istruzioni

ESEMPI DI DIAGNOSI ESEGUITE CON IL ß-TAL I SCREENING KIT
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Ricerca e Sviluppo: Traversa Michele Pietravalle, 11 80100 NAPOLI Tel. 081 5465026
Email: [email protected]
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Sede Amministrativa e Produzione: Via Lombarda 169/A 55013-LAMMARI (LU) Tel/Fax 0583-962672
Email: [email protected]
634
436
390
281
208
IVSII-1
ß°39
IVS1-110
IVS1-1
C-6
bp
bp
bp
bp
bp
ß-Tal I screening
(40 test)
GD700
1e2=
3e4=
5e6=
7e8=
Multiplex
Multiplex
Multiplex
Multiplex
con
con
con
con
Pre-Mix
Pre-Mix
Pre-Mix
Pre-Mix
Normale
Normale
Normale
Normale
e
e
e
e
Mutata
Mutata
Mutata
Mutata
1
2
3
(Eterozigote per ß°39)
(Eterozigote per IVSII-1)
(Doppia Eterozigosi per ß°39 e IVSII-1)
(Eterozigote per ß°39)
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ISTRUZIONI D’USO
Edizione 1 Rev. 1 Luglio 2000
1,2,3= Multiplex con Pre Mix Normale
4= Marcatore Pesi Molecolari
5=Eterozigote per IVSII-1
6=Eterozigote per ß°39
7=Eterozigote per IVS1-110
Prodotto e Distribuito da:
GeneDia Via Lombarda 169/A 55013-LAMMARI (LU) Tel/Fax 0583-962672
Web:www.genedia.it - Email [email protected]
INTRODUZIONE
La Talassemia è ancora oggi uno dei problemi sanitari preminenti nell’area mediterranea, dove
vivono oltre 30.000 pazienti affetti da anemia di Cooley con un incremento annuo di circa 5.000
nuovi casi. In Italia gli ammalati sono circa 6.500. I portatori noti sono circa 3.000.000 con
tendenza all’incremento.
GeneDia ha allestito un protocollo costituito da 5 reazioni di amplificazione di DNA (1 multiplex e 4
reazioni singole) riunite in 2 Kit (GD 700 e GD 701), che permettono l’analisi molecolare del gene
della globina β e del suo promotore per le 9 mutazioni più frequenti riscontrate nella popolazione
italiana.
I prodotti della reazione di amplificazione sono separati per differenza di peso molecolare mediante
corsa elettroforetica in gel di agarosio al 2%. Ogni sito genomico viene, secondo la metodica
ARMS, amplificato e rivelato utilizzando sia il primer con sequenza non mutata che il primer che
riconosce la mutazione. I pesi molecolari relativi ai frammenti ottenuti, sono riportati nella tabella
allegata (Tab.1).
Tab.1
TIPO DI MUTAZIONE
IVSII-nt1
β039
IVSI-nt110
IVSI-nt1
C6
IVSII-nt745
IVSI-nt6
β+-87
β+-101
bp n°
634 bp
436 bp
390 bp
281 bp
207/208 bp
Kit di riferimento
GD 700 ß-TAL I SCREENING
GD 700 ß-TAL I SCREENING
GD 700 ß-TAL I SCREENING
GD 700 ß-TAL I SCREENING
GD 700 ß-TAL I SCREENING
738 bp
286 bp
729 bp
743 bp
GD 701
GD 701
GD 701
GD 701
ß-TAL II SCREENING
ß-TAL II SCREENING
ß-TAL II SCREENING
• Portaprovette refrigerato
• Tubi per P.C.R.
• Puntali sterili con barriera antiaerosol
• Enzima di Amplificazione (GD213)
Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere sterili e monouso. Occorre poter
disporre di un set di micropipette dedicato. Si suggerisce di eseguire tutte le operazioni in cappa
biologica ed in ghiaccio. È tassativo l’uso di guanti durante la manipolazione di campioni e
reagenti.
CONTENUTO DEL KIT GD 700
Pre Mix NORM. costituita da 2 tubi da 20 test contenente i primer e gli additivi necessari
all’esecuzione della reazione per il riconoscimento del genotipo non mutato.
Conservazione –20°C. Scongelare solo prima dell’uso.
Pre Mix MUT. costituita da 2 tubi da 20 test contenente i primer e gli additivi necessari
all’esecuzione della reazione per il riconoscimento del genotipo mutato..
Conservazione –20°C. Scongelare solo prima dell’uso.
MgCl2 25mM
Conservazione –20°C. Scongelare solo prima dell’uso.
PR O T O C O L L O O P E R A T I V O
• Scongelare i reagenti.
• Preparare due serie di tubi per PCR.
La prima serie sarà utilizzata per la premix normale, contenente cioè i primers antisenso specifici
per il riconoscimento delle sequenze normali ed il primer senso comune.
La seconda serie di provette sarà utilizzata per la premix mutata, contenente cioè i primers
antisenso specifici per il riconoscimento delle sequenze mutate ed il primer senso comune.
Distribuire per ogni tubo Distribuire per ogni tubo
serie 1 normale:
serie 2 mutata:
ß-TAL II SCREENING
L’analisi molecolare del gene della globina β e del suo promotore permette di individuare mutazioni
silenti che possono associarsi ad altre mutazioni talassemiche e non, ed influenzare in maniera
decisiva ed inattesa il genotipo della progenie. L’analisi molecolare del genoma della coppia è quindi
di fondamentale rilevanza predittiva per il Genetista Clinico, oltre che costituire un metodo rapido
ed accurato per la caratterizzazione degli individui affetti.
Applicabilità: su DNA estratto con GD 205, GD 241 oppure con il Fast-DNA Extra Kit.
N° di Test: 40 campioni da amplificare in doppio con primers normali e mutati secondo la
metodica ARMS
Conservazione: - 20°C
Stabilità: 12 mesi se correttamente conservato
Strumenti richiesti:
• Pipette dedicate
• Termociclatore programmabile
• Vortex
• Agitatore
• Centrifuga da 17.000xg
Pag.1
MATERIALI E REAGENTI RICHIESTI NON INCLUSI NEL KIT
Mix per 1 test
6,5 µl
30 µl
3 µl
0,5 µl
40 µl
H2O sterile
Premix
MgCl2
Taq Polimerase 5 UI/µl
Vol. Totale
xN° di test
………….
………….
………….
………….
Mix per 1 test
6,5 µl
30 µl
3 µl
0,5 µl
40 µl
xN° di test
………….
………….
………….
………….
Aggiungere 10 µl di DNA genomico(*) estratto in ogni tubo.
(*)
Si consiglia di utilizzare campioni di DNA estratto fresco.
Porre sul termociclatore preriscaldato a 94°C ed eseguire il seguente ciclo di amplificazione:
1 ciclo
94°C
per 5 min
35 cicli
95°C
per 1 min
63°C
per 1 min
72°C
per 1 min
1 ciclo
72°C
per 10 min
Storage 8 – 10°C.
I frammenti di DNA ottenuti dopo la reazione saranno analizzati mediante separazione elettroforetica in gel di
agarosio al 2%.
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