Interferenza dell`RNA (RNAi) in Ceanorhabditis elegans RNA

Bollettino della Comunità Scientifica in Australasia
Ambasciata d’Italia
Marzo 2003
CANBERRA
Interferenza dell'RNA (RNAi)
in Ceanorhabditis elegans
RNA interference in
Ceanorhabditis elegans
Flavia Pellerone
Flavia Pellerone
Caenorhabditis elegans è un nematode
che vive prevalentemente nel suolo ed è
comune in quasi tutto il mondo. È uno dei
metazoi più studiati e caratterizzati.
L'origine di ciascuna delle sue 959 cellule
somatiche è stata determinata ed il suo
genoma di 97MB è stato interamente
sequenziato. Questo nematode possiede
una serie di caratteristiche che lo rendono
particolarmente adatto all'analisi genetica
e molecolare. E' facilmente allevato su
piastre di terreno agarizzato seminate con
batteri di cui si nutre ed ha un ciclo vitale
di soli tre giorni alla temperatura di 25ƒC.
Grazie alla sua trasparenza alla luce si
presta alla microscopia ottica e possiede,
inoltre, l'abilità di produrre progenie
clonali da ermafroditi che si possono
incrociare con vermi di sesso maschile. C.
elegans costituisce inoltre un eccellente
organismo modello per gli studi
neurobiologici dal momento che possiede
un sistema nervoso ben caratterizzato per
quanto riguarda il numero e la posizione
dei suoi neuroni. Tutte queste
caratteristiche fanno di questo nematode
uno strumento di ricerca estremamente
prezioso per investigazione di molti
processi biologici. Inoltre, C. elegans
rappresenta un utile modello ed un
eccellente punto di partenza per la ricerca
in altri nematodi dal momento che
condivide numerosi processi biologici
con nematodi parassiti.
Caenorhabditis elegans is a small,
soil-dwelling nematode common in
most parts of the world. It is one of
the best studied and characterised
metazoan organisms. The lineage of
each of its 959 somatic cells has been
established and its 97 Mb genome
has been sequenced. This nematode
is well suited to genetic and
molecular research for a number of
reasons. It can be conveniently
grown on small agar plates seeded
with bacteria and has a life cycle of
only three days at 25 ºC. It has
amenable
characteristics
for
microscopy and the ability to
produce clonal progeny from
hermaphrodites and to cross them
with male worms. This nematode
also provide an excellent model for
neurolobiological studies since it has
an exceptionally well defined
nervous system in terms of the
number and location of neurons. For
all this reasons, it represents an
invaluable
research
tool
for
investigating
many
biological
processes. Moreover C. elegans is a
useful model and a very good
starting place for other nematode
research particularly given that a
number of key biological processes
appear to be conserved between C.
elegans
and
many
parasitic
nematodes.
Recentemente, C. elegans è diventato il
Recently C. elegans became the first
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primo metazoo ad avere il genoma
interamente sequenziato. Inoltre si deve a
studi condotti su questo nematode la
prima evidenza che il dsRNA e' in grado
di indurre silenziamento genico. Questo
fenomeno, conosciuto come interferenza
dell'RNA
(RNAi),
comporta
la
degradazione
specifica
dell'RNA
messaggero in risposta all'introduzione di
RNA a doppio filamento (dsRNA) nelle
cellule. In natura, è possibile che l'RNAi
svolga un ruolo protettivo del genoma da
situazioni di instabilità causate da
transposoni e sequenze ripetute, e
potrebbe anche costituire parte di un
ancestrale meccanismo di difesa nei
confronti di attacchi virali.
L'attuale modello esplicativo del
meccanismo d'azione dell'RNAi include
una fase iniziale durante la quale il dsRNA
è progressivamente digerito da una
nucleasi con la conseguente produzione di
frammenti a doppio filamento lunghi 2125 nucleotidi. Questi piccoli frammenti
vengono indicati come short interfering
RNAs (siRNA). Un possible candidato al
ruolo di nucleasi del dsRNA e' stato
recentemente identificato in Drosophila e
chiamato 'Dicer'. I siRNAs vengono
incorporati in un complesso proteico,
chiamato il complesso di silenziamento
indotto dall'RNA (RISC), e funzionano
come sequenza guida per la degradazione
specifica del mRNA.
metazon to have its genome
sequenced and it was from work on
this nematode that the first evidence
that dsRNA could lead to gene
silencing was provided. This
phenomenon, known also as RNA
interference (RNAi), involves the
sequence-specific degradation of
mRNA in response to exogenous
double-stranded RNA (dsRNA). In
nature, RNAi may be involved in
protecting the genome against
instabilities caused by transposons
and repetitive sequences, and may
also form part of an ancient antiviral
response or protection mechanism.
L'RNAi può essere indotta in C. elegans
in tre modi relativamente semplici: a)
attraverso l'iniezione di dsRNA nelle
gonadi dei vermi, b) immergendo i vermi
in una soluzione di dsRNA (soaking
method), oppure c) attraverso la
somministrazione ai vermi di batteri
contenenti plasmidi in grado di produrre
RNAi can be induced in C. elegans
in three relatively simple ways: a)
injection of dsRNA into the worm
gonads, b) soaking the worms in
dsRNA solution or c) feeding the
worms engineered bacteria producing
dsRNA. dsRNA administered to
worms can permeate and affect the
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The current model of the RNAi
mechanism include an initiation step
where the dsRNA is progressively
cleaved into 21-25 nucleotide long
double stranded fragments by a
nuclease. These small fragments are
referred to as short interfering RNAs
(siRNA). A possible candidate for a
dsRNA nuclease has been identified
in Drosophila and termed 'Dicer'.
The siRNAs are incorporated into a
protein complex, called the RNAinduced silencing complex (RISC),
and act as a guide sequence to target
specific mRNA degradation.
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dsRNA. Il dsRNA somministrato ai
vermi attraverso una qualsiasi di queste
vie, ha la capacita' di propagarsi da cellula
a cellula e di indurre un' interferenza di
tipo sistemico. Tuttavia, sembra che le
cellule neuroniche siano refrattarie a
questo fenomeno probilmente a causa
della loro impermeabilita'al dsRNA.
entire body causing systemic RNAinterference. However neuronal cells
seem to be refractory to this
phenomenon most likely because
they are, at least partially,
impermeable to dsRNA.
In seguito alla pubblicazione dell' intera
sequenza genomica di C. elegans, l'
RNAi è diventata lo strumento di "reverse
genetic" più impiegato in questo
organismo tanto da essere stato utilizzato
in un considerevole numero di studi
condotti anche su grande scala. Questa
tecnica rappresenta uno strumento
particolarmente veloce e potente di
identificazione di fenotipi caratterizzati da
perdita di funzione parziale o totale che
contribuiscono alla determinazione del
ruolo funzionale dei geni. In particolare,
questo strumento di genetica inversa,
semplifica enormemente lo studio della
funzione di geni cosiddetti "orfani" in
nematodi e anche la ricerca di nuovi
targets per lo sviluppo di antinematocidi.
Sebbene molto efficace e affidabile,
questa tecnica presenta alcuni limiti che
vanno tenuti in considerazione. Uno degli
inconvenienti principali è rappresentato
dalla ridondanza di alcuni geni. Molti
geni, infatti, appartengono a famiglie
geniche e svolgono funzioni simili.
Pertanto membri della stessa famiglia
possono compensare per la perdita di
funzione di geni affini. Questa
limitazione può pero'essere evitata
identificando segmenti di RNA specifici
per il gene d'interesse. Inoltre, sembra che
alcuni tessuti o stadi vitali non siano
suscettibili all'RNAi.
With the complete genomic sequence
of C. elegans available, RNAi has
become the dominant reverse
genetics tool in this organism and
several large-scale studies using
RNAi are currently underway. This
technique represents a particularly
fast and potent means of identifying
partial or complete loss-of-function
phenotypes, possibly leading to the
identification of gene function. In
particular this reverse genetic tool
has the potential to simplify the
investigation of the functions of
"orphan" genes in nematodes and
also the search for new antinematode
drug targets.
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Although very effective and reliable,
this technique exhibits some limitations
that have to be taken into account. One
of the main problems is represented by
gene redundancy. Many genes belong
to families sharing common functions
and members of the same family can
compensate for the loss of function of
related genes. Another valid concern is
the possibility of cross interference with
closely related genes. However this
limitation can be easily avoided
identifying RNA segments that are
unique to a gene of interest. Also, it
appears that some tissues or stages are
not susceptible to RNAi.
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Negli ultimi anni una crescente attenzione
è stata rivolta alla possibilità di usare il
dsRNA come agente terapeutico. Tale
interesse e' stato generato soprattutto
dall'idea che l' RNAi può essere usata per
bloccare l'espressione di geni anomali.
L'impiego di acidi nucleici come agenti
terapeutici e' attualmente sotto indagine.
Diverse prove cliniche che impiegano
acidi nucleici sono attualmente in corso
per valutare la sicurezza e l'efficacia di
questa strategia terapeutica. Tuttavia
alcuni problemi ritardano i progressi in
questo campo; tra questi l'ottimizzazione
del sistema di somministrazione degli
acidi nucleici in specifici compartimenti
cellulari
During the past few years an
increasing attention has been turned
to the possibility of using dsRNA as
therapeutic agent. Much of this
interest stems from the idea that
RNAi can be used for blocking the
expression of abnormal genes. Some
nucleic acid therapies are currently
undergoing clinical trials to evaluate
the safety and efficacy of this
therapeutic strategy. However many
problems hold up progress in the
field such as the optimisation of
molecular delivery to targeted cells
compartments and the improvement
of RNA hybridisation specificity.
Dr Flavia Pellerone
School of Biochemistry & Molecular
Biology
Faculty of Science
Australian National University
Canberra ACT 0200 Australia
Email: [email protected]
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Original version in English
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