Etilene
Calcio
L’alterazione dell’espressione
genica risulta principalmente nel:
• Aumentare la quantità di specifici
mRNA
• Ridurre la quantità di specifici mRNA
• Carenza idrica
• salinità
• allagamento
• alta o bassa temperatura
• Stress ossidativo
Stress da carenza idrica
• Lo stress idrico insorge quando
l’ambiente contiene un quantitativo di
acqua insufficiente per svolgere le
reazioni metaboliche primarie
Condizioni ambientali che
possono condurre alla
carenza idrica
•
•
•
•
siccità
Condizioni ipersaline
Basse temperature
Elevate temperature (perdita transiente
del turgore a ‘mezzogiorno’)
Fattori che possono
influenzare la risposta della
pianta al deficit idrico
• La velocità di insorgenza
• Durata della carenza idrica
• Se la pianta è stata acclimatata allo
stress idrico
Lo stress idrico influenza diversi processi
fisiologici
Accumulo ac. abscissico
Accumulo di soluto
Fotosintesi
Conduttanza stomatica
Sintesi proteica
Sintesi di parete
Espansione cellulare
Ben idratate
Moderato
stress idrico
Climi aridi
deserto
Movimento passivo dell’acqua
Yw=Ys + Yp + Yg + Ym
Yw maggiori > Yw minori
Esempi per illustrare il concetto di potenziale idrico
Yw=Ys + Yp + Yg + Ym
Ys=-RTCs
A livello cellulare
H2O pura
Lo stato di riferimento
utilizzato per definire il Yw è
l’acqua pura a pressione e
temperatura ambientale,
Yw=Ys + Yp
0,1 M saccarosio
In una soluzione 0,1 M di
saccarosio il Yw= -0,244 Mpa
Esempi: Comportamento osmotico delle cellule vegetali:
Yw maggiori > Yw minori
0,1 M saccarosio
Cellula all’equilibrio
Cellula turgida
0,3 M saccarosio
Cellula all’equilibrio
Una pianta appassisce
quando Yp=0
La plasmolisi si ha quando la
cellula perde così tanta H2O
che la membrana plasmatica si
stacca dalla parete cellulare.
Plasmolisi di una cellula
epidermica di Allium cepa dopo
aggiunta di nitrato di calcio.
Chiusura degli stomi
È una risposta adattativa rapida allo stress da
carenza idrica
Stomi
costituiti da due cellule di guardia circondate da due
cellule sussidiarie che aiutano a controllare le aperture
stomatiche.
Meccanismo di apertura stomatica
Cl-
Canale del Potassio
voltaggio dipendente
+
K+
+
+
+
K+ K+
K+
+
K+ K++
+
+
K+
K+
+
K+
(Determina la
specificità)
+
+ K++
K+
+
+
K+ K++
+
+
K+
K+
+
K+
K+
K+
+
+
+
K+
Modello d’azione dell’ABA nelle cellule di guardia degli stomi
Ridistribuzione dell’ABA durante lo stress idrico
Ridistribuzione di ABA durante lo stress idrico
Orientamento dei complessi enzimatici
nella membrana tilacoidale
Stroma
Lume del tilacoide
L’ABA promuove la tolleranza
dell’embrione allo stress idrico
•Durante la fase di disidratazione del seme induce la
sintesi di particolari proteine (LEA, LateEmbryogenesis-Abundant) coinvolte nella tolleranza
alla disidratazione
•Le proteine LEA, insieme alle proteine RAB
(Responsive to ABA) e DHN (deidrine), sono ricche in
glicina e lisina e povere di aminoacidi idrofobici.
•Sono molto idrofiliche e quindi dovrebbero
proteggere le membrane e le proteine dai danni della
disidratazione
Stress idrico: Riduzione
dell’area fogliare
La riduzione dell’area fogliare è una risposta
adattativa al deficit idrico
L’espansione cellulare è descritta da:
GR=m(Yp-Y)
GR, velocità di crescita
m, estensibilità della parete
Yp, potenziale di pressione o pressione di turgore
Y, soglia di cedevolezza (la pressione sotto la quale la
parete cellulare resiste a deformazione plastica, o
non reversibile)
L’area fogliare totale è controllata anche quando le foglie sono mature
Condizioni ambientali che
possono condurre alla
carenza idrica
• siccità
•Condizioni ipersaline
•Basse temperature
•Elevate temperature (perdita
transiente del turgore a
‘mezzogiorno’)
Lo stress salino conduce ad uno stress idrico
Yw maggiori > Yw minori
Yw=Ys + Yp + Yg + Ym
Ys=-RTCs
Aggiustamento osmotico nello
stress da siccità e salinità
• Aggiustamento osmotico
– meccanismo biochimico che aiuta la
pianta ad acclimatarsi a condizioni di
siccità e salinità
–Regolazione dello Ys mediante un
aumento netto nel numero delle
particelle di soluto presenti nella cellula
Aggiustamento osmotico
Aggiustamento osmotico
Soluti che contribuiscono
all’aggiustamento osmotico
I soluti compatibili (osmoliti compatibili) sono una classe di composti
organici, chimicamente differenti, altamente solubili che non
interferiscono con il metabolismo cellulare neanche ad alte
concentrazioni
Soluti compatibile (osmoliti)
• I soluti compatibili tendono ad essere con
carica neutra a pH fisiologico e sono esclusi
dalle conchiglie di idratazione delle
macromolecole.
• In contrasto, molti ioni possono entrare nelle
conchiglie di idratazione di una proteina e
promuoverne la denaturazione
I soluti compatibili non
distruggono i gusci di
idratazione delle
macromolecole
Adattamento osmotico in una cellula del mesofillo di
spinacio sottoposta a stress salino: gli ioni che
potrebbero risultare dannosi sono accumulati nel vacuolo
mentre la glicina betaina viene accumulata nei cloroplasti e
nel citoplasma
Qualche evidenza diretta a
favore dell’importanza
degli osmoliti
nell’incremento di
resistenza alla siccità e
salinità
Piante Transgeniche
• Piante transgeniche di tabacco e Arabidopsis
ingegnerizzate per esprimere il gene di E. coli per la
mannitolo-1-fosfato deidrogenasi NAD+-dependente,
che converte il fruttosio 6-fosfato in mannitolo-1fosfato, sintetizzano mannitolo a basse concentrazioni
• In queste piante transgeniche la resistenza allo
stress salino è aumentato e i semi sono in grado di
germinare in presenza di concentrazioni saline
elevate
La regolazione osmotica induce tolleranza alla disidratazione ma
può non avere un effetto preponderante sulla produttività
Cowpea=fagiolino dall’occhio
(risparmia acqua chiudendo gli
stomi durante lo stress)
Yw molto differenti ma
la perdita di acqua totale
e il suo guadagno in
carbonio risultano poco
affetti dallo stress
I promotori dei geni regolati dall’ABA contengono un
segmento di 6 nucleotidi definito Elemento di Risposta
all’ABA (ABRE)
CACGTG
Questi promotori contengono anche un segmento di 9
nucleotidi, L’Elemento di risposta alla Disidradazione
(DRE) che è riconosciuto da un diverso set di proteine.
Vie di trasduzione del segnale per lo stress osmotico
Raffreddamento e congelamento
Lo stress da congelamento: le basse temperature
possono causare una sorta di stress da carenza idrica
Ciò è conseguente al fatto che il ghiaccio ha un Yw
più basso dell’acqua, per cui non appena si inizia a
formare ghiaccio negli spazi intercellulari la cellula
perde acqua
Processi che intervengono nella tolleranza
al congelamento:
1) stabilità delle membrane;
2) accumulo di zuccheri,
3) altri osmoliti e proteine anticongelamento (molte proteine
PR sono anche anticongelamento)
•Stabilità delle membrane
I lipidi di membrana di piante resistenti al
freddo posseggono una proporzione
maggiore di acidi grassi insaturi rispetto a
quelli di piante sensibili
I lipidi saturi, che non hanno doppi legami,
solidificano a temperature più alte dei
lipidi insaturi
(es. il burro, che è costituito da lipidi
saturi, è solido a temperatura ambiente,
mentre l’olio, che è più ricco di lipidi
insaturi, è liquido a temperatura ambiente)
Tab. 25.2 TAIZ
L’importanza dei lipidi di membrana per la tolleranza
alle basse temperature è stata dimostrata con studi
di mutanti e linee transgeniche
Es: Transgeni codificanti per la glicerolo 3 fosfato aciltrasferasi (GPAT)
•Sintesi di proteine anticongelamento
Figure 3
Relationship of carrot AFP sequence to PGIPs and
LRRs. (A) The deduced carrot AFP amino acid
sequence (GenBank accession number AF055480)
was aligned with kiwi PGIP (ADPGIP; GenBank
Z49063) and pear PGIP (PCPGIP;
GenBankL09264). Dots in the PGIP sequences
indicate amino acids that are identical to the AFP
sequence, and dashes indicate gaps introduced to
maximize alignment. The positions of peptide
sequences obtained from the native carrot protein
are boxed, and potential N-glycosylation sites are
underlined. The arrow indicates the putative signal
sequence cleavage site. (B) Comparison of LRR
motifs. The AFP consensus was derived from the
AFP sequence in which amino acids were present in
at least 50% of the repeats. The PGIP consensus
was derived from the tomato, bean, and pear
sequences (28). Cf-9, membrane-anchored
receptorlike protein, tomato (GenBankU15936);
RLK5, receptorlike kinase, Arabidopsis
thaliana(GenBank M84660); leucine-rich α2GP,
LRR protein of unknown function, human (PIR
NBHUA2); TOLL, transmembrane
protein,Drosophila melanogaster (GenBank
PO8953); SDS22, protein involved with mitosis,
yeast (GenBank X836903).
Esperimenti di ricristallizazione del ghiaccio con la
proteina antifreezing AFP di carota
Tampone
Acclimatato
Non acclimatato
con AFP eterologa
-6°C
Figure 1 Sucrose-sandwich-splat assay for inhibition of ice recrystallization.
Carrot root homogenates were adjusted to 1 mg/ml protein in buffer [50 mM Tris/HCl (pH 7.5)/30% (w/w)
sucrose] and assayed by sucrose sandwich splat as described in the Experimental section. Images were
captured after a 40 min incubation at -6 °C. Panel 1, control buffer; panel 2, cold-acclimated carrot root
homogenate; panel 3, non-acclimated carrot root homogenate; panel 4, positive control recombinant AFPIII
(100 µg/ml). The bar represents 50 µm. Biochemical Journal (1999) Volume 340
La tolleranza al congelamento implica cambiamenti
dell’espressione genica
Molti geni vengono indotti in seguito a stressa da freddo ma la
loro funzione non è stata ancora chiarita. In genere sono
proteine idrofiliche. Es. proteine LEA e COR
Allagamento e carenza di
ossigeno
Glicolisi
(nel citosol)
Ciclo dell’acido citrico
(nella matrice mitocondriale)
Trasferimento di
elettroni/Fosforilazione
ossidativa
(nella membrana
mitocondriale interna)
Classificazione delle piante in base alle loro sensibilità alla
mancanza di ossigeno
•Idrofite: es: Riso
•Tolleranti l’allagamento: Patata, Orzo, frumento, mais
•Sensibili all’allagamento: Soia, pomodoro, pisello
Specifiche caratteristiche anatomiche, morfologiche e
fisiologiche per facilitare il trasporto di O2 o ridurne la
perdita
-Ipoderma radicale ispessito per ridurre perdite di 02
-Trasporto di 02 dalle parti aeree alle radici tramite
strutture specifiche:
•Aerenchimi
•Radici avventizie dall’ipocotile o dal fusto
•Lenticelle
•Radici poco profonde o pneumatofori
Sviluppo di aerenchima in radici di mais in seguito ad allagamento
Sviluppo di pneumatofori in piante di Mangrovie
Epinastia - un ulteriore esempio di ri-orientamento della
crescita (es. si verifica in pomodoro in condizioni di ipossia
delle radici)
•L’epinastia è la curvatura verso il
basso delle foglie causata da una
maggiore crescita delle cellule nella
parte superiore del picciolo
•È differente dall’avvizzimento,
infatti richiede turgore cellulare
•E’ una risposta adattativa per
ridurre l’avaporazione dell’H2O
necessaria per il raffreddamento
e la traspirazione (in quanto
l’epinastia riduce l’intensità e la
quantità totale di radiazione
ricevuta dalle foglie)
Come fa la pianta a trasferire alla
parte superiore il segnale percepito
dalle radici (in ipossia, ad es.
allagamento) ?
Cambiamenti nelle quantità di ACC nel liquido xilematico e
nella produzione di etilene nel picciolo in seguito ad
allagamento in pomodoro
Effetto dell’allagamento di riso: allungamento di
internodi, formazione di aerenchima e formazione
di radici avventizie
In condizioni di anossia vengono represse ed attivate specifiche proteine
SDS-PAGE bidimensionale di proteine estratte da apici radicali di mais
Stress ossidativo
Stress Ossidativo
• Lo stress ossidativo risulta da condizioni
che promuovono la formazione delle specie
reattive dell’ossigeno (che sono in grado di
danneggiare o uccidere la cellula)
Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS):
Anione Superossido (O2· -)
Perossido di Idrogeno (H2O2)
Radicale Idrossidrile (OH·)
Ossigeno Singoletto (1O2)
• Sono specie chimiche con un elettrone spaiato nello
strato orbitale più esterno.
• Questo li porta a ricercare un equilibrio appropriandosi
dell’elettrone delle altre molecole con le quali vengono a
contatto
• Queste molecole (es. lipidi) diventano instabili e
ricercano a loro volta un elettrone, innescando un
meccanismo di instabilità a “catena”.
Le ROS si formano durante alcune reazioni redox e durante la
riduzione incompleta dell’O2 o l’ossidazione dell’ H2O da parte
delle catene di trasporto degli elettroni dei mitocondri e dei
cloroplasti
Le ROS sono necessarie per la lignificazione o nella
segnalazione per l’induzione della risposta di difesa della
pianta ai patogeni
Le piante eliminano le ROS mediante sistemi antiossidanti
Agenti antiossidanti.
l’enzima superossido dismutasi (SOD)
trasforma in perossido di idrogeno alcune
ROS.
A sua volta il perossido di idrogeno, tramite
l’enzima catalasi (CAT) e glutatione
perossidasi (GSAPx, selenio dipendente),
viene ridotto in ossigeno e acqua.
il sistema di difesa antiossidante
La via Halliwell-Asada
Fattori ambientali che fanno aumentare le
concentrazione delle specie reattive dell’ossigeno
Erbicidi
(Metilviologeno)
Intercetta elettroni e
produce O2-
PARAQUAT
L’O3 aumenta con l’inquinamento
dell’aria
•Idrocarburi e gli ossidi di azoto (NO, NO2) e zolfo (SO2)
reagiscono con gli UV della radiazione luminosa generando
ozone (O3)
•Combinandosi con il vapor d’acqua dell’atmosfera
rendono le pioggie acide pH > 3.0 (normalmente 5.5.)
(es. SO2 -> H2SO4)
Ozono e lo stress ossidativo
• idrocarburi e gli ossidi di azoto (NO, NO2) e
zolfo (SOx) reagiscono con gli UV della
radiazione luminosa generando ozone (O3).
• L’O3 si lega alla membrana plasmatica e
altera il metabolismo
• L’ozono è un ossidante altamente reattivo
che reagendo con l’O2 produce H2O2, (O2-),
(.OH).
L’effetto negativo dell’ozono
sulle piante
•
•
•
•
•
Diminuisce la velocità fotosintetica
Danni fogliari
Riduce la crescita dei germogli e radici
Accellera la senescenze
Riduce la produttività
Danno da ozono
•
•
•
•
•
Altera il trasporto ionico
Aumenta la permeabilità della membrana
Inibisce l’attività della pompa H+
Elimina il potenziale di membrana
Aumenta l’assunzione di Ca2+
dall’apoplasto
• Danno ossidativo delle biomolecole
Foglie di avena sativa danneggiate da O3
Resistenza all’ozono
Utilizza sia evitamento che la tolleranza
• Evitamento implica l’esclusione fisica degli
inquinanti chiudendo gli stomi, il sito
principale di ingresso dell’ozono nella
pianta
•Tolleranza – presenza di sostanze antiossidanti
e risposte biochimiche che attivano il sistema di
difesa antiossidante e anche diversi meccanismi
di riparo
Stress da calore
• Può verificarsi nelle foglie
– Quando la traspirazione è insufficiente
– Quando gli stomi sono parzialmente o
completamente chiusi e l’irradianza è alta
•Può verificarsi nei semi in germinazione quando il
suolo è riscaldato dal sole
•Può verificarsi in organi con ridotta capacità
tranpiratoria , es. frutti
Ad alte temperature la fotosintesi è inibita
prima della respirazione
Tidestromia oblongifolia
Atriplex sabulosa
Punto di compensazione della temperatura: la
temperatura alla quale la quantità di CO2 fissata dalla
fotosintesi equivale a quella liberata dalla
respirazione
Resistenza o sensibilità delle
piante allo stress da calore
•
•
•
•
Durata
Severità dello stress
Suscettibilità dei differenti tipi di cellule
Stadio di sviluppo
•Termotolleranza intrinseca
•Termotolleranza acquisita: graduale adattamento
della pianta alle alte temperature
Esempio di induzione della termotolleranza in piantine di soia
28 °C
Pretrattamento 2 h a 40°C
Poi 45°C
45°C Senza
pretrattamento
Stress da alta temperatura
• La tipica risposta allo stress da calore è una
diminuzione nella sintesi delle normali
proteine, seguita da una aumentata
trascrizione e traduzione di nuove proteine
note come proteine heat shock (HSP)
Proteine da stress da calore (Heat
Shock Protein, HSP)
Gel SDS-PAGE
Classi di HSP
Protein class
HSP100
HSP90
HSP70
HSP60
smHSP
Size (kDa)
100-114
80-94
69-71
10-60
15-30
Location
cytoplasm
cytoplasm, ER
ER, cytoplasm, mitochondria
chloroplasts, mitochondria
cytoplasm, chloroplast, ER, mitochondria
Contenuto non adeguato di minerali nel suolo
L’alluminio (Al3+) è la limitazione maggiore alla
produttività in suoli acidi
Circa il 30% delle terre del mondo sono costituite da
suoli acidi (il 60% di questi si trovano ai tropici)
Circa ilo 12% sono utilizzati per la coltivazione
20% dei suoli coltivati a mais sono suoli acidi
13% di quelli coltivati a riso
5% di quelli coltivati a frumento
L’uso di fertilizzanti ammoniacali sta incrementando la
percentuale di suoli acidi
Effetto dell’Al su radici
di frumento
Al-Resistente
Al-Sensibile
La forma di Al rizotossica nei suoli acidi è lo ione Al3+
Meccanismi di resistenza
• Tolleranza nell’accumulo cellulare di Al; ipotesi: proteine
specifiche legano l’Al e poi lo sequestrano nel vacuolo
• Esclusione dell’Al dagli apici radicali; ipotesi: accumulo
di acidi organici nella rizosfera indotti dalle radici stesse
Rilascio di malato Alinducibile in radici di
linee isogeniche di
frumento Al-tolleranti
e Al-sensibili
Modello proposto per la tolleranza all’Al mediante il rilascio di acidi
organici in radici indotto dall’Al.
Proteine coinvolte nello stress abiotico e
biotico
(o famiglie geniche che possono contenere membri
coinvolti in stress di tipo abiotico o biotico)
Esempio 1:
• Esposizione all’ozono determina un aumento di
H2O2, che stimola la produzione di acido
salicilico (SA)
•Ciò determina una induzione di alcuni geni
coinvolti nella risposta di difesa ai patogeni:
e.g. fitoalessine, lignina, callosio, estensina,
proteine PR, PAL ecc.
Esempio 2:
Osmotina
• Proteina basica abbondante
• Scoperta nelle cellule di tabacco che erano
state acclimatate a 428 mM NaCl
• Dimensioni molecolari di 26-kDa
• Localizzata nel vacuolo
• Classificata come pathogenesis-related
(PR) protein (proteina correlata con la
patogenesi, classe 5 – simile alla taumatina)
Modello per l’azione antifungina dell’osmotina
Osmotina
• La trascrizione di un gene di osmotina è
indotto da almeno 10 segnali:
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
ABA
Etilene
Auxina
Infezione da TMV
Infezione fungina
Ferimento
Salinità
Carenza idrica
Freddo
UV
Esempio 3:
Famiglie geniche che possono contenere membri che
coinvolti in stress di tipo abiotico o biotico
•Es. Proteina anticongelamento (AFP) e proteine di
difesa (PGIP) hanno struttura simile: identità 50%
e struttura modulare ricca in residui di leucina
