C024 Generazione di cellule staminali pluripotenti

C024
Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mediante vettori adenovirali helper-dipendenti
1
1
1
2
2
3
P. Annunziata , N. Pastore , P. Piccolo , D. Palmer , P. Ng , N. Brunetti-Pierri
1
Telethon Institute of Genetics and Medicine, Naples, Italy
2
Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA
3
Dipartimento di Pediatria, Universitá Federico II di Napoli, Naples, Italy
Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) hanno un grande potenziale per la medicina rigenerativa e per ottenere
modelli cellulari rilevanti per lo studio delle malattie umane. Le iPSCs sono state generate da cellule somatiche sia murine
che umane utilizzando vettori virali (retrovirus, lentivirus e adenovirus di prima generazione), DNA plasmidico o RNA codificanti per specifici fattori di trascrizione e le proteine ricombinanti corrispondenti ai fattori di reprogramming. Per applicazioni terapeutiche l’uso di vettori integranti nel genoma pone preoccupazioni per il rischio di trasformazione neoplastica
delle cellulle derivate dalle iPSCs legato alla mutagenesi inserzionale. Per superare questo ostacolo sono stati sviluppati
sistemi non virali che tuttavia hanno come limite la bassa efficienza. In questo studio, per generare iPSCs da cellule somatiche murine ed umane, abbiamo utilizzato i vettori adenovirali helper-dipendenti (HDAd) non-integranti, che sono privi di
sequenze codificanti virali e hanno un’ampia capacitá di clonaggio. Abbiamo generato un singolo vettore HDAd, che esprime i quattro fattori di reprogramming (OCT4, SOX2, KLF4, e c-MYC) sotto il controllo del promotore del Citomegalovirus
(CMV), per infettare fibroblasti embrionali (MEF) derivanti dai topi transgenici Nanog-GFP, in cui il gene reporter GFP è
sotto il controllo del promotore embrionale Nanog, e i fibroblasti umani. L’infezione dei MEF con il vettore HDAd ha generato
iPSCs, con la tipica morfologia e positive per GFP, dopo 14 giorni dall’inizio del trattamento. La RT-PCR ha confermato
l’espressione dei geni staminali Oct4 e Nanog. Analogamente abbiamo ottenuto cloni di iPSCs dai fibroblasti umani, come
dimostrato dall’immunofluorescenza per marcatori staminali (TRA 1-81, TRA 1-60, SSEA3 e SSEA4) e dalla RT-PCR per i
geni OCT4, DPPA5 e REX1. Il metodo di reprogramming basato su HDAd appare generare cloni di iPSCs più rapidamente
rispetto ai metodi attualmente disponibili che non comportano integrazione genomica. Il reprogramming indotto da vettori
HdAd potrebbe essere un metodo sicuro e rapido per la generazione e lo studio di cellule staminali paziente-specifiche,
con potenziali applicazioni per una vasta gamma di patologie umane.