progress in stem cell biology and medical applications

PROGRESS IN STEM CELL
BIOLOGY AND MEDICAL
APPLICATIONS
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Stresa
14-16
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maggio
2009
lo stile del sottotitolo dello schema
12/01/13
Self-renewal vs differentiation
12/01/13
Controllo del self renewal
mediante fattori di trascrizione
•
La pluripotenza delle cellule staminali è
determinata dalla espressione di fattori di
trascrizione quali Oct4, Sox 2 e Nanog
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Funzione di Nanog
•
•
•
L’espressione di Nanog nelle ES è legata al self
renewal
Una downregulation di Nanog predispone alla
differenziazione
L’assenza di Nanog aumenta la frequenza di
differenziazione, ma di per sé non è in grado di
indurre il commitment
Pertanto Nanog promuove il self renewal ma
non è indispensabile
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•
Nanog e le cellule germinali
•
La espressione di Nanog è indispensabile per
la formazione di cellule germinali.
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•
Ipotesi: Nanog legato alla inattivazione del
cromosoma X, che non avviene nelle ES in
quanto XIST non è attivato
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•
•
•
Le proteine Oct4, Sox 2 e Nanog si legano
sulla regione cromatinica di XIST, e lo
reprimono.
In assenza di Nanog, XIST è parzialmente derepresso.
In assenza di Oct-4 Nanog e Sox2 non possono
più legarsi a XIST che viene così
completamente espresso.
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Ruolo del miRNA
nella funzione delle stem cells
•
•
•
•
miRNA: small, non coding RNAs che regolano
la espressione proteica legandosi al 3’UTR di
mRNA target e inibendone la traduzione.
Alcuni miRNA della famiglia miR-17 agiscono
controllando la differenziazione delle stem
cells a livello del pathway di STAT3.
Questi miRNA sono espressi durante il
differenziamento e agiscono inibendo STAT3.
L’inibizione degli miRNA, al , contrario, blocca
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Approccio chimico alla biologia
della cellula staminale
•
•
L’identificazione delle molecole in grado di
regolare il self-renewal delle cellule staminali è
un punto cruciale per l’uso di tali cellule in
medicina rigenerativa
Tra le strategie per la identificazione di tali
molecole, un ruolo importante è giocato dalla
analisi chimica.
12/01/13
12/01/13
Approccio per la identificazione di
molecole coinvolte nel self-renewal
•
•
High-throughput
screening di 50.000
molecole di sintesi
utilizzando una linea
murina di ES
esprimente la GFP sotto
controllo degli elementi
regolatori del gene Oct4
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Identificazione
di
Xu et al., 2008
Xu et al., 2008
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La pluripontina
•
•
Sostiene il self renewal spontaneo di ES
murine a lungo termine in assenza di siero, LIF
o altre sostanze comunemente utilizzate nella
coltura delle ES
Agisce indipendentemente dalla attivazione
esogena dei pathways canonici LIF–STAT3,
BMP–SMAD-ID and WNT–β-catenin
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Target molecolari della
pluripontina
•
Proteine endogene che stimolano la attività
differenziativa:
–
–
•
RasGAP
extracellular-signal-regulated kinase 1 (ERK1)
La inibizione simultanea di RasGAP e ERK1 è
sufficiente a garantire un self-renewal a lungo
termine.
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Xu et al., 2008
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Cellule staminali
e terapia genica
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I principali limiti
dei protocolli di terapia genica
•
•
•
•
Difficoltà a mantenere una espressione a
lungo termine del trascritto terapeutico
Rischio di risposta immune verso le cellule
usate per il trapianto, verso il vettore o verso il
prodotto proteico del gene terapeutico
Difficoltà nel regolare la espressione del
transgene
Rischio di mutagenesi inserzionale
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Il principale limite dell’uso della
terapia con cellule staminali nelle
Inutilità di
un trapianto
autologo in cui
malattie
genetiche
•
utilizzino cellule del paziente portatrici della
mutazione responsabile della patologia
•
Rischio di risposta immune in caso di
trapianto eterologo
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La nuova prospettiva
per la gene therapy del futuro
•
Combinare la capacità di
transdifferenziazione e di self renewal
delle cellule staminali con la possibilità di
modificare geneticamente le stesse allo
scopo di riparare il difetto genico e poter
procedere a trapianti autologhi
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Distrofia Muscolare di Duchenne
•
Malattia X-linked recessiva
•
Incidenza: 1:3500 maschi
•
•
Caratterizzata da progressivo deterioramento
della struttura e funzione muscolare con
esordio dagli arti inferiori
Gene: DMD (2 Mb)
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2006: Gene therapy della DMD
in cani Golden Retriever
•
•
Trapianto intrarterioso di mesangioblasti
(stem cells associate ai vasi sanguigni)
Due protocolli:
–
–
Trapianto autologo con cellule transfettate con
lentivirus in grado di esprimere una
microdistrofina
Trapianto eterologo con cellule wild type da cani
donatori
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Risultati
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Problemi riscontrati
•
•
Non efficacia del trapianto autologo con
transfezione lentivirale
Peggioramento clinico dopo sospensione della
terapia immunosoppressiva in quasi tutti gli
animali sottoposti a trapianto eterologo
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2009: progetto per un rotocollo
terapeutico nell’uomo
•
Cellule utilizzate: CD133+
–
•
Proprietà delle CD133+
–
•
Cellule del sangue presenti in numero di 20.000 ogni
15 cc
Capacità di fondersi con le cellule muscolari e di
acquisire capacità di self renewal
Riparazione del difetto genico mediante exonskipping del gene DMD
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Sperimentazione clinica con
CD133+
•
•
•
Cellule CD133+ di derivazione muscolare sono
state trapiantate in otto pazienti con distrofia
di Duchenne in un trial di fase I a doppio cieco
di 7 mesi.
La sicurezza del trapianto con cellule staminali
è stata effettuata valutando la forza
muscolare e l’istologia muscolare, la funzione
cardiaca e polmonare.
Nessun effetto collaterale osservato nei
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Exon skipping
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Protocollo di exon-skipping
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Terapia genica della epidermolisi
bollosa
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Le cellule staminali epiteliali
•
Cellule staminali della pelle:
–
–
–
Garantiscono il rinnovo completo della nostra
pelle che si completa ogni 25 gg
Coltivabili a partire da singole cellule, in grado di
produrre “olocloni”
Un singolo oloclone è in grado di generare 1045
cellule, capaci di ricoprire 1030 mq umani
12/01/13
Uso delle staminali epiteliali in
terapia
•
Terapia delle ustioni
–
–
•
Utilizzate da circa 20 anni
Trattati bambini con ustioni fino al 95% della
superficie corporea
Terapia delle degenerazioni corneali
–
250 pz. trattati , con follow up a 5 anni
–
70% di successo
Un nuovo utilizzo terapeutico delle staminali
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epiteliali:
•
Epidermolisi bollose
•
•
Famiglia di gravi
patologie della pelle
causate da difetti di
adesione dermaepidermide
Classificate in:
–
–
simplex (EBS),
giunzionale (EBG)
Distrofica
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–
(EBD)
Epidermolisi bollosa giunzionale
•
•
Fragilità della pelle e
delle mucose con
formazione
spontanea di bolle
2 forme:
–
Herlitz (letale)
•
Esordio alla nascita
Associazione con
malformazioni
12/01/13 urogenitali
•
Genetica della EBG
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Caso clinico
•
•
•
Paziente di 37 con forma grave di epidermolisi
bollosa giunzionale
Trovate cellule staminali in grado di produrre
olocloni solo sul palmo delle mani
Cellule staminali trasfettate con una efficienza
del 95% con un vettore retrovirale MLV
derived “clinical grade” (250.000 €)
contenente la completa regione codificante
del gene LAMB3
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Risultati
•
•
•
A 8 gg dal trapianto, inizio delle rigenerazione
della pelle
A 3 anni di follow up perfetto attecchimento
nelle zone sottoposte a trattamento, senza
effetti collaterali
Analisi in LM-PCR per analizzare i siti di
inserzione:
–
Intera epidermide ottenuta dopo il trapianto retta
dalla attività di sole 30 cellule staminali
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Problematiche future
•
Il maggior problema attuale della terapia
cellulare in fase clinica con cellule staminali è
dato dai costi.
Le cellule staminali sono state equiparate a
farmaci, e pertanto una struttura che faccia
uso di tali cellule a scopi terapeutici deve
soddisfare, per i regolamenti della comunità
europea, gli stessi requisiti richiesti per la
produzione e la gestione commerciale di un
12/01/13
farmaco
•