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WHATfinder
Norovirus e Epatite A
Determinazione e Quantificazione in Real-Time PCR
In conformità alla ISO-15216
Nel parlare di sicurezza alimentare, probabilmente, la maggior parte delle persone affermerebbe
che oggi gli alimenti sono più controllati e più sicuri che in passato. Sono infatti molteplici i
programmi di controllo volti a ridurre i rischi ed i costi causati dalle malattie di origine alimentare.
Ciononostante, gli alimenti rappresentano ancora una delle principali cause di alcuni tipi di
malattie dato l'alto potenziale di contaminazione causato da batteri patogeni, virus e parassiti.
Figura 1 – Modalità di contagio di HAV e NoV
Acque reflue
Impianto di depurazione
Paziente
Contatto diretto
• Da persona a persona
• Preparazione alimenti
Irrigazione
• Piante da frutto
• Verdure
Impianti idrici
• Acqua potabile
• Acque industriali
Vittima
Molluschi Bivalvi
Il virus dell'epatite A (HAV) e il Norovirus (NoV) sono i principali responsabili di tossinfezioni
alimentari; vengono trasmessi per via oro-fecale, quindi infettano il loro ospite dopo l'ingestione
invadendo le cellule dell’epitelio intestinale e si diffondono nell’ambiente attraverso gli scarichi
dei servizi igienici. Si intuisce quindi facilmente come la trasmissione per via alimentare possa
avvenire sia per contaminazione degli alimenti con acque infette sia per manipolazione da parte
di soggetti infetti.
Verdure, frutti di bosco e frutti di mare rappresentano una delle principali cause dei focolai
epidemici: il loro alto livello di deperibilità spinge al consumo (peraltro spesso a crudo) a poche
ore dalla raccolta, ostacolando la possibilità di un rigoroso controllo di qualità microbiologico.
Non esistono metodi standard per la coltura di questi virus da matrici alimentari. In passato, il
rischio di contaminazione da HAV e NoV veniva valutato indirettamente, tramite il monitoraggio
della contaminazione fecale testando i livelli di Escherichia coli. Tuttavia, l'uso di microrganismi
indicatori di contaminazione fecale non è un metodo affidabile per determinare il rischio di
infezione connesso ad HAV e NoV.
I Norovirus (Nov) sono un gruppo di virus a RNA a singolo
filamento
senza
envelope,
geneticamente
eterogenei
e
appartenenti alla famiglia Caliciviridae. I Norovirus possono
essere classificati in cinque diversi genogruppi (GI, GII, GIII, GIV,
e GV), che possono essere ulteriormente suddivisi in diversi
gruppi genetici o genotipi. I genogruppi I, II e IV infettano gli
esseri umani.
Il genogruppo III infetta le specie bovine, il genogruppo V è stato recentemente isolato nei
topi. La maggior parte dei Norovirus che infettano gli esseri umani appartengono ai
genogruppi GI e GII.
La rilevazione e la quantificazione di HAV e NoV sono difficili in quanto questi virus sono
biologicamente eterogenei e non coltivabili. Tuttavia, negli ultimi anni, in assenza di altri saggi con
sensibilità sufficienti a rilevare direttamente il virus, la Real-Time RT-PCR si è imposta come metodo
analitico essendo l'unica ad offrire la possibilità di rilevazione diretta di HAV e NoV in campioni
ambientali e alimentari fino ad un minimo di 10 copie di virus .
Un importante fattore che ha limitato la diffusione dei test PCR per la rilevazione
di NoV e HAV nei controlli di qualità alimentare è stato l'assenza di un metodo
standardizzato
e
convalidato.
Recentemente
il
Comitato
europeo
di
normalizzazione (CEN) ha colmato questa lacuna pubblicando un metodo
standard per il rilevamento (ISO15216-2) e la quantificazione (ISO15216-1) di HAV
e NoV basato sulla tecnologia Real-time PCR.
Generon ha sviluppato un portafoglio prodotti in grado di fornire al cliente
soluzioni pronte all’uso per testare la presenza di questi patogeni in conformità
alle indicazioni della normativa ISO/CEN. Il portafoglio include tutti i reagenti che
consentono di eseguirne il protocollo sperimentale dall’inizio alla fine.
Superfici alimentari e prodotti alimentari coperti dalla norma ISO (tamponi,
verdure a foglia larga e frutti di bosco, molluschi bivalvi e acqua in bottiglia) sono
matrici altamente complesse e i virus target possono essere presenti a basse
concentrazioni.
È
quindi
necessario
effettuare
specifiche
estrazioni
e/o
concentrazioni del virus per ottenere un campione da cui estrarre e
successivamente rilevare l’RNA. La scelta del metodo dipende dalla matrice
(vedere Figura 2).
Figura 2 – Procedura per il rilevamento e la quantificazione di HAV e NoV.
Passare un tampone su un area fino a 100
cm2 e successivamente immergerlo in un
volume di buffer PBS pari a 500 µL.
Aggiungere 25 g del campione a 40 ml di
TGBE (per i frutti di bosco addizionare
pectinasi), eluire i virus agitando e filtrando l'
eluato. Precipitare utilizzando PEG / NaCl, poi
risospendere il pellet in 500 µL di buffer PBS.
Estrazione
e
Per i frutti di bosco chiarificare ulteriormente
utilizzando una miscela di cloroformio e
butanolo.
Concentrazione del Virus
Filtrare da 0,3 a 5 litri d’acqua attraverso una
membrana carica positivamente, eluire con
buffer TGBE, portare a pH 7, concentrare a
500 µL utilizzando un filtro centrifugo.
Sminuzzare 2 grammi di ghiandola digestiva
asportate dai molluschi, aggiungere un ugual
volume di soluzione di proteinasi K, incubare
a 37 ° C e 60 ° C e poi chiarificare mediante
centrifugazione
Estrarre l'acido nucleico da 500 µL del
campione utilizzando guanidina isotiocianato
Estrazione dell’RNA
e una matrice di silice, o un metodo
alternativo valido. Eluire il RNA in un volume
di 100 µL
One step real-time RT-PCR, RNA (diluito e non
Rilevazione in Real-Time PCR
e
Interpretazione dei risultati.
diluito) analizzato per ciascun target (HAV,
NoV-I e II). Includere i controlli per l'efficienza
di estrazione (saggio con virus di controllo di
processo), per l'efficienza di amplificazione e
le curve standard per la quantificazione.
In diverse fasi del processo di concentrazione ed estrazione del virus e del suo
RNA, a causa di interferenze date dalla matrice costituente il campione, possono
verificarsi perdite del virus target. Per misurare queste perdite, la norma prevede
un controllo accurato del processo di recupero dei virioni: i campioni vengono
addizionati prima dell’analisi con una quantità definita di un virus terzo, simile ma
geneticamente diverso da HAV e NoV, che funge da controllo di processo.
Generon ha selezionato per il controllo di processo un virus appartenente alla
famiglia dei caliciviridae considerato dalla comunità scientifica come modello
per la simulazione di infezioni da NoV e HAV. Il livello di recupero del virus del
controllo di processo viene quindi determinato per ciascun campione.
Inoltre, al fine di controllare l'inibizione della RT-PCR in singoli campioni, deve
essere aggiunto un controllo esterno a una aliquota di campione di RNA e
testato con il metodo RT-PCR (vedi figura 3.1).
Figura 3.1 – Allestimento sperimentale per l’analisi qualitativa e quantitativa
A. Preparazione di estratti di RNA da campioni ignoti
Campione
omogenato
--------------Tamponi
Campioni di
acqua
Campione con virioni
recuperati
Aggiunta
Estrazione e
Virus di
concentrazione
controllo
dei virioni
di processo
Estratti RNA
Campioni test
Estrazione
RNA
Incluso controllo negativo d’estrazione
(campione «Mock»)
B. Preparazione di “campioni ignoti” in Real-Time PCR
Non diluito
Estratti RNA
Campioni test
Diluito 1:10
Arricchito con Controllo Esterno
Molti prodotti alimentari contengono sostanze che possono inibire la RT-PCR. Per monitorare l’inibizione delle reazioni di RTPCR nei singoli campioni, un RNA di controllo esterno (EC RNA) che porta la sequenza target di interesse, deve essere
aggiunto a un’aliquota di RNA del campione e testato usando il metodo RT-PCR relativo. Il confronto tra i risultati ottenuti
per il campione aggiunto di EC con quelli dell’EC RNA puro evidenzia il livello di inibizione della RT-PCR per ogni campione
testato.
C. Creazione della “curva standard di recovery”
Non diluito
Diluito 1:10
Virioni di controllo
Di processo
Diluito 1:100
Diluire Scaldare 5’
a 95°C
Diluito 1:1000
In numerose fasi dell’estrazione dell’RNA si possono perdere frazioni di virus target. Per misurare queste perdite, i campioni
vengono primariamente arricchiti con una quantità nota di virus di controllo di processo. Il recupero del virus di controllo
di processo è determinato, per ogni campione, interpolando il valore di Cq del saggio del virus di controllo di processo del
pozzetto dell’RNA test campione (non diluito o 10-1) alla curva standard dell’RNA del virus di controllo di processo. Se
l’efficienza dell’estrazione è <1 %, un risultato negativo del campione non è valido e deve essere testato nuovamente.
La Real-Time PCR consente sia la semplice rilevazione dei virus sia la loro
quantificazione. Per quantificare un virus target, è necessario confrontare i risultati
con uno standard a concentrazione nota. Per generare una curva standard in
copie per microlitro, è possibile usare una diluizione seriale di uno standard di
quantificazione di DNA che porti la sequenza target di interesse e che venga
quantificato utilizzando un metodo idoneo. In riferimento alla curva standard è
possibile quantificare le copie del genoma virale per microlitro di campione
(figura 3.2).
In Europa e negli Stati Uniti, il Norovirus è uno degli agenti maggiormente
implicati nella diffusione di malattie ed epidemie trasmesse da alimenti.
La maggior parte delle epidemie si sviluppa a partire dai servizi di
distribuzione alimentare,
comealimentare,
i ristoranti. Ogni
alimento
servito crudo
o maneggiato
distribuzione
come
i ristoranti.
I lavoratori
sono
dopo la cottura frequentemente
può essere contaminato
dal Norovirus.
Spesso
il primo veicolo
infezione
fonte di infezione:
spesso
contaminano
con lediloro
stesse
sono gli operatori
: non
seguendo
le buone
pratiche
di igiene
è frequente
che siano
mani
i cibi
pronti da
mangiare
(come
frutta e
verdure crude)
primaloro
di
a contaminare con
le loro
i cibiogni
pronti
da mangiare
prima
di servirli.
servirli.
Adstesse
ognimani
modo
alimento
servito
crudo
o maneggiato
doporovirus.
Figura 3.2 – Allestimento sperimentale per analisi qualitativa e quantitativa
D. Allestimento della “curva standard di copie genomiche virali”
Non diluito
Diluito 1:10
DNA Quantificato
contenente la
sequenza target
del test PCR
Diluito 1:100
Diluito 1:1000
Diluizione
Diluito 1:10000
Per la quantificazione del virus target, i risultati devono essere confrontati con uno standard a concentrazione nota. Per
produrre una curva standard in copie genetiche/µl, si possono utilizzare una serie di diluizioni di un plasmide che porti la
sequenza target di interesse. Interpolando i risultati dei campioni incogniti con la curva standard è possibile quantificare i
genomi virali rilevabili in copie/µl. Questo passaggio è da eseguire solo se è necessaria una quantificazione di HAV e/o
NoV in conformità alla ISO-15216-1.
E. Configurazione della piastra Real-Time PCR per target HAV, NoV-I, o NoV-II e controllo di processo
US
US
US non diluito
US diluito 1:10
Acqua
Campione
Non diluito
Dil. 1:10
+ HAV EC RNA
+ HAV EC RNA
+ HAV EC RNA
Mock
HAV QS
HAV QS
HAV QS
HAV QS
HAV QS
Non diluito
Dil. 1:10
Dil. 1:100
Dil. 1:1000
Dil. 1:10000
Acqua
US
US
US non diluito
US diluito 1:10
Acqua
Campione
Non diluito
Dil. 1:10
+ NoV-I EC RNA
+ NoV-I EC RNA
+ NoV-I EC RNA
Mock
NoV-I QS
NoV-I QS
NoV-I QS
NoV-I QS
NoV-I QS
Non diluito
Dil. 1:10
Dil. 1:100
Dil. 1:1000
Dil. 1:10000
Acqua
US
US
US non diluito
US diluito 1:10
Aqcua
Campione
Non diluito
Dil. 1:10
+ NoV-I I EC RNA
+ NoV-I I EC RNA
+ NoV-I I EC RNA
Mock
NoV-I I QS
NoV-I I QS
NoV-I I QS
NoV-I I QS
NoV-I I QS
Non diluito
Dil. 1:10
Dil. 1:100
Dil. 1:1000
Dil. 1:10000
US
US
PC RNA
PC RNA
Non diluito
Diluito 1:10
Non diluito
Diluito 1:10
Acqua
Acqua
PC RNA
PC RNA
Campione
Diluito 1:100
Diluito 1:1000
MOCK
US = campione ignoto; EC = Controllo esterno; QS = Standard di Quantificazione; PC = Controllo di processo
Per semplificazione grafica l’allestimento è mostrato in singolo. La norma ISO consiglia l’allestimento della reazione in
duplicato per i campioni ignoti e per la quantificazione standard. Quindi la quantificazione dei tre virus in un singolo
campione richiede almeno 65 pozzetti.
Catalogo Prodotti Generon – Rilevazione del Virus
A. Singleplex Real-Time PCR kit conforme alla norma CEN/ISO15216 per rilevazione di Epatite A e Norovirus I e II
 PVW08A
 PVW08A-50
 PVW09A
 PVW09A-50
 PVW10A
 PVW10A-50
WHATfinder HAV ID assay - 100 Tests
WHATfinder HAV ID assay - 50 Tests
WHATfinder Norovirus Type I ID assay - 100 Tests
WHATfinder Norovirus Type I ID assay - 50 Tests
WHATfinder Norovirus Type II ID assay - 100 Tests
WHATfinder Norovirus Type II ID assay - 50 Tests
Ogni kit contiene: mix di primer e sonde per la rilevazione del target; controllo positivo; controllo target esterno; controllo negativo (acqua). In conformità alla ISO
ogni kit deve essere associato alla one-step mastermix appropriata senza IAC e ad un controllo di processo (Cat.# PVW05A)
 PVW08R
 PVW09R
 PVW10R
WHATfinder DigiCount HAV Quantification Standard - 1 Vial *
WHATfinder DigiCount Norovirus Type I Quantification Standard – 1 Vial *
WHATfinder DigiCount Norovirus Type II Quantification Standard – 1 Vial *
Ogni fiala contiene 120 µl di un plasmide che contiene specifiche sequenze del target amplificato. L’amplificazione di una diluizione seriale di questo standard
genera una curva di taratura consentendo la quantificazione dello specifico target in un campione contaminato. I WHATfinder DigiCount non sono materiali di
riferimento certificati.
* In sviluppo
 ENG003
 ENG003-50
ReGENERase One-step MasterMix 100 Reactions
ReGENERase One-step MasterMix 50 Reactions
One-Step mastermix consente la retrotrascrizione seguita dalla amplificazione del cDNA. In conformitò alla norma ISO la mastermix non contiene un controllo
interno di amplificazione.
B. Multiplex Detection Real-Time PCR kit conforme alla norma CEN/ISO15216 per sequenze di Epatite A e Norovirus I e II
 PVW02A
 PVW02A-50
WHATfinder HAV + Norovirus I and II screening assay - 100 Test
WHATfinder HAV + Norovirus I and II screening assay - 50 Tests
Rileva tutti i virus in un singolo pozzetto (fluoroforo FAM) senza distinguere i virus rilevati.
 PVW03A
 PVW03A-50
WHATfinder HAV + Norovirus I and II Duplex ID assay - 100 Test
WHATfinder HAV + Norovirus I and II Duplex ID assay - 50 Test
Rileva HAV (fluoroforo FAM) e NoV senza distinguere il sierotipo rilevato (fluoroforo HEX) in un singolo pozzetto.
 PVW04A
 PVW04A-50
WHATfinder HAV + Norovirus I and II Triplex ID assay - 100 Test
WHATfinder HAV + Norovirus I and II Triplex ID assay - 50 Test
Rileva HAV (fluoroforo FAM), NoV-I(fluoroforo HEX), NoV-II (fluoroforo Texas-Red) in un singolo pozzetto.
 PVW07A
 PVW07A-50
WHATfinder Norovirus I and II Duplex ID assay - 100 Test
WHATfinder Norovirus I and II Duplex ID assay - 50 Tests
Rileva NoV-I (fluoroforo FAM) e NoV-II (fluorofor HEX) in un singolo pozzetto .
Ogni kit contiene: mix di primer e sonde per la rilevazione del target; controllo positivo; controllo target esterno; controllo negativo (acqua). Ogni kit deve essere
associato alla one-step mastermix appropriata con o senza un controllo interno positivo(Cat.# ENG003 e ENG003-50) e/o a un controllo di processo (Cat.#
PVW05A).
 ENG016
 ENG016-50
ReGENERase PLUS One-step MasterMix with Internal Amplification Control - 100 Reactions
ReGENERase PLUS One-step MasterMix with Internal Amplification Control - 50 Reactions
One-Step mastermix che consente la retrotrascrizione seguita dalla amplificazione del cDNA. La mastermix contiene un controllo interno di amplificazione; il
fluoroforo di rilevamento (HEX/Cy5) dipende dalla struttura della reazione multiplex.
C. Process control Kit conforme alla norma CEN/ISO15216
 PVW05A
 PVW05A-50
WHATfinder Recovery Efficiency Kit (according to CEN/ISO15216 Protocol) – 100 Reactions
WHATfinder Recovery Efficiency Kit (according to CEN/ISO15216 Protocol) – 50 Reactions
Ogni kit contiene: mix di primer e sonde per la rilevazione del target (FAM); virus di controllo dell’estrazione; controllo negativo (water). Ogni kit deve essere
associato a una fiala di one-step mastermix senza controllo interno positivo (Cat.# ENG003 e ENG003-50).
Catalogo Prodotti Generon – Concentrazione del Virus ed estrazione del RNA.
A. Reagenti necessari per l’estrazione e la concentrazione dei virioni
ACC2701
Phosphate buffered saline - tablets x 200 ml prep
ACC2702
Water Molecular Biology Reagent – 6x1 Litre
ACC2703
Poly(-ethylene glycol) BioUltra, for molecular biology, 8,000 - 250 g
ACC2704
Trizma® base BioUltra, for molecular biology, ≥99.8% (T) - 250 g
ACC2705
Glycine BioUltra, for molecular biology, ≥99.0% (NT) - 50 g
ACC2706
Beef extract powder for microbiology - 50 g
ACC2707
Proteinase K from Tritirachium album - 5 mg
ACC2708
Pectinase from Aspergillus niger - 10 g
ACC2709
Chloroform ≥99.5% - 25 ml
ACC2710
1-Butanol for molecular biology, ≥99% - 500 ml
ACC2711
Sodium hydroxide - 500 g
ACC2712
Hydrochloric acid - 100 ml
ACC2713
Sodium chloride - 250 g
ACC2714
Centrifugal filter concentration devices with 15 ml capacity and 100 kDa MW cutoff
ACC2715
Positively charged membrane filters with 0,45 μm pore size (47 mm diameter)
B. Estrazione del RNA Virale
EXD901
Zymo DirectZol miniprep with Trireagent - 50 Estrazioni
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