Relazione/Pubblicazioni

Relazione sull'avanzamento della ricerca
Dottorato di Ricerca in Medicina Sperimentale - XXVIII ciclo
Dottoranda: Giulia Cacciotti
Supervisore: Prof. Guido Antonelli
Interferon and West Nile virus infection
A causa delle mutate condizioni climatiche e di diversi fattori antropici, nell’ultimo decennio il numero di
infezioni virali trasmesse da animali all’uomo è aumentato sensibilmente a livello mondiale. Tra i vettori
coinvolti nel ciclo di trasmissione dei virus appartenenti alla famiglia Flaviviridae riconosciamo alcune
specie di zecche ed un vasto numero di specie di zanzara appartenenti al genere Culex, così come osservato
nel caso del virus dell’encefalite giapponese (JEV), del virus USUTU (USUV) e del virus West Nile (WNV),
tutti e tre appartenenti al complesso antigenico dell' encefalite giapponese. WNV è un arbovirus isolato, per
la prima volta, in Uganda nel 1937 dal sangue di una donna affetta da sindrome acuta febbrile. WNV si è
ampiamente diffuso in Europa, Africa, Australia ed Asia e, dal 1999, anche negli USA, Canada, Messico e
Caraibi. Ad oggi sono descritte 8 varianti di WNV; tra queste le più diffuse sono: il lineage 1, più diffuso e
patogeno, ed il lineage 2, apparentemente meno patogeno, ma probabilmente responsabile di diversi focolai
epidemici, come quello verificatosi in Grecia nel 2010 ed in Romania nel 2012-2013. Diversi studi in vitro
hanno dimostrato che gli interferon (IFN) di tipo I, II e III giuocano un ruolo decisivo nella risposta
immunitaria di tipo innato nei confronti di WNV. In seguito ad infezione con WNV la cellula attiva diversi
pathways che portano alla sintesi di IFNs che verranno successivamente secreti e riconosciuti dalla stessa
cellula, nonché dalle cellule circostanti mediante il legame dell’IFN al recettore cellulare specifico; tale
evento attiva la via di trasduzione del segnale JAK-STAT, e la conseguente produzione di centinaia di
proteine IFN-indotte responsabili dell’attività antivirale e immunomodulatoria. Tra queste annoveriamo la
ISG-15 implicata, con il suo meccanismo ciclico di “ISGylation”, in diverse attività biologiche dirette verso
proteine bersaglio sia virali che cellulari. Diversi studi hanno dimostrato come tale proteina sia in grado di
interferire con la replicazione di JEV, per cui risulta plausibile che ISG15 possa esercitare un ruolo attivo
anche nella risposta immunitaria diretta contro WNV. Tuttavia è stato dimostrato come, nel corso
dell’evoluzione, WNV abbia sviluppato meccanismi di evasione dal sistema interferon sia per quanto
riguarda il segnale di trasduzione che l’azione di alcune proteine regolate da IFN.
Alla luce di queste considerazioni nel corso del mio dottorato in Medicina Sperimentale –XXVIII ciclo, la
mia attività di ricerca sarà rivolta principalmente a:
i)
valutare, in vitro, la sensibilità del WNV alle preparazioni di IFN di tipo I e III, comparando
altresì differenze tra WNV1 e WNV2, USUV in cellule di carcinoma umano (A549) e in cellule
di neuroblastoma umano (SK-N-SH);
ii)
valutare, in vitro, l’ induzione di IFN di tipo I e III e l’espressione di geni IFN indotti inseguito
ad infezione da WNV1 e WNV2, USUV in cellule dendritiche umane;
iii)
valutare, in vivo, l’espressione della proteina ISG15 nei sieri raccolti da pazienti con infezione da
WNV durante le due maggiori epidemie europee (Grecia 2010 e Romania 2012-2013).
Nel corso del I e del II anno, la mia attività di ricerca è stata indirizzata a valutare, in vitro, la sensibilità del
WNV1 e del WNV2 all’azione antivirale delle preparazioni di IFN di tipo I e III. I risultati ottenuti mostrano
che entrambe i lineage di WNV analizzati sono sensibili all’attività antivirale degli IFN di tipo I e III anche
se in misura minore rispetto a USUV (p<0.05). In particolare, gli IFN di tipo I possiedono nei confronti dei
due lineage di WNV un’attività antivirale maggiore rispetto agli IFN di tipo III, l’IFN beta, infatti, alla
concentrazione di 5ng/ml è in grado di ridurre del 100% il titolo virale di entrambe i WNV analizzati, mentre
l’IFN alfa, sempre nella concentrazione di 5 ng/ml, inibisce la replicazione di WNV2 del 100% e quella di
WNV1 solo del 60%. Sono attualmente in corso esperimenti per valutare l’attività antivirale degli IFN di tipo
I e III post infezione. Il secondo obiettivo era rivolto a valutare i livelli di induzione di IFN e di proteine IFN
indotte in cellule dendritiche umane in seguito ad infezione con WNV1, WNV2 e USUV. In prima analisi,
abbiamo confermato la capacità di WNVs (lineage 1 e lineage 2) di replicare in cellule dendritiche umane e
per la prima volta abbiamo dimostrato che anche USUV è in grado di farlo. Abbiamo osservato che le
cinetiche di replicazione dei due lineage di WNV sono simili, mentre USUV ha mostrato un cinetica di
replicazione anticipata. Nonostante USUV abbia una cinetica di replicazione più veloce di entrambe i lineage
di WNV possiamo notare che la resa virale dei tre diversi virus è paragonabile. Pertanto una maggiore
velocità di replicazione di USUV rispetto al WNV non è legato ad una maggiore efficienza di replicazione
nelle DC. Dai risultati emerge una maggiore attività antivirale nel surnatante delle cellule dendritiche
infettate con USUV rispetto a quelle infettate con i due lineage di WNV (p<0.05). Nessuna differenza
significativa, in termini di induzione di attività antivirale, è stata riscontrata confrontando i surnatanti delle
cellule dendritiche infettate con i due diversi lineage di WNV analizzati. Interessantemente abbiamo notato
che diminuendo la MOI da 1 a 0,1 e 0,01 aumenta l’attività antivirale presente nel surnatante delle DC
infettate con i due lineage di WNV, pur restando però inferiore a quella indotta da USUV. La ridotta quantità
di attività antivirale indotta da WNVs rispetto a quella indotta da USUV potrebbe essere attribuita alla
capacità WNVs di sopprimere l'induzione di IFN. La presenza di una minore induzione di attività antivirale
nelle DC infettate con WNVs rispetto a quelle infettate con USUV è stata confermata analizzando anche la
concentrazione di IFN alfa. Non sono stati osservati livelli rilevabili di IFN alfa nei surnatanti delle DC
infettate con entrambe WNV a MOI 1, mentre nelle DC infettate con entrambe WNVs a MOI inferiori a 1
(0,1 e 0,01) sono stati osservati livelli rilevabili di IFN alfa 48 ore dopo l'infezione. Tali livelli sono
comunque inferiori a quelli riscontrati in seguito ad infezione con USUV (p<0.05). Dall’analisi
dell’espressione di alcuni geni IFN indotti, i nostri risultati indicano che sia WNV1 che WNV2 inducono
livelli di ISG56 paragonabili a quelli indotti da USUV che sono significativamente più elevati rispetto al
controllo. Al contrario entrambi i lineage di WNV inducono nelle DC livelli più bassi di ISG15 e HERC5
rispetto a quelli indotta da USUV pur restando superiori a quelli del controllo. Tale riduzione nei livelli di
espressione di ISG15 e HERC5 induce a pensare che questi due ISGs possano essere target dei meccanismi
di evasione evoluti dai due lineage di WNV. Alla luce di questa considerazione è attualmente in corso la
valutazione dell’espressione della proteina ISG15 nei sieri raccolti da pazienti con infezione da WNV
durante le due maggiori epidemie europee (Grecia 2010 e Romania 2012-2013). I risultati nel loro insieme
indicano che il sistema IFN è attivo, in vitro, nei confronti della replicazione virale e depongono a favore di
un suo ruolo fondamentale nella risposta all’ infezione virale.
ELENCO PUBBLICAZIONI
Scagnolari C, Caputo B, Trombetti S, Cacciotti G, Soldà A, Spano L, Villari P, Della Torre A, Nowotny N,
Antonelli G. USUTU VIRUS GROWTH IN HUMAN CELL LINES: INDUCTION OF AND
SENSITIVITY TO TYPE I AND III INTERFERONS J Gen Virol. 2013 94(Pt 4):789-95
Monteleone K, Di Maio P, Cacciotti G, Falasca F, Fraulo M, Falciano M, Mezzaroma I, D’Ettorre G,
Turriziani O, Scagnolari C. Interleukin-32 isoforms: expression, interaction with interferon regulated genes
and clinical significance in chronically HIV-1 infected patients. Med Microbiol Immunol. 2014 203(3):20716
POSTER
Cacciotti G, Selvaggi C, Ribelli G, Monteleone K, Lorenzi C, Papa MA, Pierangeli A, Antonelli A,
Scagnolari C. “Characterization of the role of type I and III Interferon response during West Nile Virus and
Usutu Virus infection” Interferon Fundamentals 2014 - From Molecular Mechanisms to Human Disease",
Istituto Superiore di Sanità, Rome, Italy 20 Febbraio 2014.
Cacciotti G, Selvaggi C, Ribelli G, Monteleone K, Lorenzi C, Papa MA, Pierangeli A, Antonelli A,
Scagnolari C. “Characterization of the role of type I and III Interferon response during West Nile Virus and
Usutu Virus infection” ECCMID Barcellona 10-13 Maggio 2014.
Monteleone K, Selvaggi C, Cacciotti G, Ribelli G, Fraulo M, D’Ettorre G, Turriziani O, Vullo V, Antonelli
G, Scagnolari C. “MicroRNA-29 family: expression, interaction with antiviral immune response and clinical
significance in HIV-1-infected patients” ICAR Roma 25-27 Maggio 2014.
Cacciotti G, Capito B, Diallo D, Ceianu C, Nowotny N, Antonelli G, Scagnolari C. “Characterization of
antiviral innate immune response during mosquito-borne USUTU virus infection. Symposium of the Institut
Pasteur International Network, Paris, September 10-13, 2014.