Diagnostica in ematologia
Diagnostica biochimico-clinica
Lezione 13
Sangue
Trasporto O2
Trasporto materiali nutritivi
Trasporto materiali di rifiuto
Trasporto ioni
Trasporto di cellule deputate alla difesa dell’organismo
Ematopoiesi
Elementi corpuscolati del sangue
CELLULE EMATICHE
eritrocita
GRANULOCITI
monocita
DURATA IN
CIRCOLO
FUNZIONE
120 giorni
trasporto di ossigeno
3 giorni
difesa dell’organismo,
sorveglianza
immunitaria
(precursore dei
macrofagi dei tessuti)
7 ore
difesa dell’organismo
?
difesa dell’organismo,
contro i parassiti,
allergie
?
infiammazione e
allergia
7-8 giorni
coagulazione
del sangue
forse qualche anno
immunità cellulare
?
difese anticorpali
(precursore delle
plasmacellule)
neutrofilo
eosinofilo
basofilo
piastrine
linfocita T
linfocita B
Sangue
Esame emocromocitometrico
Conta globuli rossi (RBC)
Conta globuli bianchi (WBC)
Conta piastrine (PLTS)
Dosaggio Emoglobina (Hb)
Ematocrito (Ht o PCV)
Formula leucocitaria (Neutrofili, Eosinofili, Basofili, Linfociti, Monociti)
Ematocrito (Ht% o PCV “Packed cell volume”)
Esprime la % del volume degli elementi corpuscolati sul volume totale di sangue
•
•
Uomini 0.37 – 0.54 L/L
Donne 0.33 – 0.47 L/L
Ematocrito: metodi di misura
Metodi di misura
MACROMETODO
• Capillari di Wintrobe (2.5mm x 110mm)
• Centrifuga x 30’ a 3000 rpm
MICROMETODO
• Capillari eparinati (1mm x 75mm)
• Centrifuga x 5’ a 10.000 rpm
MISURA CON STRUMENTI ELETTRONICI
Siero
Anticoagulanti
EDTA tripotassico (1.5 mg/mL)
Eparina
Coagulo
Sangue in toto
Emoglobina Hb (g/dL – g/L – mmol/L)
Metodo misura: cianuro di K e ferricianuro di K (reagente di Drabkin)→
cianmetaemoglobina → ABS 540 nm
Valori normali
110 g/L
120-160 g/L
110 g/L
130-170 g/L
bambini
donne
donne in gravidanza
uomini
Globuli rossi
Valori normali
4.6 – 5.8 x 1012 /L uomini
4.2 – 5 x 1012 /L donne
Indici ematici
MCV: Volume Corpuscolare Medio (Ht/N°GR)
Valori di riferimento
83-97 fL
MCH: Quantità media Hb nei GR (Hb/N° GR)
27-31 pg
MCHC: [Hb] eritrocitaria media (Hb/Ht% X 100)
∼33%
MPV: Volume Medio Piastrine
MCV
MCH
MCHC
Anemie
Microcitiche
Normocitiche
Macrocitiche
Anemie
Ipocromiche
Ipercromiche
Inutile ai fini
diagnostici
Globuli rossi
Metodi di misura
Metodo dell’impedenza / Metodi ottici
Metodi manuali → Hb/Ht/n.GR
Calcolo Indici Ematici→
→ MCH/MCV/MCHC
Metodi strumentali elettronici → Hb/n.GR/MCV/MCHC
Calcolo di MCH ed Ht=MCV x n.GR
RDW (Red cell distribution width)→
→ Eterogeneità da anisocitosi (16%)
HDW (Hemoglobin distribution widht)→
→ Eterogeneità da anisocromia (29%)
Reticolociti (0.5 – 1.5%): Globuli rossi immaturi, i cui ribosomi reagiscono con alcuni
coloranti (Blu di cresile/Blu di metilene) precipitando a formare granuli o filamenti
Globuli bianchi
Valori normali
4.3 – 10 x 109 /L adulti
18 ± 8 x 109 /L neonati
Neutrofili 35-71%
Linfociti 20-53%
Monociti 1-9%
Eosinofili 0.5-8%
Basofili 0-2%
Globuli bianchi
Neutrofili
Basofili
Linfociti
Eosinofili
Monociti
Piastrine
Realizzazione di uno striscio di sangue
Goccia di
sangue
AVVICINAMENTO
ADESIONE
AVANZAMENTO
Striscio di sangue colorato con May-Grünwald-Giemsa
La colorazione May-Grunwald Giemsa è una colorazione differenziale per differenziare i
globuli bianchi. In questa colorazione, si usano gli stessi coloranti, ma con tempi e
concentrazioni diverse della colorazione di Wright. I coloranti acidi, presenti in questa
colorazione, colorano la parte basica della cellula, mentre i coloranti basici colorano la parte
acida.
Il May-Grunwald è una miscela di due coloranti: eosina e blu di metilene. Il primo comporterà
una colorazione rosa/rossa, il secondo comporterà una colorazione blu/viola.
Striscio di sangue
Alterazioni degli eritrociti
Ipocromia→
→ Emazie pallide e ipocromiche, talvolta con zona centrale chiara
Anisocitosi e anisocromie→
→ Emazie di grandezza/colorazione diversa
Macrocitosi→
→ MCV>102 fl
Microcitosi→
→ MCV< 80 fl
Poichilocitosi→
→ Presenza di eritrociti a forma diversa
In condizioni fisiologiche in vitro:
diametro : 7 - 8 µm
Area superficiale : 130 - 140 µm2
volume : 90 - 100 µm3
Alterazioni degli eritrociti
Ellissocitosi→
→ Eritrocita ellittico (non ipocromico)
Leptocitosi→
→ Cellule ipocromiche sottili con diametro normale ed MCV diminuito
Schistocitosi→
→ Eritrociti frammentati piccoli di forma triangolare
Sferocitosi→
→ Presenza di eritrociti piccoli “a palla” non ipocromici con diametro e
spessore ridotti
Alterazioni degli eritrociti
Target cells→
→ Cellule con l’aspetto di “bersaglio a cerchi”
Acantocitosi→
→ Emazie dotate di 5-10 spicole di varia lunghezza e
numero,irregolarmente distribuite→
→Alterato metabolismo lipidico
Alterazioni degli eritrociti
Drepanocitosi→
→ Forma a falce, soprattutto in condizioni di ipossia
Alterazioni degli eritrociti
Anemia megaloblastica
Carenza di ferro
Sferocitosi
ereditaria
Talassemia
Anemia
falciforme
Ellissocitosi
ereditaria
Acantocitosi
Anemie
Riduzione della quantità totale di emoglobina circolante negli eritrociti del
sangue periferico
Per convenzione si considera la concentrazione di Hb supponendo che il volume
ematico rimanga costante. Ciò non avviene in alcune situazioni cliniche:
Emorragia acuta
Gravidanza (> volume plasmatico)
Ritenzione idrica
Anemia → Valori di emoglobina inferiori a:
11 g/dL
12 g/dL
11 g/dL
13 g/dL
Bambini
Donne
Donne in gravidanza
Maschi
Anemie da carenza di Ferro:
↓ Ferritina sierica <12 ng/mL
↑ Transferrina (TIBC)
↓ Sideremia
Emoglobinopenia
Struttura dell’emoglobina
Emoglobina
EMBRIONALI ξ (Tipo α)
ε e γ (Tipo β)
Gower 1 ξ2 ε2
Gower 2 α2 ε2
Portland ξ2 γ2
FETALE
α
e
γ
HbF α2 γ2
NEONATO
α β γ δ
HbA
HbA2
HbF
ADULTA
α2 β2
α2 δ2
α2 γ2
20%
0,5%
80%
α2 β2
α2 δ2
α2 γ2
96-98%
1,8-3,5%
0,2-2%
α β γ δ
HbA
HbA2
HbF
Disordini genetici dell’emoglobina
TALASSEMIE→
→ Alterazioni di tipo quantitativo: sintesi alterata o soppressa di
catene globiniche normali
EMOGLOBINOPATIE→
→ Alterazioni di tipo qualitativo della composizione per
sostituzione, perdita o aggiunta di aminoacidi in una delle catene globiniche
Catene β → 1 Gene su Cromosoma 11 (Aploide)
Catene α → 2 Geni su Cromosoma 16 (Aploide)
Separazione delle emoglobine mediante HPLC
Emoglobinopatie
Alterazioni geneticamente determinate della molecola di emoglobina
(Anemie ipocromiche micronormocitiche di tipo emolitico)
400-500 varianti→
→1/3 associato a manifestazioni cliniche
CAUSE:
Sostituzione amminoacidica (più frequenti nelle catene β)
Aggiunta di amminoacidi all’N-terminale
Delezione di uno o più amminoacidi
Crossing-over tra cromosomi omologhi (Hb Lepore)
Hb S - Hb E - Hb C- Hb M-Emoglobine instabili
Hb S
Hb C
Hb E
Hb M
Gluβ
β 6→
→Val
Gluβ
β 6→
→Lys
Gluβ
β 26→
→Lys
6Varianti
Modifica della carica elettrica della globina-Emazie rigide-Falcemia
Emazie trasformate in eritrociti a bersaglio o microsferociti
Diminuita sintesi di catene globiniche
Ossidazione del Fe dell’eme (Metaemoglobina)
EMOGLOBINE INSTABILI (∼
∼100 varianti): Alterazioni strutturali a livello molecolare che
compromettono la stabilità e la solubilità della molecola →Precipitati intracellulari per la
presenza di Hb denaturata (corpi di Heinz)
Corpi di Heinz
Separazione delle emoglobine mediante elettroforesi
Elettroforesi su Acetato di cellulosa a pH 8,6
Elettroforesi su Agar a pH 6,2
Elettrofocalizzazione
α Talassemie
α°: Sintesi catene α completamente soppressa
α+: Sintesi ridotta catene α
αα / -α- / α-
TALASSEMIA MINOR Hb Bart (γγ4) alla nascita (5-15%)
Adulti HbA2 normale o ↓ α/β
β = 0.7
-- / --
IDROPE FETALE
PLACENTARE
α- / αα
PORTATORE SILENTE Hb Bart 1-2%
-- / α-
MALATTIA HbH
Incompatibile con la vita
Hb Bart 80%
Feto e Neonato Hb Bart (γγ4) 20-40%.
Adulto HbH (β
β4) 5-30%
HbA 70-90%
HbA2 1-1.5%
Hb ↓ GR ↑
QUADRO CLINICO
Anemia microcitica
Maggiori resistenze osmotiche
HbA2 normale o ridotta (NB ≠ β talassemie)
α/β
β<1
Parametri relativi al metabolismo del Fe vicini alla normalità
β Talassemie
β° / β°:: Sintesi catene β soppressa
β+ / β+: Sintesi catene β ridotta dal 5 al 30%
HbA
HbA2
HbF
β° / β°
β
assente
N/ ↑
95%
β+ / β+
Pres.10-20%
N/ ↑
70-80%
β° / β+
presente
N/ ↑
variabile
β° / Hb Lepore
assente
assente
80%
Hb Lepore
20%
QUADRO CLINICO
HbA2 aumentata (3.5 – 7%)
Microcitosi e poliglobulia
Hb ↓
Resistenze osmotiche aumentate
DIAGNOSI TALASSEMIE ⇒ Elettroforesi Hb
Anemie
ANEMIE NORMOCITICHE
Alterazione primitiva a carico del midollo eritropoietico
ANEMIE MEGALOBLASTICHE
•Deficit di folato e vitamina B12 → Asincronia di maturazione tra citoplasma e nucleo
•Ridotta sintesi del DNA →Nucleo ridotto rispetto al citoplasma
FeSiero
TIBC
UIBC
ANEMIE MICROCITICHE
•Anemia sideropenica →Carenza di Fe
↓ Ferritina sierica
↑ Transferrina (TIBC)
↓ Sideremia
•Anemia delle malattie croniche →
Fe spostato nel sistema monocitico-macrofagico
↑ Ferritina sierica
↓ Transferrina (TIBC)
↓ Sideremia
•Anemia sideroblastica →Incapacità di usare il Fe per la sintesi dell’eme
↑ Ferritina sierica
↑ Transferrina (TIBC)
↑ Sideremia
•Talassemie →Difetto di sintesi dell’Hb a livello delle catene α e/o β
Anemie
ANEMIE EMOLITICHE
Malattie in cui la vita eritrocitaria media è accorciata rispetto al normale. Si
sviluppa quando l’eritropoiesi non è sufficiente a compensare l’emolisi.
CAUSE DELLA RIDOTTA SOPRAVVIVENZA
FATTORI LEGATI ALL’ERITROCITO
(Anemie emolitiche intraglobulari)
FATTORI ESTERNI DANNOSI ALL’ERITROCITO
(Anemie emolitiche extraglobulari)
Anemie
FATTORI LEGATI ALL’ERITROCITO (Anemie emolitiche intraglobulari)
Emoglobinopatie, talassemie (Volume globulare ridotto)
Anemia da deficit enzimatico: G6PD-PK (Deficit enzimatico)
Sferocitosi, ellissocitosi, acantocitosi (Difetti di membrana eritrocitaria)
Quadro clinico
Conta reticolocitaria aumentata
Iperbilirubinemia di tipo indiretto (>catabolismo dell’eme)
Aumento urobilinogeno urinario e fecale
Ipersideremia
Riduzione Aptoglobina
Presenza di metalbumina (Hb si lega all’albumina)
Anemie
FATTORI ESTERNI DANNOSI ALL’ERITROCITO (Anemie emolitiche extraglobulari)
Immunologiche
• Alloanticorpi
• Anemie autoimmuni: Presenza di anticorpi anti-eritrociti (Autoanticorpi)
Non immunologiche
• Anemie emolitiche da cause cardiache
• Anemie emolitiche da marcia
• Anemie emolitiche nelle infezioni (Plasmodio della malaria, veleno dei serpenti,
punture di insetto)
