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Prof. Giorgio Sartor
Turn-over delle proteine
Copyright © 2001-2013 by Giorgio Sartor.
M07 - Versione 1.4 – nov 2013
All rights reserved.
Turn-over delle proteine
• Le proteine cellulari vengono regolarmente degradate e
sintetizzate.
• Il tempo di semi-vita di un enzima nel fegato di ratto
varia da 10 minuti a una settimana.
• In media il tempo di semi-vita di una proteina è
correlato con il residuo N-terminale:
– Proteine con N-terminale come Met, Ser, Ala, Thr,
Val, o Gly hanno un tempo di semi-vita maggiore di
20 ore.
– Proteine con N-terminale Phe, Leu, Asp, Lys, o Arg
hanno un tempo di semi-vita di 3 minuti o meno.
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M07 - Turn-over delle proteine
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1
Turn-over delle proteine
• È stato dimostrato che le proteine ricche in Pro
(P), Glu (E), Ser (S) and Thr (T), chiamate
proteine PEST, sono degradate più
rapidamente che le altre proteine.
• La degradazione di specifiche proteine può
essere regolata:
– Negli eucarioti il ciclo cellulare è controllato, alcuni
enzimi regolatori del ciclo sono degradati in fasi
particolari del ciclo cellulare in risposta a segnali
intra o extra-cellulari.
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M07 - Turn-over delle proteine
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Proteolisi: meccanismo generale
n
n+1
n
n+1
R''
O
R''
O
H
H
NHR
H
N
NHR
Nu+
CR''
R'
H
N
H
R' R
CR''
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H
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n
n+1
n
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OH
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H
H
NHR
n+1
O
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H
NHR
Nu
CR''
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H
R
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H
CR''
H
Nu:
N
R'
R
H
H2O
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2
Enzimi proteolici
• Classi di enzimi proteolitici:
– Proteasi a serina: enzimi digestivi come tripsina,
chimotripsina, elastasi...
– Differiscono nella specificità del substrato:
• Chimotripsina: privilegia il taglio del legame peptidico nel
quale l’AA che impegna il C=O ha una catena laterale.
• Tripsina: preferisce un AA carico positivamente (Lys o
Arg) nella stessa posizione.
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Enzimi proteolici: proteasi a serina
• Il sito attivo (tripsina bovina
3BTK) è fatto da un residuo di
serina (Ser195), uno di istidina
(His57) e uno di aspartato
(Asp102).
• Durante la catalisi vi è un
attacco nucleofilo del OH della
serina sul carbonio del
carbonile del legame peptidico
che deve essere tagliato.
• Durante la reazione un H+ è
trasferito dalla serina all’anello
imidazolico dell’istidina,
l’aspartato forma un legame H
con l’istidina.
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Ser195
His57
Asp102
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Centro catalitico
His57
Asp102
Ser195
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Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
H
H O
*
*
E
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
H
H
ES
*
O
H
O
*
N
H
*
R
N
*
H
R
Gly193
N *
Sito
Specifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
+
H
O
H
Intermedio tetraedrico
H
*
*
O
N
H
*
R
*
N
R
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
+
*
O
H
*
H
H
O
N
H
*
R
N
*
H
R
Gly193
N *
Sito
Specifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
O
O
H
H
H
N
H
H
O
H
*
R
*
N
*
*
R
H
Gly193
N *
Acilenzima
Sito
Specifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
Ser195
O
N
H
O
H
N
*
H
*
O
H
H
*
O
H
R
Gly193
N *
N
H
*
R
Sito
Specifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
O
H
H
*
O
*
*
O
H
N
R
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
Intermedio tetraedrico
+
H
*
O
*
O
H
O
H
N
*
H
R
Gly193
N *
Sito
Specifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
H
+
H
O
O
*
*
O
H
*
N
R
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
H
O
H
*
O
*
O
H
N
*
H
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Gly193
N *
Sito
Specifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
H O
*
*
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
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Proteasi a serina (1HAX)
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Proteasi a serina (1HAX)
Gly193
Ser195
His57
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Enzimi proteolici: proteasi a aspartato
• Le
–
–
–
–
proteasi ad aspartato comprendono:
La pepsina (enzima digestivo).
Alcune proteasi lisosomiali.
L’enzima renale renina.
Le proteasi dell’HIV.
• Due residui di aspartato sembra partecipino alla catalisi
acido/base nel sito attivo.
• Un aspartato accetta H+ da una molecola di H2O nel sito
attivo che attacca il carbonio carbonilico del legame
peptidico.
• Simultaneamente l’altro aspartato cede l’H+ all’ossigeno
del carbonile del legame peptidico.
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11
Pepsina
• Secreta dalle cellule della mucosa gastrica (che
secernono anche HCl) come pepsinogeno inattivo (40
kD):
Pepsinogeno
pH acido
Pepsina
…-AA-AA-AA-AA-…
-42AA
AA + AA-AA + AA-AA-AA
• Taglia con maggior frequenza legami tra aminoacidi
aromatici, Met, Leu e produce peptidi e pochi aminoacidi
liberi.
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Meccanismo delle proteasi ad aspartato
H
H
*
O
H
O
*
*
N
*
O
H
H
O H
O
O
*
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O
*
*
*
O
O
*
*
O
H
O
*
H
N
H
H
O
O
H
N
O
O
*
*
*
*
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*
O
O
O
*
*
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Enzimi proteolici: metallo proteasi
• Appartengono alla classe delle proteasi a Zinco
(metalloproteasi):
– La carbossipeptidasi (enzima digestivo).
– Le metalloproteasi della matrice (collagenasi),
coinvolte nella degradazione della matrice extra
cellulare durante la crescita dei tessuti.
– Una proteasi lisosomiale.
• Nel sito attivo è presente uno zinc binding motif, con
due residui di istidina il cui imidazolo complessa lo ione
Zn++.
• Nella catalisi lo Zn++ interagisce con l’ossigeno del C=O
promuovendo l’attacco nucleofilo dell’ossigeno di una
molecola di acqua nel sito attivo al carbonio del C=O.
• Nella carbossipeptidasi un residuo di glutamato facilita
la reazione estraendo un H+ dall’acqua.
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Peptidasi intestinali
Procarbossipeptidasi A e B
Leucina aminopetidasi
Carbossipeptidasi
A
B
N
H
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Leu
R
O
H
N
O
*
O
Lys
Arg
O
H
O
*
O
H
R
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H
N
NH3+
O
H
*
R
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Metallo (zinco) proteasi
• Uno ione Zn++ è coordinato
con due atomi di azoto di due
His, il carbonile di un Glu e
H2O
• Lo ione Zn++ promuove
l’attacco nucleofilo sul
carbonio carbonilico da parte
dell’atomo di ossigeno
dell’acqua legata nel sito
attivo
• Il residuo di Glu agisce come
base facilita la reazione
estraendo un H+ dall’H2O.
Zn++
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Enzimi proteolici: proteasi a cisteina
• Appartengono alla classe delle proteasi a Cisteina:
– La papaina (della Carica Papaya).
– Alcune protesi lisosomiali (catepsine).
– Le caspasi che si occupano della degradazione delle
proteine dell’apoptosi (morte cellulare
programmata).
• Le proteasi lisosomiali a cisteina sono omologhe alla
papaina. Sono una famiglia molto grande con svariata
specificità di substrato.
• Le caspasi tagliano il lato carbossilico di un aspartato.
• Il meccanismo delle proteasi a cisteina si pensa che
coinvolga la deprotonazione del SH di una cisteina da
parte di un residuo vicino di istidina seguito da un
attacco nucleofilo dello zolfo al carbonio carbonilico.
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Attivazione delle proteasi
• Attivazione delle proteasi:
• La maggior parte delle protesi sono sintetizzate
come proenzimi di maggiori dimensioni.
• L’attivazione consiste nella rimozione di un
segmento inibitorio nel proenzima.
• L’attivazione può avvenire dopo che la proteasi è
stata secreta nell’apposito compartimento cellulare
o nella matrice extracellulare.
• In alcuni casi (attivazione dell’apoptosi)
l’attivazione può essere a cascata e portare
all’attivazione di proteasi specifiche.
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Degradazione delle proteine
• Ci sono tre principali sistemi di degradazione delle
proteine (nel muscolo):
– Ubiquitina-proteosoma
• Le proteine sono marcate per la degradazione da unità di
ubiquitina.
• I proteosoma 20S inattivo viene attivato da una proteina
regolatrice diventando proteosoma 26S
• Il proteosoma 26S rompe la proteina in peptidi
– I peptidi sono scissi in aminoacidi liberi da altri processi nella
cellula
– Lisosomi
• Le proteine entrano nei lisosomi via endocitosi
– La catepsina e le proteasi degradano i legami peptidici in ambiente
acido.
– Calpaina
• Proteasi attivate da calcio nel citosol della cellula
– I differenti isomeri sono attivati da differenti concentrazioni di
calcio.
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Ubiquitina:
– Le proteine sono marcate per la proteolisi
selettiva dall’ubiquitina, una proteina ubiquitaria
altamente conservata.
– Si forma un legame isopeptidico tra il
carbossiterminale dell’ubiquitina e un gruppo NH2
di una lisina della proteina da degradare.
• Il processo è ATP dipendente.
• Sono coinvolti tre enzimi (E1, E2 e E3).
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Inizialmente il carbossiteminale dell’ubiquitina è
legato con un legame tioestere al UbiquitinActivating Enzyme (E1) attraverso una reazione ATP
dipendente
• L’ubiquitina vien quindi trasferita ad un gruppo
sulfidrilico del Ubiquitin-Conjugating Enzyme (E2).
• Una Ubiquitin-Protein Ligase (E3) trasferisce
l’ubiquitina attivata al gruppo ε-amino di una lisina
formando un legame isopeptidico.
• Ci sono diverse ligasi dell’ubiquitina che differiscono
per la specificità.
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Più ubiquitine sono legate
per formare una catena.
• La Gly carbossiterminale
forma un legame con il
gruppo ε-amino della
Lys48 di una catena
adiacente di ubiquitina.
1UBQ
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Alcune proteine (per esempio le cicline, coinvolte nella
regolazione del ciclo cellulare) presentano una sequenza
chiamata destruction box, riconosciuta da un dominio del
corrispondente E3.
• L’interazione dell’ubiquitina ligasi con il suo bersaglio è
regolata, in alcuni casi, dalla fosforilazione della proteina
bersaglio e può coinvolgere altre proteine adattatrici.
H2N
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COOH
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Alcune proteine (per esempio le cicline, coinvolte nella
regolazione del ciclo cellulare) presentano una sequenza
chiamata destruction box, riconosciuta da un dominio del
corrispondente E3.
• L’interazione dell’ubiquitina ligasi con il suo bersaglio è
regolata, in alcuni casi, dalla fosforilazione della proteina
bersaglio e può coinvolgere altre proteine adattatrici.
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E1-E2-E3
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E1-E2-E3
• E1 è l’enzima che attiva il processo attivando
la molecola di ubiquitina attraverso un legame
ad un SH di una Cys. Il processo richiede ATP.
• Diversi E2 ricevono la molecola di ubiquitina
così attivata e vengono riconosciuti da diversi
• E3 è un enzima che riconosce, e lega, la
proteina da ubiquitinare e trasferisce su di
essa l’ubiquitina legandola ad una Lys
bersaglio.
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19
E1-E2-E3
1R4N
1FXT
1FQV
1LDK
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E3
HECT: Holologous to E6 AP C Terminus
RING: Really Interesting New Gene
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
• La degradazione selettiva di una proteina avviene nel proteosoma.
Un complesso proteico presente nella cellula.
• Il core complex del proteosoma, ha un coefficiente di
sedimentazione di 20S ed è costituito di 14 subunità di due tipi
(α7β7).
– Le sette subunità α formano un anello a struttura cilindrica.
– Le sette subunità β formano l’anello centrale.
α7β7
α
{β
1JD2
β
α7β7
{α
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Il core complex del proteosoma racchiude una cavità fatta di
tre compartimenti collegati da uno stretto passaggio.
• L’attività proteasica è associata a tre delle subunità β ognuna
con differente specificità per il substrato.
α
β
β
α
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
1. Una subunità β ha una attività simile alla chimotripsina
con preferenza per Tyr o Phe come AA al carbonile del
legame peptidico.
2. Una subunità β ha una attività simile alla tripsina con
preferenza per Arg o Lys al carbonile del legame
peptidico.
3. Una subunità β ha una attività post-glutamil con
preferenza per glutamato o altro residuo acido.
•
•
Non sono coinvolti residui di cisteina o serina.
L’attività idrolasica del proteosoma costituisce una
famiglia di proteasi a treonina.
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22
Sistema Ubiquitina-proteosoma
•
Nella struttura del core complex
del proteosoma non ci sono
apparenti aperture verso
l’esterno.
•
È presente un cap complex
(“cappello”) che apra il
passaggio verso l’esterno e
permetta alla proteina di entrare
consumando ATP.
•
È stato cristallizzato il core
complex 20S del proteosoma
con il cap complex 11S.
•
L’interazione del cap complex
11S altera la conformazione del
dominio N-terminale delle
subunità α del core complex
permettendo l’accesso
dall’esterno.
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1FNT
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Ad ognuna delle estremità
del core complex un
“motore” ad ATP svolge
la proteina da degradare e
la inserisce nel core
complex
• Al di sopra di questo ci
sono i sistemi di
controllo che
riconoscono la proteina
etichettata con ubiquitina.
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23
http://www.genome.jp/kegg/pathway/ko/ko03050.html
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- 49 -
Differente cappello
• Alcune cellule usano il core
del proteosoma
corredandolo con un
“cappello” diverso a
secondo delle proprie
necessità.
• Non usano ATP per
procedere all’inserimento
della proteina da degradare.
• Non è molto chiara la
funzione di questi sistemi
che sembrano avere una
predilezione per peptidi più
corti e per proteine
normalmente non “foldate”.
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- 50 -
25
Caspasi
• Le caspasi sono le proteine che
eseguono l’apoptosi.
• Sono delle proteasi a cisteina che
usano il gruppo SH come nucleofilo
per l’idrolisi del legame peptidico.
• Idrolizzano il legame peptidico a
livello di residui di Asp.
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- 51 -
Caspasi
• Esistono almeno una dozzina di Caspasi
conosciute ognuna delle quali svolge una
funzione definita
• Caspasi-1 (interleukin-1β-converting
enzyme) è stata la prima ad essere
identificata. Non è coinvolta nell’apoptosi.
Come le altre Caspasi è fatta di due
catene ognuna delle quali viene tagliata in
due pezzi.
• Caspasi-9 è legata ad un inibitore che la
mantiene inattiva. Viene attivata ad
un’altra subunità. La Caspasi-9 è un
iniziatore di apoptosi che attiva un
effettore come la
Caspasi-1 (1ice)
Caspasi-9 (1nw9)
• Caspasi-3 la quale, insieme ad altri
effettori, inizia il lavoro di
disassemblaggio della cellula.
Caspasi-3 (1pau)
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- 52 -
26
Lisosomi
• I lisosomi contengono enzimi
idrolitici che degradano le proteine e
altre sostanze catturate per
endocitosi.
• I lisosomi hanno un valore di pH
interno basso (acido a causa di un
trasporto di protoni pilotato da una
V-ATPasi.
• Tutti gli enzimi idrolitici lisosomali
hanno un optimum a pH acido.
• Le catepsine (proteasi a cisteina)
sono attivate dalla scissione di
proenzimi che può essere catalizzata
da altri enzimi lisosomali o
dall’ambiente acido
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Enzimi idrolitici
pH acido
ATP
H+
ADP + Pi
M07 - Turn-over delle proteine
- 53 -
Lisosomi: sistemi di protezione
• Le cistatine inibiscono le catepsine lisosomali.
Sono presenti nel citosol e nello spazio
extracellulare.
• Le cistatine si legano al sito attivo delle
catepsine competendo con il substrato e
proteggono la cellula dalle catepsine
eventualmente uscite dai lisosomi.
• Autofagia: se una porzione del citoplasma
viene incapsulata dai lisosomi si ha la
degradazione delle proteine.
• Questo meccanismo non è il meccanismo di
elezione per la degradazione selettiva delle
proteine.
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M07 - Turn-over delle proteine
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Calpaine
• Nei mammiferi le calpaine più conosciute solo le
Calpaina-1 e Calpain-2 (micro-calpaina e M-calpaina),
sono espresse ubiquitariamente.
• L’attività delle calpaine e è strettamente controllata
dall’inibitore endogeno calpastatina che è una proteina
intrinsecamente non strutturata che si lega alle calpaine
in modo reversibile e solo in presenza di Ca++.
• Non è ancora ben chiaro come una proteina non
strutturata possa funzionare da inibitore delle proteasi
senza essere a sua volta scissa in peptidi.
• Ciò che si osserva è che la Calpastatina occupa
entrambi i lati del sito catalitico senza interagire con
esso direttamente
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M-Calpaina
3BOW
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Calpastatina
M07 - Turn-over delle proteine
1DF0
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Apoptosi
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M07 - Turn-over delle proteine
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Crediti e autorizzazioni all’utilizzo
• Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi di Biochimica:
– CHAMPE Pamela , HARVEY Richard , FERRIER Denise R. LE BASI DELLA BIOCHIMICA [ISBN 9788808-17030-9] – Zanichelli
– NELSON David L. , COX Michael M. I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER - Zanichelli
– GARRETT Reginald H., GRISHAM Charles M. BIOCHIMICA con aspetti molecolari della Biologia
cellulare - Zanichelli
– VOET Donald , VOET Judith G , PRATT Charlotte W FONDAMENTI DI BIOCHIMICA [ISBN 9788808-06879-8] - Zanichelli
• E dalla
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consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali:
Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.genome.ad.jp/kegg/
Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/
Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/
Rensselaer Polytechnic Institute:
http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/MB1index.html
• Il materiale è stato inoltre rivisto e corretto dalla Prof. Giancarla Orlandini dell’Università di Parma alla
quale va il mio sentito ringraziamento.
Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:
http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/ oppure da http://www. gsartor.org/
Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza
limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna – Alma Mater
Giorgio Sartor - [email protected]
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