SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO E’ la misura di una radiazione elettromagnetica assorbita o prodotta dalla materia. L’ emissione d’onde elettromagnetiche, da parte di un analista, scaturisce da tre tipi di energia a cui sottoporre l’ analita stesso: 1. energia termica 2. energia elettrica 3. energia radiante L’ assorbimento, invece, è l’alterazione d’intensità di radiazione elettromagnetica causata dalla presenza dell’analita. Le applicazioni della spettroscopia di assorbimento rivestono notevole importanza sia in campo qualitativo che in campo quantitativo. RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA Forma di energia trasmessa nello spazio ad alta velocità. La teoria sulle radiazioni elettromagnetiche si basa sull’integrazione delle teorie onda-particella. PROPRIETA’ ONDULATORIE DELLA RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA La radiazione elettromagnetica è un’onda sinusoidale. E’ un campo di forza elettrico che oscilla con un periodo che va da 0 al massimo di ampiezza A. L’ oscillazione avviene perpendicolarmente alla direzione di propagazione dell’onda. Un campo elettrico è una quantità vettoriale e la radiazione rappresenta l’andamento, di questo vettore, nel tempo t (preso un punto fisso nello spazio). 1 Rappresentazione di un raggio di radiazione monocromatica polarizzata nel piano. (a)Campi elettrico e magnetico ad angolo retto l’uno con l’altro e con la direzione di propagazione. (b)Rappresentazione bidimensionale del vettore elettrico. PARAMETRI D’ONDA Periodo (P): tempo intercorso tra un massimo d’onda e il successivo Frequenza (): numero di oscillazioni in 1 secondo; è il reciproco del periodo e dipende dalla sorgente di radiazione. Velocità di propagazione ( vi ): è funzione della densità del mezzo e della frequenza Lunghezza d’onda () :distanza lineare tra massimi e minimi di un’onda. Angstrom ( A ): unità di misura della lunghezza d’onda ed equivale a 10 10 m Numero d’onda ( v ): è definito come il reciproco della lunghezza d’onda e rappresenta il numero di onde per cm. Intensità (I): potere radiante per unità di angolo solido. 2 PROPRIETA’ PARTICELLARI DELLA RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA Si basa sul postulato che la radiazione elettromagnetica sia costituita da “pacchetti” discreti d’energia chiamati fotoni o quanti. L’energia del fotone dipende dalla frequenza della radiazione ed è data da: E h*v dove h è la costante di Planck ( 6.63 10 34 J*s). Possiamo correlare l’energia della radiazione alla lunghezza d’onda e al numero d’onda: E h*c h*c*v dove c è la velocità della luce nel vuoto. Si noti come il numero d’onda, analogamente alla frequenza, sia direttamente proporzionale all’energia. SPETTRO ELETTROMAGNETICO 3 MISURA DELL’ASSORBIMETO E’ la misura delle interazioni tra radiazione e le pareti della cella contenente la soluzione da analizzare. La perdita di potere radiante per riflessione; nell’interfaccia aria-vetro equivale circa al 4%. L’assorbanza di una soluzione è definita dall’equazione: A log 10 T log P0 P tale legge è nota come legge di Beer. I limiti di tale legge sono rappresentati da deviazioni strumentali e da deviazioni chimiche(dipendenti da variazione di concentrazione). Per concentrazioni minori a 0.01M le interazioni legate alla concentrazione, portano all’alterazione delle assorbanze specifiche molari, con il risultato di ottenere rette non lineari. L’aumento della concentrazione porta all’aumento dell’indice di rifrazione che è un fattore principale dell’assorbanza. Deviazioni apparenti della legge di Beer si osservano quando un analita si associa, si dissocia, o reagisce con un solvente per dare un prodotto che ha uno spettro di assorbimento diverso da quello dell’analita. Un comune esempio di questo comportamento è riscontrabile in soluzioni acquose di indicatori acido/base. ESERCIZIO Le assorbanze specifiche molari dell'acido debole Hln (Ka = 1.42 10 5 )e la sua base coniugata In a 430 nm e a 570 nm sono state determinate per mezzo di misure delle soluzioni fortemente acide o fortemente basiche dell'indicatore (condizioni in cui essenzialmente tutto l'indicatore era nelle forme Hln e In , rispettivamente). I risultati furono i seguenti 470 570 HIn 6.3 10 2 7.12 10 3 In 2.06 10 4 9.60 10 2 4 Derivate i dati di assorbanza(celletta di 1 cm)alle due lunghezze d’onda per le soluzioni non tamponate con concentrazioni totali di indicatore che variano da 2 10 5 a 1610 -5 M. Calcoliamo le concentrazioni molari di [HIn] e [ In ] in una soluzione in cui la concentrazione totale dell’indicatore è 2.0010-5 M. Valgono HIn H In e Ka=1.4210-5 =[H+]*[In-]/[HIn] Dall’equazione del processo di dissociazione si ricava [H+]=[In-] Inoltre la somma delle concentrazioni delle due specie dell’indicatore deve uguagliare la concentrazione totale molare dell’indicatore. Così, [HIn] + [In-] = 2.0010-5 La sostituzione di queste relazioni nell’espressione per Ka porta alla seguente espressione In 2.00 10 5 In 1.42 10 5 Un riarrangiamento porta all’espressione quadratica [ In ] 1.42 10 5 [ In ] 2.84 10 10 0 La soluzione positiva di questa equazione è [In-] = 1.1210-5 [HIn] = 2.0010-5 – 1.1210-5 = 0.8810-5 Siamo ora in grado di calcolare le assorbanze alle due lunghezze d’onda. 5 A = HIn b[HIn] + In- b[In-] A430 6.30 10 2 *1.00 * 0.88 10 5 2.06 10 4 *1.00 *1.12 10 5 0.236 Analogamente a 570 nm, A570 7.12 103 *1.00 * 0.88 10 5 9.60 10 2 *1.00 *1.12 10 5 0.073 E’ ora possibile tracciare un grafico che dimostra l’andamento delle curve di assorbanza alle due lunghezze d’onda considerate come si può ben notare, all’aumentare della concentrazione dell’indicatore, le curve assumono un andamento non lineare, specialmente alla lunghezza d’onda di 570 nm. Sono imputabili monocromatiche. DEVIAZIONI STRUMENTALI a strumenti incapaci di produrre radiazioni PROCESSO DI ASSORBIMENTO Dal momento che gli elettroni danno salti discreti di energia, e che il loro numero è limitato, l’assorbimento avviene solo se l’energia del fotone è 6 uguale o maggiore alla differenza di energia tra stato fondamentale e stato eccitato. Passando dagli atomi alle molecole i livelli energetici aumentano e gli spettri di assorbimento sono più complessi. CURVE SPETTRALI Uno spettro di assorbimento riporta in ascissa le lunghezze d’onda() e in ordinata le assorbanze, le trasmittanza o il log delle assorbanze, rispettivamente rappresentati nelle figure (a), (b), (c). Gli spettri espressi in trasmittanza (a), danno una maggiore risoluzione, mentre quelli espressi in funzione dell’assorbanza (b) sono meno evidenti. Gli spettri espressi in funzione del log delle assorbanze (c), dette anche estinzioni, si presentano più piatti rispetto a quelli rappresentati in funzione delle trasmittanze, come pure rispetto a quelli espressi in funzione delle assorbanze. 7 RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA Atomi, ioni, molecole hanno un numero limitato di livelli energetici discreti e quantizzati. Lo stato fondamentale rappresenta il livello energetico più basso occupato dagli elettroni, invece lo stato eccitato rappresenta un livello energetico più alto; tale stato è più instabile. Quando l’elettrone torna ad uno stato energetico inferiore o allo stato fondamentale si genera uno stato di emissione o decadimento. Lo spettro di emissione rappresenta l’energia emessa da una sostanza in funzione di e varia da sostanza in sostanza. Lo spettro di emissione di atomi eccitati si presenta come una banda discontinua meglio nota come spettro a righe; lo spettro di emissione di molecole eccitate, invece, si presenta come una banda a righe ravvicinate. Ciò si spiega per il fatto che l’energia totale di una molecola è il risultato della somma di energie di varia natura: Etot = Eelettronica + Evibrazionale + Erotazionale Lo spettro di una sostanza solida incandescente si presenta come una banda continua. Le caratteristiche dello spettro di emissione è un utile indice per l’identificazione delle sostanze in esame. ASSORBIMENTO Una sostanza in un mezzo trasparente sposta in modo selettivo alcune frequenze delle radiazioni elettromagnetiche. Il fotone assorbito trasforma una sostanza M nella forma eccitata M*. L’energia assorbita si libera sotto forma di calore in 10-8-10-10 secondi. Per decomposizione fotochimica della forma eccitata M* è possibile la formazione di prodotti secondari con l’emissione di radiazioni particolari, incluse nella fascia del visibile, e l’instaurarsi di fenomeni quali la fluorescenza o la fosforescenza. 8 LEGGE DI BEER Misura l’assorbimento, calcolando la diminuzione dell’intensità di un fascio di radiazioni per interazione con sostanze assorbenti nel suo cammino ottico. Un fascio monocromatico di radiazioni di potere radiante P0 si attenua attraversando una soluzione di 1litro di concentrazione c. La variazione subita è -P = k*P0*N in cui P0 è il potere radiante incidente, k è una costante, N è la variazione continua. La figura sopra rappresenta schematicamente, nell’apparato sperimentale, l’attenuazione della radiazione con potenza iniziale P0 ad opera della soluzione contenente c mol/l di un soluto assorbente e un cammino ottico di lunghezza b cm(P<P0). Espressione dell’assorbanza è, come già discusso in precedenza, la legge di Beer A = log P0 b*c P in cui è l’assorbanza specifica molare, b è il cammino ottico in cm, c è la concentrazione mol/l della soluzione. Volendo calcolare l’assorbanza di più sostanze è necessario effettuare la sommatoria delle singole assorbanze Atot = A1 + A2 + A3 + … + Ai = 1*b1*c1 + 2*b2*c2 + 3*b3*c3* + … + i*bi*ci 9 TERMINOLOGIA DELLA AMERICAN SOCIETY FOR TESTING MATERIALS Trasmittanza (T): T P P0 P0 P Assorbanza specifica molare o coefficiente di estinzione molare Assorbanza (A) o Estinzione (E): A log A (): b*c A k Assorbanza specifica o coefficiente di estinzione (k): b*c La trasmittanza è la porzione di radiazione incidente che viene trasmessa dalla soluzione e viene espressa in % . ESERCIZIO Una soluzione di KMnO4, 7.510-5 M, ha una assorbanza A=0.439. Usando una cella di spessore di 1 cm, =525, calcolare la trasmittanza % T La trasmittanza è uguale a l'assorbanza è A log P P0 P0 P è evidente che nell’espressione dell’assorbanza compare il reciproco della trasmittanza, dunque A log 1 T effettuando i dovuti calcoli, sfruttando i dati del testo, si ricava che 1 1 2.748 T 0.364 *100 36.4% T 2.748 10 ASSORBIMENTO UV-VIS E’ riferito all’energia dei salti elettronici che in definitiva è l’energia maggiore. Ad ogni spettro UV, di qualunque stato elettronico di una molecola, corrisponde uno stato di energia vibrazionale e di energia rotazionale; per questo motivo il risultato dello spettro UV-VIS di una molecola consiste in una o più bande spettrali. Grazie alle misure di assorbimento è possibile effettuare analisi quantitative e qualitative di numerose molecole organiche. COMPOSTI ORGANICI L’assorbimento di radiazioni da parte di composti organici per valori di lunghezza d’onda compresi tra 180 e 780 nm, deriva da interazioni tra fotoni ed elettroni che partecipano direttamente ad un legame o che sono localizzati attorno ad eternatomi come N, O, S, Cl. I singoli legami(es. C-C, C-H) assorbono raggi UV, detti UV del vuoto, con lunghezze d’onda minori a 180 nm; i legami doppi, tripli e i doppietti non condivisi sono legati più debolmente e sono perciò più facilmente eccitati dalle radiazioni. Gruppi funzionali insaturi organici che assorbono nelle regioni UVVIS sono noti come cromofori. Si riporta nella figura a lato un tipico esempio di spettro effettuato con radiazioni UV. COMPOSTI INORGANICI 11 In generale, gli ioni e i complessi degli elementi delle prime due serie di transizione assorbono bande ampie di radiazioni visibili in almeno uno dei loro stati di ossidazione e sono, di conseguenza, colorati. In tal caso l’assorbimento comporta transizioni fra orbitali d pieni e vuoti, con energie che dipendono dai legami che complessano gli ioni metallici. Le differenze di energia fra questi orbitali d (e così la posizione del corrispondente picco di assorbimento) dipendono dalla posizione dell’elemento nella tavola periodica, dal suo stato di ossidazione, e dalla natura degli elementi. Gli spettri di assorbimento degli ioni delle serie di transizione di lantanidi e attinidi differiscono da quelli degli altri elementi metallici di transizione; gli elettroni responsabili dell’assorbimento sono schermati dalle influenze esterne da elettroni che occupano orbitali con numero quantico principale maggiore. Come risultato, le bande tendono ad essere più strette e relativamente non influenzate dalle specie coinvolte nei legami con elettroni esterni (fig. a seguire). a) c) b) d) STRUMENTI TIPICI PER MISURE DI ASSORBIMENTO Gli strumenti usati sono composti da: 1. sorgente stabile di energia 2. selettore di lunghezza d’onda 3. contenitori trasparenti per il campione 4. rivelatore(trasduttore di energia in segnale elettrico) 5. dispositivo di lettura 12 La sorgente luminosa deve avere alcune caratteristiche molto importanti: 1. intensità sufficiente 2. radiazione continua 3. uscita stabile Per esperienze di spettroscopia di assorbimento nel UV le lampade utilizzate sono quelle ad idrogeno e a deuterio(figura a sinistra) che hanno lunghezze d’onda che vanno da 180 nm fino a valori superiori a 375 nm. In queste lampade i gas devono trovarsi allo stato gassoso ed in stato eccitato,tramite scarica elettrica tra i due elettrodi. Per quanto riguarda, invece, il campo del visibile, le lampade utilizzate sono al tungsteno(figura a destra) che emettono luce con lunghezza d’onda compresa tra 320 e 2500 nm. L’inconveniente di queste lampade è che l’intensità del fascio emesso in uscita è soggetto a variazioni dovute a sbalzi di tensione; per ovviare a questo problema è opportuno, dunque, l’utilizzo di stabilizzatori che mantengano la tensione costante su un valore di circa 6V.Per controllare e selezionare la lunghezza d’onda è necessario l’utilizzo di strumenti atti al restringimento del rang delle lunghezze d’onda. I vantaggi di queste tecniche sono: 1. riconducibilità alla legge di Beer 2. abbattimento delle interferenze 13 3. aumento della sensibilità In base alla larghezza di banda , viene espressa la % di trasmittanza. Nel grafico, riportato di seguito, si noti la curva A con una banda di 50 nm, mentre la curva B ha una banda di 10 nm. Nel caso della curva B l’altezza diventa maggiore di circa 3 volte. Per migliorare la qualità delle radiazioni utilizzate in spettroscopia, si utilizzano filtri di assorbimento, che eliminano radiazioni con lunghezze d’onda di 30-250 nm. I filtri più economici sono quelli di vetro che emettono bande che coprono in campo del visibile. Esistono, inoltre, filtri che emettono bande strette e assorbono essi stessi un 10% del raggio incidente. Un altro filtro utilizzato è quello di tipo cut-off che ha valori di trasmittanza pari al 100% nel visibile e 0% nel 14 resto dello spettro. Nella figura a lato è riportata: (a) la sezione trasversale schematica di un filtro ad interferenza, (b) lo schema che dimostra le condizioni di interferenza costruttiva su cui di basa il meccanismo di filtrazione e correzione della lunghezza d’onda del raggio incidente. La radiazione attraversa il primo strato ed è in parte riflessa. Un’altra parte passa attraverso lo strato di dielettrico e incontra il secondo strato. Il raggio subisce una ulteriore riflessione, creando così una maggiore selettività. Le nuove radiazioni che passano attraverso il filtro incontrano le altre: se sono in fase con esse, vengono rafforzate, mentre se sono fuori fase sono annullate. La trasmittanza di questo tipo di filtri è del 1.5%. MONOCROMATORI I monocromatori sono in generale di due tipi, uno dei quali impiega un reticolo per disperdere la radiazione nelle sue lunghezze d’onda componenti; l’altro utilizza un prisma per lo stesso scopo. I primi strumenti spettroscopici erano del tipo a prisma. Attualmente comunque, quasi tutti i monocromatori commercialmente disponibili sono basati su reticoli a riflessione in quanto sono meno costosi dei prismi e rendono possibile la progettazione di strumenti più 15 compatti e più semplici. La Figura a destra mostra il disegno di un tipico monocromatore a reticolo. La radiazione emessa da una sorgente arriva sul monocromatore attraverso una stretta fenditura rettangolare. La radiazione è poi collimata da uno specchio concavo, dispositivo che produce un raggio parallelo il quale a sua volta colpisce la superficie di un reticolo a riflessione. La dispersione angolare è il risultato della diffrazione che si ha sulla superficie riflettente. Le due lunghezze d’onda sono focalizzate da un altro specchio concavo sul piano focale del monocromatore, dove appaiono come due immagini della fenditura di ingresso, una per 1 e l’altra per 2. Ruotando il reticolo, sia 1 che 2 possono essere focalizzate sulla fenditura di uscita del monocromatore. Nei monocromatori a prisma, invece, la dispersione della radiazioni è prodotta da un prisma di materiale birifrangente (calcite) sfaccettato a 60°, in modo che la radiazione entri ed esca dalla stessa faccia. Le radiazioni incidenti oltre l’angolo limite sono annullate per riflessione(vd. Figura a sinistra). CONTENITORI PER CAMPIONI I contenitori per il campione che sono usualmente chiamati cellette o cuvette, devono avere finestre costruite con un materiale trasparente nella regione spettrale di interesse. Quarzo, o silice fusa, è richiesto per la regione ultravioletta (sotto 50 nm) e può essere usato nella regione visibile e fino a circa 3000 nm nel1’infrarosso. A causa del suo basso costo, il vetro silicato è generalmente usato nella regione fra 375 e 2000 nm. Anche i contenitori di plastica hanno trovato applicazione nella regione visibile. Il più comune materiale trasparente per gli studi nell’infrarosso è il cloruro di sodio cristallino. Le migliori cellette hanno finestre che sono normali alla direzione del raggio per minimizzare le perdite dovute alla riflessione. La lunghezza di celletta più comune per gli studi nelle regioni ultravioletta e visibile è 1 cm. Possono essere acquistati anche altri cammini ottici, da quelli inferiori a 0,1 cm fino a 10 cm. Per ragioni di economia, talvolta si utilizzano cellette cilindriche. Occorre una attenzione particolare per replicare la posizione di tali cellette rispetto al raggio; altrimenti variazioni nella lunghezza del cammino ottico 16 e perdite da riflessione alla superficie curva possono causare errori significativi. La qualità dei dati spettroscopici dipende criticamente dal modo in cui le cellette accoppiate sono usate e conservate. Impronte digitali, grasso, o altri depositi sulle pareti alterano marcatamente le caratteristiche di trasmissione di una celletta. Di conseguenza è obbligatoria la pulizia prima e dopo l’uso, ed occorre aver cura di evitare di toccare le finestre dopo che la pulizia è stata completata. Le cellette calibrate non devono essere mai seccate per riscaldamento in un forno o su una fiamma perché questo potrebbe causare un danno fisico o un cambiamento nella lunghezza del cammino ottico. Tali cellette dovrebbero essere regolarmente calibrate l’una rispetto all’altra con una soluzione assorbente. RIVELATORI E TRASDUTTORI DI RADIAZIONI Un rivelatore è un dispositivo in grado di indicare l’esistenza di un qualche fenomeno fisico. Un trasduttore è un tipo speciale di rivelatore che converte segnali, come intensità luminosa, pH, massa e temperatura in segnali elettrici che possono essere in seguito amplificati, manipolati, e finalmente convertiti in numeri proporzionali alla grandezza del segnale originale. Il trasduttore ideale per la radiazione elettromagnetica risponde rapidamente a bassi livelli di energia radiante su un ampio intervallo di lunghezze d’onda. In aggiunta, produce un segnale elettrico che è facilmente amplificato ed ha un livello di rumore relativamente basso. Infine, è essenziale che il segnale elettrico prodotto dal trasduttore sia direttamente proporzionale alla potenza P del raggio: G KP K ' dove G è la risposta elettrica del rivelatore in unità di corrente, resistenza o potenziale. La costante di proporzionalità K misura la sensibilità del rivelatore in termini di risposta elettrica per unità di potenza radiante. Molti rivelatori esibiscono una risposta piccola e costante, nota come corrente di fondo K’, anche quando nessuna radiazione colpisce la loro superficie. Strumenti con rivelatori che hanno una risposta con corrente di fondo significativa sono ordinariamente equipaggiati con un circuito compensante che permette la sottrazione di un segnale proporzionale alla corrente di fondo, per ridurre K’ a zero. Così, in condizioni ordinarie, possiamo scrivere 17 G KP Esistono vari tipi di rivelatori, ma quelli maggiormente utilizzati sono: fotocelle, rispondono fotomoltiplicatori nel (figura visibile; a tubi sinistra), consistono di un catodo e un anodo a filamento saldati in un contenitore trasparente sotto vuoto e di un diodo mantenuto ad un potenziale di 90V più elevato rispetto al catodo, sono strumenti molto sensibili e non producono radiazioni di fondo, rispondono nell’ultravioletto e nell’infrarosso; celle fotovoltaiche (o barrier-layer, figura a destra), hanno sensibilità massima a circa 550 nm, con una risposta che cade a circa il 10% del massimo a 350 e 750 nm; fototubi (figura sotto), consistono di un catodo e un anodo a filamento saldati in un contenitore trasparente sotto vuoto,molto simili ai tubi fotomoltiplicatori, ma senza diodo, producono una piccola corrente di fondo. 18 STRUMENTI OTTICI Un colorimetro è uno strumento per misure di assorbimento in cui l’occhio umano è il rivelatore. Sono richiesti uno o più standard di confronto ogni volta che lo strumento è utilizzato. Un fotometro è uno strumento fotoelettrico che può essere utilizzato per le misure di assorbimento, emissione, o fluorescenza con la radiazione ultravioletta, visibile, o infrarossa. Un fotometro si distingue perché usa i filtri di assorbimento o interferenza per la selezione delle lunghezze d’onda ed un dispositivo fotoelettrico per la misura della potenza radiante. Gli strumenti di questo tipo che sono utilizzati per le misure di assorbimento con radiazione visibile sono talvolta chiamati colorimetri fotoelettrici o anche semplicemente colorimetri. I fotometri per i metodi di assorbimento offrono i vantaggi di basso costo, semplicità, robustezza, trasportabilità, e facilità di manutenzione. Inoltre, dove non è importante (e spesso non lo è) un’alta purezza spettrale, l’accuratezza e la precisione delle misure realizzate con un fotometro possono raggiungere quelle fatte con uno spettrofotometro. Gli svantaggi dei fotometri sono la loro minore versatilità, la loro incapacità di produrre spettri interi, e la loro generalmente più ampia larghezza di banda effettiva. 19 La figura è un diagramma di un semplice fotometro a raggio singolo utilizzato per misure quantitative nella regione visibile. I fotometri di questo tipo sono ordinariamente provvisti di parecchi filtri, ciascuno dei quali trasmette una differente porzione dello spettro visibile. Un altro importante strumento utilizzato è lo spettrofotometro. In commercio sono disponibili decine di modelli prodotti da vari costruttori di strumentazione scientifica. Alcuni sono progettati soltanto per la regione spettrale del visibile. Altri hanno intervalli di lavoro che si estendono da 180 a 200 nm nella regione dell’ultravioletto attraverso l’intera regione del visibile fino a 750 o 800 nm. Alcuni modelli, infine, operano nella regione dell’ultravioletto/visibile e nel vicino infrarosso fino a 3000 nm. Si utilizzano due tipi di spettrofotometro: quello a raggio singolo e quello a doppio raggio. Gli spettrofotometri a raggio singolo sono equipaggiati con una sorgente di luce a filamento di tungsteno alimentata con un alimentatore stabilizzato. L’intensità della radiazione della lampada è sufficientemente costante da fornire dati di assorbimento riproducibili. La radiazione emessa dalla sorgente passa attraverso una fenditura fissa e giunge sulla superficie di un reticolo di diffrazione. La radiazione diffratta passa quindi attraverso una fenditura di uscita fino alla celletta del campione o del riferimento ed infine al fototubo. Il segnale elettrico amplificato dal rivelatore alimenta un contatore dotato di una scala lineare in trasmittanza percentuale; vi è anche una scala logaritmica che è calibrata in assorbanza. Gli strumenti a raggio singolo, sono più che idonei per misure di assorbimento quantitative ad una singola lunghezza d’onda. In tal caso, semplicità della strumentazione, basso costo e facilità di manutenzione costituiscono vantaggi apprezzabili. 20 Parecchi costruttori di strumentazione scientifica offrono strumenti a raggio singolo per misure sia nell’ultravioletto che nel visibile. Il valore di lunghezza d’onda inferiore per tali strumenti varia da 190 a 210 nm mentre quello superiore da 800 a 1000 nm. Tutti sono forniti di lampade intercambiabili al tungsteno e al deuterio o ad idrogeno. La maggior parte di tali strumenti impiega quali rivelatori tubi fotomoltiplicatori e reticoli quali elementi di dispersione della radiazione. Alcuni sono dotati di dispositivi digitali di lettura, altri utilizzano dei contatori. Gli spettrofotometri a doppio raggio (figura in basso) sono dotati di sorgenti luminose al deuterio/tungsteno intercambiabili, di un monocromatore a reticolo di riflessione, e di un rivelatore a fotomoltiplicatore. L’elemento che divide il fascio è un disco circolare azionato da motore, o chopper, che è diviso in tre segmenti, uno dei quali è trasparente, il secondo riflettente e il terzo opaco. Ad ogni rotazione il rivelatore riceve tre segnali, il primo corrisponde a P0 il secondo a P, e il terzo alla corrente di fondo. I segnali elettrici risultanti sono poi processati elettronicamente per dare la trasmittanza o l’assorbanza su un dispositivo di lettura. 21 MODI DI OPERARE IN SPETTROFOTOMETRIA Occorre scegliere la lunghezza d’onda opportuna, che solitamente è quella massima poiché è riconducibile alla legge di Beer. Vi sono molti fattori che influenzano il dato sperimentale dell’assorbanza e l’incremento dell’errore: 1. scelta del solvente 2. utilizzazione di standard poco puri 3. pH 4. concentrazione dell’analita 5. opportuna calibratura delle cuvette e loro pulizia 22