Analisi genetiche di accertamento parentale

Analisi genetiche di
accertamento parentale
Gruppo di Lavoro SIGU
Genetica Forense
Chiara Barone, Sebastiano Bianca, Francesco Binni, Irene Caliendo, Piera Carta, Alessandro Civolani,
Anna D'Ambrosio, Franca Dagna Bricarelli, Francesca Delvecchio Blanco, Manuela Di Natale, Cristina Di
Stefano, Francesca Forzano, Alessio Fronduti, Emiliano Giardina, Paola Grammatico, Sara Iozzi, Ilaria
Longo, Alvaro Mesoraca, Giuseppe Novelli, Anna Lucia Nutini, Giulio Piluso, Ilenia Pietrangeli, Nunzia
Piumelli, Barbara Raso, Nicoletta Resta, Carlo Sepe, Katharina Steindl, Isabella Torrente, Francesca
Torricelli, Sara Zanchetti, Stefania Zampatti
Analisi genetiche di accertamento parentale
Premessa al documento
Il presente documento intende dichiarare la posizione della SIGU in
merito agli accertamenti genetici della parentela. Questo testo si è reso
necessario per il mutato contesto scientifico-tecnologico, economico e
sociale, per la domanda crescente di questo tipo di accertamenti e per
l’eterogeneità tecnica e qualitativa che caratterizza l’offerta. Si intende in
tal modo offrire un testo condiviso utile per uniformare l’accettazione, le
procedure, l’interpretazione e la refertazione di tali test genetici.
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Analisi genetiche di accertamento parentale
Glossario
•
Marcatore genetico: una qualsiasi sequenza di DNA a localizzazione nota in grado di
discriminare i cromosomi (e quindi gli individui) gli uni dagli altri.
•
Aplotipo: la combinazione di varianti alleliche lungo un cromosoma o segmento
cromosomico.
•
Mutazione de novo: evento mutazionale avvenuto durante la meiosi considerata. Può essere
di derivazione materna o paterna.
•
Dichiarazione giudiziale di paternità: azione giudiziale con la quale si vuole ottenere un
provvedimento giurisdizionale che abbia gli effetti del riconoscimento di paternità
•
Accertamento di parentela: analisi di segregazione mediante marcatori genetici
ipervariabili che permette di stabilire rapporti di parentela tra due o più soggetti;
•
Conferma/Esclusione di paternità/maternità: risultato analitico del test di accertamento
di parentela, quando il rapporto indagato è padre/figlio o madre/figlio.
•
Rapporto di verosimiglianza: rapporto tra due probabilità condizionate, calcolate a partire
da due ipotesi mutualmente esclusive. In particolare, nel test di accertamento di parentela, il
rapporto di verosimiglianza è il rapporto tra la probabilità che il soggetto indice (es. figlio)
consegua il profilo osservato, posto che il soggetto in esame (es: presunto padre) abbia il
rapporto di parentela richiesto (es: paternità)(H1), e la stessa probabilità calcolata
nell'ipotesi che il rapporto di parentela non sussista (H0).
•
Indice di paternità: è il rapporto di verosimiglianza applicato al test di paternità, viene
calcolato per ogni marcatore analizzato
•
Identificazione dei soggetti: verifica l’identità dichiarata dal soggetto, viene effettuata
mediante controllo e registrazione di un documento di identità in corso di validità (carta di
identità o equipollenti secondo il DPR 445/2000 art.35 comma2)
•
Potestà genitoriale: è la facoltà giuridica di agire per la tutela di interessi non direttamente
propri; è l’autorità che possiedono i genitori sui figli legittimi, legittimati, adottati e naturali
(definita e regolata dagli artt. 316 e 155 c.c.).
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1. Accettazione dei campioni
I laboratori devono acquisire il prelievo e garantire che l’utilizzo dei campioni biologici e il
trattamento dei dati genetici si svolgano secondo modalità volte a prevenire la violazione dei diritti,
delle libertà fondamentali e della dignità degli interessati. In particolare il campione è prelevato da
un incaricato del laboratorio o da un responsabile da esso designato ovvero, in caso di
ricongiungimento familiare, da esercenti le professioni sanitarie appositamente incaricati dalle
rappresentanze diplomatiche o consolari o da organismi internazionali ritenuti idonei dal Ministero
degli affari esteri. I campioni biologici prelevati ai medesimi fini possono essere trasferiti
unicamente al laboratorio designato per l'effettuazione del test sulla variabilità individuale o
all'organismo internazionale ritenuto idoneo dal Ministero degli affari esteri (aut.8/2012).
L’identificazione dei soggetti interessati deve essere garantita dall’esibizione di un documento di
identità in corso di validità. Copia di tale documentazione deve rimanere al laboratorio unitamente
al consenso informato e al referto.
Informativa e consenso informato
I trattamenti per lo svolgimento delle investigazioni difensive o per l'esercizio di un diritto in sede
giudiziaria possono essere effettuati mediante l'esecuzione di test genetici soltanto previa
informativa all'interessato.
I dati genetici trattati e i campioni biologici prelevati per l'esecuzione di test sulla variabilità
individuale ai fini dello svolgimento delle investigazioni difensive o per l'esercizio di un diritto in
un procedimento penale non possono essere utilizzati per altri fini. I dati trattati e i campioni
biologici prelevati per l'esecuzione di test genetici a fini di prevenzione, di diagnosi o di terapia nei
confronti dell'interessato o per finalità di ricerca scientifica e statistica possono essere utilizzati per
lo svolgimento delle investigazioni difensive o per l'esercizio di un diritto in un procedimento
penale, nel rispetto delle pertinenti disposizioni di legge (Autorizzazione al trattamento dei dati
genetici – GU n.3 del 4 gennaio 2013 -Gazzetta Ufficiale n. 65 del 19 marzo 2007).
Per quanto sopraesposto e normato dal Garante per la Protezione dei Dati Personali si ribadisce che
acquisire campioni anonimi, o all’insaputa dei soggetti coinvolti, per la esecuzione di test di
paternità/maternità, per quanto definiti di compatibilità genetica, è un reato penale e non vi è alcuna
modalità che renda tale comportamento legittimo [Rif. Autorizzazione al trattamento dei dati
genetici – G.U. n.3 del 4 gennaio 2013]. Allo stesso modo costituisce reato penale acquisire
campioni da minori ed eseguire test genetici per l’accertamento della parentela all’insaputa di
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Analisi genetiche di accertamento parentale
soggetti che ne esercitano la potestà genitoriale. Da quanto sopraesposto il Gruppo di Lavoro ritiene
priva di significato la distinzione tra test legali e test informativi. Qualsiasi test di accertamento di
parentela deve essere eseguito in conformità alle leggi vigenti e pertanto, per definizione, ha valore
legale, come qualsiasi altro referto di laboratorio. Il GdL suggerisce un modello di consenso
informato per uniformare anche questo tipo di documento, disponibile in allegato 1. Nel caso i
genitori esercitino la potestà genitoriale, entrambi devono autorizzare il test sul minore.
Accettazione di campioni biologici per la determinazione prenatale di rapporti di parentela
Sebbene vi sia un orientamento generale che tende a scoraggiare le richieste di
accertamento/disconoscimento di paternità in gravidanza, tale richiesta rientra nei diritti della
coppia. E’ ovviamente necessario il consenso sia della madre sia del coniuge, se in costanza di
matrimonio, o di chi ne esercita la potestà. L’orientamento generale comunque, anche in
considerazione dei tempi brevi con i quali è possibile ottenere i risultati, dovrebbe essere quello di
invitare la coppia a posticipare l’esecuzione di questi test alla nascita.
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Analisi genetiche di accertamento parentale
2. Modalità di esecuzione dell’indagine
Analisi di marcatori autosomici
L’esclusione o la conferma di rapporti di parentela deve sempre avvenire utilizzando tecniche
validate per l’uso forense (approvate dall’International Society of Forensic Genetics-ISFG). In
particolare devono essere tipizzati i marcatori genetici accettati dalla comunità scientifica in campo
forense e utilizzati nell’ambito del trattato di Prüm (ESS - European Standard Set, CODIS).
La tipizzazione dei marcatori deve avvenire mediante l’uso di kit e strumentazioni validati per tali
indagini. Si rappresenta che, sebbene esistano numerose tecniche e marcatori utili ad escludere la
relazione di parentela, allo stato attuale si ritiene indispensabile utilizzare i sistemi validati per l’uso
forense.
In accordo con quanto previsto dalla società internazionale di genetica forense, la qualità del dato
strumentale deve essere garantita dall’esecuzione obbligatoria di controlli positivi di PCR, controlli
negativi di PCR e controlli negativi di estrazione. Il Gruppo di Lavoro ritiene utile, corretto e quindi
necessario includere i risultati analitici di questi controlli nelle consulenze tecniche.
Analisi di marcatori localizzati sul cromosoma Y
L’analisi di marcatori localizzati sul cromosoma Y è consigliata a supporto dei risultati ottenuti
mediante analisi di marcatori presenti su cromosomi autosomici. Analogamente a quanto espresso
per i marcatori dei cromosomi autosomici per eseguire l’analisi dell’aplotipo del cromosoma Y,
devono essere utilizzati marcatori, strumentazioni e kit validati per l’uso forense. Resta inteso che
l’aplotipo Y non rappresenta un sistema identificativo e che pertanto non può essere utilizzato quale
esclusivo mezzo di accertamento di parentela. Particolare rilevanza assume l’analisi dell’aplotipo
del cromosoma Y nei casi di paternità deficitari e nei casi di analisi di fratellanza che verranno
discussi in seguito in apposite sezioni.
L’analisi del cromosoma Y genera, per ogni marcatore, un genotipo costituito da un singolo allele,
ad eccezione dei marcatori multicopia. L’insieme ordinato degli alleli, osservati su uno specifico
cromosoma, è definito aplotipo. In particolare, un numero di marcatori superiore o uguale a 18
definisce un aplogruppo, un numero minore di marcatori definisce un aplotipo: in conclusione, un
aplotipo di 18 marcatori costituisce un aplogruppo. Nel 1997 è stata definita una serie di marcatori
necessari per garantire “l’aplotipo minimo” per la tipizzazione del cromosoma Y (Kayser et al.
1997) che è definito dai loci: DYS19; DYS389I; DYS389II, DYS390; DYS391; DYS392; DYS393
e DYS385a/b. Nel 2003, lo U.S. Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM)
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ha raccomandato l’utilizzo di due marcatori addizionali (DYS438 e DYS439) per definire in modo
più preciso l’aplotipo minimo. In accordo con quanto previsto dalla Società Internazionale di
Genetica Forense (ISFG), la qualità del dato strumentale deve essere garantita dall’esecuzione
obbligatoria di controlli positivi di PCR, controlli negativi di PCR e controlli negativi di estrazione.
Per quanto riguarda l’esclusione, se l’aplotipo ottenuto dall’analisi del cromosoma Y del presunto
padre non coincide con quello del figlio la diagnosi di esclusione è certa (analogamente nei casi di
STRs autosomici). Si ribadisce in ogni caso l’importanza della tipizzazione dei marcatori
autosomici anche in questi casi.
Qualora venga determinata la compatibilità a tutti i loci analizzati tra l’aplotipo del cromosoma Y
del presunto padre e quello del figlio occorre considerare, oltre alla frequenza dell’aplotipo nella
popolazione di riferimento, anche la possibilità di un comune antenato di sesso maschile.
Sono disponibili in rete una serie di database che raccolgono un elevato numero di aplotipi Y e che
pertanto consentono una stima della frequenza. Il database più esteso ed utilizzato è il Y-STR
haplotype Reference Database (YHRD) (http://www.yhrd.org).
Analisi di marcatori del cromosoma X
L’analisi di marcatori localizzati sul cromosoma X può fornire indicazioni utili a supporto
dei risultati ottenuti mediante analisi di marcatori autosomici, pertanto per eseguire l’analisi del
cromosoma X devono essere utilizzati marcatori, strumentazioni e kit validati per l’uso forense.
Analogamente a quanto osservato per i marcatori localizzati sul cromosoma Y, anche i marcatori Xlinked non sono tra loro indipendenti e devono essere considerati come aplotipo. Sono noti 4 gruppi
di linkage sul cromosoma X: i marcatori all’interno dello stesso gruppo di linkage non sono
indipendenti, i marcatori appartenenti a gruppi di linkage diversi possono essere considerati
indipendenti. Per determinare la frequenza di un aplotipo del cromosoma X è pertanto necessario
moltiplicare la frequenza degli aplotipi rilevati ai diversi gruppi di linkage.
Analisi statistica
Nel caso di compatibilità tra presunto padre e figlio occorre calcolare il peso statistico di questa
osservazione. I referti privi del calcolo biostatistico sono da considerarsi incompleti. Devono
pertanto essere calcolate le probabilità dei profili genotipici osservati nelle due ipotesi alternative:
-
la probabilità nell’ipotesi che il presunto padre in esame sia il padre biologico del figlio
analizzato (H1);
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Analisi genetiche di accertamento parentale
-
la probabilità nell' ipotesi che il padre presunto non sia il padre biologico, e che quindi detta
compatibilità sia solo casuale (H0).
Il rapporto tra i due termini sopra detti, rappresenta il rapporto di verosimiglianza o Likelihood
Ratio (LR), il cui valore sarà tanto più elevato quanto più verosimile è l'ipotesi H1, cioè che il
presunto padre sia davvero il padre biologico del figlio analizzato. Questo rapporto di
verosimiglianza prende il nome di “indice di paternità” (PI – Paternity Index). L’indice di paternità
è calcolato per ogni locus sottoposto ad indagine (tabella 1). L’indice di paternità può essere inoltre
utilizzato per calcolare la probabilità complessiva di paternità (W), definita dal rapporto tra eventi
favorevoli ed eventi possibili. Assumendo per ciascuna delle due ipotesi una probabilità a priori del
50% , la probabilità di paternità è espressa da:
X
W= ____
X+Y
Dove:
•
X = (probabilità di osservare la combinazione dei profili rilevati nel caso in oggetto,
se l’uomo tipizzato è il vero padre e corrisponde alla probabilità che il presunto
padre abbia trasmesso l’allele compatibile per il locus in esame, pari a 0.5 nel caso
che l’allele compatibile nel padre sia in stato di
eterozigosi o 1 nel caso di
omozigosi; a tali valori vanno apportate le opportune correzioni in base all’assetto
genotipico materno ai loci esaminati)
•
Y = (probabilità di osservare la stessa combinazione se l’uomo tipizzato non è il
vero padre e corrisponde alla probabilità che l’allele compatibile sia stato trasmesso
da un soggetto preso a caso nella popolazione ed in termini numerici è pari alla
frequenza di quel determinato allele nella popolazione)
La formula può essere semplificata come segue:
1
W= ____
1+ Y_
X
Il rapporto Y/X viene calcolato per ogni marcatore analizzato ed i risultati sono moltiplicati fra di
loro per ottenere il rapporto complessivo.
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Analisi genetiche di accertamento parentale
Il calcolo biostatistico dell’indice di paternità è effettuato come riportato da Brenner (Brenner et al.
1994) e utilizzando i dati di frequenza relativi alla popolazione di riferimento per i soggetti
sottoposti ad indagine.
Interpretazione dei risultati
I risultati della tipizzazione di marcatori polimorfici sono riassumibili in tre scenari:
1. esclusione
2. attribuzione
3. inconclusività
1. Esclusione
Il Gruppo di Lavoro, per addivenire all’esclusione di compatibilità biologica, suggerisce un valore
di rapporto di verosimiglianza inferiore a 1:10.000 (Brenner C, 2004).
2. Attribuzione
Il Gruppo di Lavoro, per definire l’attribuzione, suggerisce un valore di rapporto di verosimiglianza
superiore a 10.000:1.
3. Inconclusività
Conseguentemente si definisce inconclusivo qualsiasi risultato che generi un rapporto di
verosimiglianza compreso tra 1:10.000 e 10.000:1.
Ove possibile si raccomanda sempre l’esecuzione dell’analisi anche sulla madre. In tal modo,
potendo identificare e quindi escludere dal calcolo l’allele di certa origine materna, è possibile
ottenere sufficienti valori di indice di paternità e disporre di un elemento di controllo addizionale.
Nei casi in cui sia impossibile disporre del DNA materno, si raccomanda di calcolare con attenzione
il valore di LR (rapporto di verosimiglianza) e valutare la necessità di estendere l’analisi ad un
numero maggiore di marcatori.
In caso di incompatibilità biologica è preferibile ripetere le analisi su un nuovo estratto.
Evento mutazionale
Il tasso di mutazione dei microsatelliti è stimato all’incirca tra 10-3 e 10-4 per locus per generazione.
L’analisi dei diversi loci utilizzati nei test di paternità suggerisce un tasso mediamente ancora più
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Analisi genetiche di accertamento parentale
elevato di circa 2 × 10-3 per meiosi (Weber and Wong, 1993; Kayser et al., 2000). Tra i fattori che
possono influenzare il tasso di mutazione ricordiamo la lunghezza delle unità ripetute, il sesso, con
un tasso di mutazione circa 5 volte più elevato nella linea germinale maschile rispetto a quella
femminile, e l’età (Brinkmann et al., 1998; Ellegren, 2000).
Mutazioni che si verificano durante la meiosi possono influenzare l'interpretazione del test di
paternità, determinando risultati discordanti per un determinato locus. Ad esempio, l’aggiunta per
slittamento di un’unità ripetuta per un dato locus determinerebbe la non corrispondenza, per quel
marcatore, tra presunto padre e figlio/a.
Per i marcatori validati per uso forense è nota la frequenza di mutazione, i cui dati sono consultabili
online
come
parte
del
Short
Tandem
Repeat
DNA
Internet
DataBase
(STRbase);
http://www.cstl.nist.gov/strbase/mutation.htm e riportati in Tabella 2 (accesso 04/02/2013).
Pertanto, è importante la valutazione della possibilità di un tale evento e la disponibilità di
procedure per gestire tale evenienza nei casi di paternità. Come suggerito nelle raccomandazioni
dell’International Society of Forensic Genetics (ISFG), la possibilità di una mutazione deve essere
presa in considerazione ogni volta che un’inconsistenza genetica è osservata (Gjertson et al., 2007).
Più in generale, il Paternity Index (PI) deve tener conto della possibilità che l’inconsistenza
genetica osservata sia giustificabile con un evento mutazionale che, generalmente, determina una
variazione di 1-2 unità ripetute rispetto all’atteso. Sono stati proposti diversi sistemi di calcolo
semplificati per una valutazione quantitativa della probabilità delle due ipotesi: paternità vs nonpaternità (Dawid et al., 2001; Brenner, 2012). A volte, si tende ad escludere la paternità se
l’inconsistenza genetica interessa almeno due loci indipendenti (criterio della cosiddetta “two
exclusion rule”), partendo dal presupposto che sia poco probabile che mutazioni in 2 loci
indipendenti si verifichino durante una meiosi. Tale criterio appare tuttavia non adeguato al numero
attuale di marcatori analizzati. In letteratura sono riportati infatti differenti casi di paternità
controversa riconducibili a mutazioni in due o più loci STR (Jacewicz et al., 2004; Balloch et al.,
2008; Sun et al., 2012), a contributo paterno, materno o di entrambi. Come precedentemente
riportato, l’esclusione della compatibilità biologica deve essere basata su calcolo biostatistico, che
tenga in considerazione anche la probabilità che possa essersi verificato un evento mutazionale.
Occorre ancora considerare la possibilità che i loci STR, utilizzati in indagini genetiche finalizzate
all’identificazione personale, possano andare incontro a mutazioni somatiche. Durante lo sviluppo
embrionale, tale evento potrebbe determinare il riconoscimento nel figlio/a di 3 distinti alleli per
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Analisi genetiche di accertamento parentale
uno stesso locus STR (Huel et al., 2007). I profili tri-allelici da mutazioni somatiche sono raramente
osservati, ma agevolmente distinguibili da profili analoghi, dipendenti da duplicazioni che
coinvolgono uno specifico locus STR, in cui l’allele soprannumerario è comunque ereditato da uno
dei due genitori (Lukka et al., 2006; Vidal and Cassar, 2008).
Infine, occorre ricordare che mutazioni puntiformi, in particolare nella regione 3’ di un primer,
possono inibirne il corretto appaiamento alla sequenza complementare durante la reazione di
amplificazione, determinando un allele nullo (allele dropout), cioè l’assenza di amplificazione di
uno dei due alleli per uno specifico locus STR che si traduce in una falsa omozigosità. Tale
evenienza è estremamente rara ma deve essere considerata e verificata. È utile estendere l’indagine
ad un pannello più ampio di marcatori STR. (Kersbergen et al., 2008; Robino et al., 2008; Mertens
et al., 2009; Deucher et al., 2010)
Analisi del DNA mitocondriale
L’analisi del DNA mitocondriale è di utilità nei casi di accertamento di maternità, per escludere i
rapporti di parentela e quale sistema alternativo nel caso in cui le indagini tradizionali non abbiano
fornito risultati accettabili e/o utili. Resta inteso che in nessun caso l’analisi del DNA mitocondriale
può essere considerata un sistema identificativo. In assenza di kit validati per la tipizzazione del
DNA mitocondriale, la qualità del dato è garantita dall’esecuzione delle analisi in accordo con le
indicazioni della Società Internazionale di Genetica Forense.
Il DNA mitocondriale presenta, in alcune regioni, un tasso di mutazione circa 10 volte superiore di
quello nucleare a causa della minore affidabilità della mtDNA polimerasi e all’assenza di
meccanismi di riparazione del DNA (particolarmente efficienti per il DNA nucleare). Queste
regioni del DNA mitocondriale sono di enorme interesse in ambito forense poiché si dimostrano
ipervariabili. La maggior parte delle variazioni di sequenza tra gli individui risiede all’interno di
due specifici segmenti contenuti all’interno di una regione chiamata D-LOOP (displacement loop)
che rappresenta una zona di controllo, non codificante. Verosimilmente la maggior parte delle
variazioni è rilevabile all’interno di questa regione poiché, non essendo codificante, non è soggetta
a pressione selettiva. I due segmenti ipervariabili e quindi di maggiore interesse forense, compresi
nella regione di controllo sono: la regione ipervariabile 1 (HV1) e la regione ipervariabile 2 (HV2).
Occasionalmente è tipizzata una terza regione (HV3) a conferma e integrazione dei risultati di HV1
e HV2. Questi segmenti mostrano una variabilità tra individui non correlati valutata tra 1 ed il 3%: 3
basi diverse ogni 100 analizzate. Tipicamente, la regione HV1 si estende dal nucleotide 16.024 al
nucleotide 16.365; HV2 si estende dal nucleotide 73 al nucleotide 340, la regione HV3 si estende
dal nucleotide 438 al nucleotide 574 (Butler J, 2012). L’analisi di queste regioni mostra, in media, 8
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Analisi genetiche di accertamento parentale
nucleotidi di differenza tra individui di origine europea e 15 nucleotidi di differenza tra individui di
origine africana (o discendenti). I laboratori che eseguono l’analisi del DNA mitocondriale devono
possedere delle strutture indipendenti dedicate a questo tipo di tipizzazione per assicurare l’assenza
di contaminazioni che, in questo caso, sono particolarmente frequenti. In letteratura sono disponibili
le sequenze degli oligonucleotidi utilizzati per l’amplificazione dei segmenti HV1, HV2 e HV3
(Butler J, 2012). In termini generali è sempre preferibile confermare i risultati in almeno due
amplificazioni indipendenti ed effettuare la lettura di entrambi i filamenti. Analogamente a quanto
osservato nel caso dei marcatori STR di cromosomi autosomici, nei casi di DNA particolarmente
degradato o in presenza di artefatti di sequenza, è consigliabile utilizzare ampliconi di piccole
dimensioni (la regione HV1, ad esempio, può essere divisa in due ampliconi).
Una volta ottenuta la sequenza del DNA mitocondriale si procede alla comparazione con la
sequenza di riferimento (CRS). Tutte le differenze osservate devono essere riportate citando la
posizione esatta del nucleotide variante seguita dalla lettera riscontrata a quel sito: per esempio
16129A indica che rispetto alla sequenza di riferimento nel nostro campione di DNA il nucleotide
in posizione 16129 è una A in luogo di una G (presente nella sequenza di Anderson). Tuttavia, può
capitare che l’analisi di sequenza dia risultati ambigui per alcuni specifici nucleotidi rendendo
impossibile stabilire la natura della base in quella specifica posizione. In tali casi, il nucleotide
ambiguo si riporta con la lettera N.
Le inserzioni di nucleotidi rispetto alla sequenza di riferimento sono riportate come segue: il
numero del nucleotide immediatamente al 5’ dell’inserzione, seguito da un punto, da un numero
corrispondente al numero di nucleotidi inseriti e dalla lettera corrispondente al/i nucleotide/i inseriti.
Ad esempio 385.1T indica l’inserzione di una T immediatamente dopo il nucleotide numero 385,
rispetto alla sequenza di riferimento (Butler J. 2012).
Le delezioni di nucleotidi sono segnate con il simbolo “D”, “d” , “del” oppure “-“seguito da un
numero corrispondente al nucleotide oggetto della delezione.
Analogamente a quanto osservato nel caso della tipizzazione del cromosoma Y, anche l’analisi del
DNA mitocondriale si avvale di specifici database per stabilire la frequenza di un aplotipo in una
determinata popolazione. Ne esistono diversi, disponibili in rete. Uno dei più diffusi è l’EMPOP
(www.empop.org).
L’interpretazione dei risultati delle sequenze mitocondriali è suggerita da specifiche
raccomandazioni SWGDAM (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods- 2003) e deve
tenere in considerazione l’eventuale presenza di eteroplasmia e la possibilità di risultati non
attendibili. In particolare, possiamo distinguere vari casi:
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Analisi genetiche di accertamento parentale
-
I caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 si dimostrano
identiche in ogni nucleotide. In tal caso non possiamo escludere che i due campioni
appartengano alla stessa persona o a persone imparentate in linea materna.
-
II caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 mostrano due o più
differenze nucleotidiche. In tal caso possiamo escludere che i due campioni appartengano
alla stessa persona o a persone imparentate in linea materna.
-
III caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 mostrano soltanto
una differenza nucleotidica. In tal caso il risultato sarà inconclusivo.
-
IV caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 si dimostrano
identiche in ogni nucleotide eccetto per una base che risulta ambigua in una delle due
sequenze. In tal caso non possiamo escludere che i due campioni appartengano alla stessa
persona o a persone imparentate in linea materna.
-
V caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 si dimostrano
identiche in ogni nucleotide eccetto per alcune basi che, in siti differenti nelle due sequenze,
abbiamo dato risultati ambigui o non-interpretabili. In tal caso non possiamo escludere che i
due campioni appartengano alla stessa persona o a persone imparentate in linea materna.
-
VI caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 si dimostrano
identiche in ogni nucleotide ma è rilevata eteroplasmia in una specifica base in una delle due
sequenze. Se una delle due basi eteroplasmiche è presente nell’altra sequenza, non possiamo
escludere che i due campioni appartengano alla stessa persona o a persone imparentate in
linea materna.
-
VII caso: due sequenze di DNA mitocondriale alle regioni HV1 e/o HV2 si dimostrano
identiche in ogni nucleotide ed è rilevata eteroplasmia allo stesso sito, in entrambe le
sequenze. In tal caso non possiamo escludere che i due campioni appartengano alla stessa
persona o a persone imparentate in linea materna.
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Analisi genetiche di accertamento parentale
Analisi indirette
Laddove possibile, è sempre meglio prevedere l’analisi del DNA dei soggetti coinvolti. Tuttavia è
possibile definire alcuni rapporti di parentela anche mediante analisi indirette. Analogamente a
quanto osservato per le analisi dirette, si suggerisce che la conferma o esclusione del rapporto di
parentela debba essere definito attraverso i valori di LR pari a 10000: 1 o 1:10000 rispettivamente.
Refertazione
Il GdL suggerisce un modello unico di referto, disponibile in allegato 2. In ogni caso, le
informazioni minime da includere nel referto sono:
1.
denominazione dell’indagine;
2.
identificazione completa del laboratorio che ha eseguito l’analisi (ospedale/istituto, direttore
o responsabile del servizio, indirizzo, telefono, fax, e-mail, sito web, certificazioni);
3.
Anagrafica dell’utente e tracciabilità
3.1 Identificazione delle persone che si sono sottoposte ad indagine: nome, cognome, data e
luogo di nascita, tipo e numero di documento utilizzato per l’identificazione
3.2 Materiale biologico analizzato: sangue periferico, tampone buccale, ecc.
3.3 Data di prelievo
3.4 Data di arrivo e di accettazione del campione in laboratorio (se diverse dalla data di
prelievo)
4. Descrizione del test eseguito:
4.1 Analisi eseguita e marcatori analizzati
4.2 Indicazione dei kit commerciali utilizzati
4.3 Popolazione assunta quale riferimento se utilizzata
5. Risultato:
5.1 Elenco dei genotipi a tutti i loci analizzati
5.2 Copia degli elettroferogrammi (suggerito)
6. Interpretazione:
6.1 Risultato del test in termini di compatibilità o esclusione di compatibilità.
6.2 In caso di compatibilità riportare l’indice di paternità e la probabilità di paternità
corredato di analisi statistica specifica ed eventuali limiti dell’analisi
7. Validazione:
7.1 Nome, funzione e firma o una forma di identificazione equivalente della persona che
valida il referto
7.2 la data in cui è stato redatto il referto
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Analisi genetiche di accertamento parentale
8. Certificazioni del laboratorio, partecipazione e superamento dei Controlli Esterni di Qualità
(CEQ).
9. È possibile inoltre prevedere, ove necessario, un commento descrittivo dei risultati.
Test ottenuti da strutture terze
Quando il referto contiene risultati analitici ottenuti da altre strutture, questi risultati devono essere
indicati chiaramente. La struttura terza deve comunicare i risultati alla struttura refertante con
metodi documentati e che ne permettano la tracciabilità.
Metodi di consegna del referto
Secondo quanto definito dal Garante della Privacy (aut. 8/2012), fermo restando quanto previsto
dall'art. 84 del Codice, i dati genetici devono essere resi noti di regola direttamente all'interessato o
a persone diverse dal diretto interessato sulla base di una delega scritta di quest'ultimo, adottando
ogni mezzo idoneo a prevenire la conoscenza non autorizzata da parte di soggetti anche
compresenti. La comunicazione nelle mani di un delegato dell'interessato è eseguita in plico chiuso.
Devono essere informati del risultato tutti i soggetti che hanno fornito il consenso all’analisi e
devono essere fornite esaurienti informazioni relative ai risultati e alle conseguenze derivanti dal
test.
I dati genetici raccolti a fini di ricongiungimento familiare possono essere comunicati unicamente
alle rappresentanze diplomatiche o consolari competenti all'esame della documentazione prodotta
dall'interessato o all'organismo internazionale ritenuto idoneo dal Ministero degli affari esteri cui
questi si sia rivolto.
Materiali supplementari
Gli allegati 1 e 2 rappresentano rispettivamente il consenso informato e il referto unificato, che il
gruppo di lavoro suggerisce di adottare al fine di uniformare i laboratori che conducono indagini di
accertamento parentale.
15
Analisi genetiche di accertamento parentale
Tabella 1
Analisi di paternità: Paternity Index
Figlio
Madre
Presunto padre
Sistema co-dominante
q
pq
q
1/q
q
p
q
impossibile
pq
p o pr
q
1/q
q
q
q
1/q
pq
p o pr o ps
qr (o pq)
1/(2q)
q
p
qr
impossibile
q
pq
qr (o pq)
1/(2q)
q
q
qr
1/(2q)
pq
pq
pq
1/(p+q)
pq
pq
q
1/(p+q)
pq
pq
qr
1/(2p+2q)
q
pq
r
0
q
q
r
0
q
p
r
impossibile
q
Madre non testata
q
1/q
pq
Madre non testata
q
1/(2q)
q
Madre non testata
qr
1/(2q)
pq
Madre non testata
pq
(p+q)/(4pq)
pq
Madre non testata
qr
1/(4q)
q
Madre non testata
r
0
16
Analisi genetiche di accertamento parentale
Tabella 2
Mutazioni osservate nei loci STR nel corso di test di paternità*
Sistemi
STR
Meiosi Materne
(%)
CSF1PO
95/304,307 (0.03)
FGA
205/408,230
(0.05)
31/327,172
(0.009)
18/400,061
(0.004)
184/564,398
(0.03)
60/405,452
(0.015)
111/451,736
(0.025)
59/440,562
(0.013)
96/409,869 (0.02)
TH01
TPOX
VWA
D3S1358
D5S818
D7S820
D8S1179
Penta D
192/482,136
(0.04)
129/467,774
(0.03)
186/296,244
(0.06)
464/435,388
(0.11)
12/18,701 (0.06)
Penta E
29/44,311 (0.065)
D2S1338
15/72,830 (0.021)
D19S433
38/70,001 (0.05)
SE33
0/330 (<0.30)
D13S317
D16S539
D18S51
D21S11
Meiosi
Paterne
(%)
982/643,118
(0.15)
2,210/692,776
(0.32)
41/452,382
(0.009)
54/457,420
(0.012)
1,482/873,547
(0.17)
713/558,836
(0.13)
763/655,603
(0.12)
745/644,743
(0.12)
779/489,968
(0.16)
881/621,146
(0.14)
540/494,465
(0.11)
1,094/494,098
(0.22)
772/526,708
(0.15)
21/22,501
(0.09)
75/55,719
(0.135)
157/152,310
(0.10)
78/103,489
(0.075)
330/51,610
(0.64)
Entrambe le
mutazioni
Numero totale
di mutazioni
Tasso di
mutazione
410
1,487/947,425
0.16%
710
3,125/1,101,006
0.28%
28
100/779,554
0.01%
28
100/857,481
0.01%
814
2,480/1,437,945
0.17%
379
1,152/964,288
0.12%
385
1,259/1,107,339
0.11%
285
1,089/1,085,305
0.10%
364
1,239/899,837
0.14%
485
1,558/1,103,282
0.14%
372
1,041/962,239
0.11%
466
1,746/790,342
0.22%
580
1,816/962,096
0.19%
24
57/41,202
0.14%
59
163/100,030
0.16%
90
262/225,140
0.12%
71
187/173,490
0.11%
Non riportato
330/51,940
0.64%
*dati estratti da http://www.cstl.nist.gov/strbase/ (accesso febbraio 2013)
17
Analisi genetiche di accertamento parentale
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19
SPAZIO PER INTESTAZIONE
INFORMATIVA AI SENSI DELL'ART. 13 DEL D. LGS. 196/2003
Ai sensi dell'art. 13 del d. lgs. 196/03, ed in relazione ai dati personali che La riguardano, La informiamo:
1. Che il trattamento dei suoi dati personali ha lo scopo di consentire al (denominazione ente/struttura) di
svolgere indagini genetiche su campioni e materiale biologico.
2. Il trattamento è effettuato anche con l'ausilio di mezzi elettronici o comunque automatizzati e adottando
misure idonee a garantire la sicurezza e la riservatezza dei dati personali. E’ svolto direttamente dal
(nominativo e qualifica del responsabile del laboratorio/struttura) quale “titolare” del trattamento dei dati
personali.
3. Il conferimento dei dati personali è facoltativo. Il mancato conferimento degli stessi comporta
l'impossibilità di svolgere la predetta attività.
4. I dati personali non sono soggetti a diffusione e trasferimento all'esterno.
5. I dati personali possono essere comunicati al solo soggetto interessato.
6. Le precisiamo che oltre ai dati definiti dalla legge “comuni”, Lei ci fornisce anche dati che l’art. 37 del
d. lgs. 196/03 definisce “sensibili” e, in particolare, “dati genetici” (autorizzazione al trattamento dei dati
genetici GU n.3 del 4 Gennaio 2013)
7. L'art. 7 d. lgs. 196/03 conferisce all'interessato l'esercizio di specifici diritti, tra cui quelli di ottenere
dal titolare la conferma dell'esistenza o meno di propri dati personali e la loro messa a disposizione in
forma intellegibile; di avere conoscenza dell'origine dei dati, nonché della logica e della finalità su cui si
basa il trattamento; di ottenere la cancellazione, la trasformazione in forma anonima o il blocco dei dati
trattati in violazione di legge, nonché l'aggiornamento, la rettificazione o, se vi è interesse, l'integrazione
dei dati; di opporsi, per motivi legittimi, al trattamento stesso.
8. Titolare del trattamento è (denominazione ente/struttura). Responsabile del trattamento dei dati
personali è il (nominativo e qualifica del responsabile del laboratorio/struttura).
Firma dell’interessato : _____________________________ (per presa visione) Data: ___/___/______
Riempiere il modulo in tutte le sue parti in maniera chiara e leggibile (SCRIVERE IN STAMPATELLO).
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SPAZIO PER INTESTAZIONE
CONSENSO INFORMATO AL TRATTAMENTO DEI DATI, ALLA RACCOLTA E CONSERVAZIONE DI MATERIALE BIOLOGICO ED
AUTORIZZAZIONE ALL’INDAGINE PER L’ACCERTAMENTO DI PARENTELA
Il/la sottoscritto/a .................................………………............................................…….………..................
nato/a a .....................................…….…………….………......
Prov ..........
il :....... /....../..…….......
residente in: ...........................................……….…................................ Prov …...... CAP.……….....
Via: ............……………........................…………….…....................... n°…….
Tel (...............) ……........................... Codice Fiscale …………………………………………………….
identificato mediante il documento  carta d’identità  passaporto  patente di guida n:………………...
rilasciato da  comune questura  prefettura di ……………………………..
il :....... /....../..…….......
la cui fotocopia si allega al presente documento (allegato n: ….)
 Padre legale di ……………………………………………………………………………………………
 Padre presunto di …………………………………………………………………………………………
 Madre di ………………………………………………………………………………………………….
 Figlio/a di ………………………………………………………………………………………………...
 Altro (specificare) ...……………………………………………………………………………………...
• Dopo aver letto e sottoscritto l’informativa sulla privacy, liberamente decide di:
 DARE il consenso  NEGARE il consenso
al trattamento dei dati “comuni” e “sensibili” che ritiene di fornire.
• Dichiara inoltre, di essere stato adeguatamente informato da parte del personale sanitario del
Laboratorio e di aver compreso le finalità del test che si accinge ad eseguire ed il significato dei
risultati ottenibili per se stesso e per la sua famiglia.
• Dichiara inoltre, sotto la sua responsabilità di  NON AVER  AVER ricevuto trasfusioni negli
ultimi 3 mesi o trapianti di midollo.
• Dopo essere stato/a informato/a che:
- saranno garantiti l’anonimato e la riservatezza sulla provenienza del campione e sulle relative
indagini;
- il materiale biologico non verrà utilizzato a fini di lucro;
- la (denominazione ente/struttura) non si ritiene responsabile per eventuali danni e incidenti che
possono verificarsi sui campioni conservati;
DICHIARA di:
AUTORIZZARE
 NON AUTORIZZARE
il prelievo e la conservazione, limitatamente all’esecuzione dell’indagine, presso il (denominazione
laboratorio/struttura) del seguente materiale biologico:
 prelievo ematico tampone buccale  altro (……………………………) appartenente a se stesso
(documentazione di provenienza allegata: ...................................................................).
All’uopo fornisco il consenso al suddetto laboratorio per l’espletamento dell’esame.
Data ....................................
Firma.......................................................................
Riempiere il modulo in tutte le sue parti in maniera chiara e leggibile (SCRIVERE IN STAMPATELLO).
Pagina 2 di 3
SPAZIO PER INTESTAZIONE
AUTORIZZAZIONE ALL’INDAGINE SU MINORE PER L’ACCERTAMENTO DI PARENTELA
(DEVE ESSERE COMPILATO DA TUTTI COLORO CHE ESERCITANO LA POTESTÀ GENITORIALE)
Autorizzo inoltre, in qualità di esercente la patria potestà, il (denominazione laboratorio/struttura) al
prelievo ed alla conservazione, limitatamente all’esecuzione dell’indagine, del seguente materiale
biologico:
 prelievo ematico tampone buccale  altro (……………………………) appartenente al minore
(documentazione di provenienza allegata: ...................................................................).
Cognome: .................................………………. Nome: ..........................................…….………..................
nato/a a .....................................…….…………….………......
Prov ..........
il :....... /....../..…….......
di cui il sottoscritto/a _Nome - Cognome____è  padre madre  tutore legale.
All’uopo fornisco il consenso al suddetto laboratorio per l’espletamento dell’esame.
Data ....................................
Firma.......................................................................
Ai fini dell’identificazione del minore viene presentato ed allegato in copia al presente documento
(allegato n: ....):
 carta d’identità  passaporto n:………………... rilasciato da  comune questura di ……………….
il :....... /....../..…….......
Certificato di nascita
Stato di famiglia
Atto notorio
Informato/a sui diritti e sui limiti di cui al D.lgs 196/2003 (codice in materia di protezione dei dati
personali) esprimo il mio consenso ed autorizzo il (denominazione laboratorio/struttura) ad acquisire, ai
soli fini identificativi, una foto del minore che si allega al presente documento (allegato n: ….).
Data ....................................
Firma.......................................................................
Riempiere il modulo in tutte le sue parti in maniera chiara e leggibile (SCRIVERE IN STAMPATELLO).
Pagina 3 di 3
LOGO LABORATORIO
Direttore
Indirizzo, telefono, fax, e-mail, sito WEB
Certificazioni
INDAGINE DI ACCERTAMENTO DI PARENTELA
ANAGRAFICA E TRACCIABILITA’
Soggetto 1: presunto padre
Cognome ____________________________________ Nome _____________________________________
Data di Nascita ___________________Luogo di nascita __________________________________________
Documento di identità: tipo _________________ Numero ________________________________________
Data di accettazione ______________ Codice Lab: ______________________________________________
Materiale biologico prelevato _______________________________________________________________
Soggetto 2: madre
Cognome ____________________________________ Nome _____________________________________
Data di Nascita ___________________Luogo di nascita __________________________________________
Documento di identità: tipo _________________ Numero ________________________________________
Data di accettazione ______________ Codice Lab: ______________________________________________
Materiale biologico prelevato _______________________________________________________________
Soggetto 3: figlio
Cognome ____________________________________ Nome _____________________________________
Data di Nascita ___________________Luogo di nascita __________________________________________
Documento di identità: tipo _________________ Numero ________________________________________
Data di accettazione ______________ Codice Lab: ______________________________________________
Materiale biologico prelevato _______________________________________________________________
ANALISI ESEGUITE
Tipizzazione di polimorfismi STRs (Short Tandem Repeats) mediante amplificazione ed elettroforesi
capillare
Kit utilizzati: _____________________________________________________________________________
Elenco marcatori analizzati: _________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
Popolazione assunta quale riferimento: ________________________________________________________
Algoritmo e/o software utilizzato per l’analisi statistica: ___________________________________________
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Il Laboratorio ha partecipato ai Controlli Esterni di Qualità (____inserire specifica_____) superando il test per l’anno _________
LOGO LABORATORIO
Direttore
Indirizzo, telefono, fax, e-mail, sito WEB
Certificazioni
RISULTATO DELL’ANALISI
Marcatore
(codice Lab presunto padre)
(codice Lab figlio)
(codice Lab madre)
D8S1179
D21S11
D7S820
CSF1PO
D3S1358
THO1
D13S317
D16S539
D2S1338
D19S433
vWA
TPOX
D18S51
Amel.
D5S818
FGA
INTERPRETAZIONE
(risposta negativa) Le analisi molecolari effettuate attraverso lo studio dei polimorfismi del DNA
estratto da ___(tipo materiale biologico)___ di ____(nome presunto padre)_____, di ____(nome
madre)_____ e da __(tipo materiale biologico)___ di ____(nome figlio)_____ hanno consentito di
rilevare che ____(nome figlio)_____ non è figlio biologico di ____(nome presunto padre)_____.
(risposta positiva) Le analisi molecolari effettuate attraverso lo studio dei polimorfismi del DNA estratto
da ___(tipo materiale biologico)___ di ____(nome presunto padre)_____, di ____(nome madre)_____ e
da __(tipo materiale biologico)___ di ____(nome figlio)_____ hanno consentito di rilevare che
____(nome figlio)_____ è figlio biologico di ____(nome presunto padre)_____ con una probabilità del
___________% .
(Luogo e data)
Il Dirigente
Il Direttore
(nome e cognome)
(nome e cognome)
Pagina 2 di 2
Il Laboratorio ha partecipato ai Controlli Esterni di Qualità (____inserire specifica_____) superando il test per l’anno _________