Il SAC, sistema di controllo nella
divisione cellulare
IFOM per la scuola
Lo Studente Ricercatore 2011
Villani Yuri
Liceo Scientifico Tecnologico Chimico-Biologico
IIS A. Maserati - Voghera(PV)
Gruppo: Biologia cellulare computazionale
Tutor: Luca Mariani, Elena Chiroli
La scelta del lievito per lo studio
Perché scegliere il lievito?
Sceglierlo ha diversi vantaggi:
1) Ciclo cellulare molto veloce;
2) Facilità di mantenimento;
3) Dimensioni molto ridotte, quindi
colture poco ingombranti;
4) Genoma conosciuto;
5) Facilità nel bioingegnerizzarlo;
6) Nessun problema etico.
Tratto da: www.atlantebotanica.unito.it
Il ciclo cellulare
Tratto da: www.torinoscienza.it
Il ciclo cellulare comprende
tutta la vita di una cellula.
Alcuni passaggi sono critici
per il successo della
divisione. Il primo è la
duplicazione del DNA in
fase S(ci è utile per le
analisi al FACS perché in
base alla quantità di DNA
capiamo qual è la fase
cellulare, il secondo è la
connessione microtubulicentromero in fase G2.
Un po' di teoria: la mitosi
Processo schematizzato
della mitosi
La mitosi è il processo che
permette alla cellula singola la
divisione in due cellule figlie. È
una fase delicata perché qui
avviene la separazione dei
cromatidi fratelli, con un'alta
probabilità di incorrere in errori
che potrebbero portare a
mutazioni nel corredo genetico.
Tratto e modificato da
www.camperperlascienza.ibc.cnr.it
Prima e dopo il punto critico:
metafase e anafase
Nella metafase avviene il
collegamento tra i
microtubuli e i centromeri.
Centrosoma
Tratto da: www.bassilo.it
In anafase, i centrosomi creano
una tensione sui microtubuli che
fa separare e migrare nei
rispettivi poli i cromatidi fratelli.
Tratto da:www.bassilo.it
T
Cos'è il SAC?
Il SAC(Spindle Assembly Checkpoint) è un meccanismo
che permette alla cellula di arrestare la divisione prima
dell'anafase in caso di anomalie nella struttura del fuso
mitotico o, in assenza di errori, fino a che tutti i microtubuli
si sono uniti correttamente ai centromeri.
Tratto da:
www.mcb.harvard.edu
Perché avviene l'arresto?
L'arresto in metafase
avviene nel caso in cui
un microtubulo non è
correttamente legato al
centromero.
In mancanza dell'arresto,
durante la migrazione dei
cromatidi verso i poli, il
microtubulo opposto a
quello non collegato
trainerebbe due cromatidi
al posto di uno.
Tratto e modificato da: www.fulviobaldanza.it
Come avviene l'arresto?
La mancata connessione
dei microtubuli con i
centromeri, induce la
formazione di un
complesso con Mad2
scatenando una cascata di
eventi che portano alla
inibizione della separasi e
al blocco del fuso mitotico
impedendo così la
divisione dei cromatidi in
modo errato.
Tratto da: www.nationwidechildrens.org
In laboratorio
Ricreare il SAC in laboratorio ci permette di
studiarlo.
Come attivarlo?
2 metodi principali:
Sovraespressione della proteina Mad2
grazie ad una inserzione Gal-Mad2.
Distruggendo fisicamente il fuso mitotico
con il nocodazolo.
Noi utilizzeremo la sovraespressione di
Mad2.
Inserzione Gal-Mad2
Il gene Gal-Mad2 viene inserito per
trasformazione all'interno del corredo
genetico del lievito. Permette alla
cellula, in presenza di galattosio(Gal),
una produzione di Mad2 circa 20
volte quella naturale. Si possono fare
più inserzioni(Gal-Mad2 1x, 2x, 3x,
cioè 20, 40, 60 volte l'endogeno).
Primo passo: la coltura
Si prepara una coltura
con il ceppo che ci
interessa e dopo il rilascio
da alpha-factor(un
ormone che ci permette di
avere le cellule tutte alla
stessa fase del ciclo)si
tratta con sostanze
diverse in base allo studio
da fare e si prendono
campioni ad intervalli
regolari.
Cellule ciclanti, prima del
trattamento con alpha-factor.
Ceppo Gal-Mad2 in galattosio
Dopo il rilascio, nella
coltura si aggiunge
del galattosio.
Questo zucchero
attiva il promotore
Gal-Mad2 che
sovraesprime la
produzione della
proteina Mad2
causando l'arresto.
Cellule bloccate in metafase,
si può dedurre dalla
grandezza delle gemme.
Il FACS
Il FACS è uno strumento che permette la
misurazione della quantità di DNA in una cellula.
Come? I campioni prelevati vanno trattati con
ioduro propidio che si lega al DNA. Il propidio
emana una fluorescenza letta dal FACS. In base
alla quantità di fluorescenza rilevata si capisce
se la cellula è in fase G1 oppure in fase G2. Se
tutte le cellule di un campione sono in fase G2
vuol dire che siamo riusciti a creare un blocco
efficace.
Leggere i dati del FACS
N° di
Il FACS invia
al computer
collegato dei
grafici che sta
al ricercatore
interpretare.
cellule
Quantità di DNA rilevata; fase
G1 o fase G2. Se va oltre si è
in presenza di cellule lisate,
cioè distrutte.
Risultati dell'esperimento
Nel caso di 3 inserzioni di
Gal-Mad2 il blocco dura per
oltre 7 ore.
In ultimo ma non meno importante
Ma alla fine, cosa serve conoscere il SAC
alla ricerca sul cancro? Conoscere in modo
perfetto il checkpoint, ci farebbe capire
come alcune cellule possano proliferare in
modo anomalo, quindi cercare soluzioni più
mirate in una eventuale nuova terapia.
