La risposta immunitaria di tipo umorale

La risposta immunitaria di tipo
umorale
Linfociti B, Plasmacellule ed Anticorpi
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L’IMMUNITA’ UMORALE
(mediata da anticorpi)
Questo tipo di immunità protegge dagli
antigeni circolanti, quali:
•
batteri extracellulari
•
esotossine microbiche
•
virus nella fase extracellulare
ANTICORPI
Gli anticorpi, o immunoglobuline, sono glicoproteine che
possono esistere sia in forma legata alla membrana dei linfociti
B, dove fungono da recettori per l’antigene (BCR), che in forma
solubile.
Gli anticorpi solubili circolano nel sangue e sono presenti nelle
secrezioni dove svolgono la funzione effettrice dell’immunità
umorale neutralizzando ed eliminando i microbi e le loro tossine.
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Migrazione elettroforetica dei componenti del siero
(albumina e globuline ,  e )
la linea tratteggiata è il profilo elettroforetico prima dell'immunizzazione;
la linea continua rappresenta la migrazione elettroforetica del siero ottenuta dopo l'immunizzazione.
STRUTTURA DEGLI ANTICORPI
L’anticorpo è costituito da due catene pesanti e da due catene
leggere.
Sia le catene pesanti che le catene leggere possiedono alcune
regioni simili in molti anticorpi (regioni costanti) ed una regione
che è propria di ciascuna molecola di anticorpo (regione
variabile).
Le regioni variabili conferiscono all’anticorpo la specificità per
l’antigene e legano direttamente l’antigene.
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Esistono cinque tipi di catene pesanti diverse per la regione
costante.
Gli
anticorpi
che
contengono
catene
pesanti
differenti
appartengono ad un diverso isotipo o classe: i cinque isotipi
sono denominati IgM, IgD, IgG, IgE e IgA.
I vari isotipi si differenziano per le caratteristiche biologiche e le
funzioni effettrici.
Isotipo di IgG: tipo di catena pesante in essa presente
Idiotipo: porzione dei frammenti Fab della immunoglobulina che
interessa la reattività con l'epitopo dell'Ag.
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ANTICORPI CHIMERICI e UMANIZZATI
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Alcune caratteristiche e ruolo delle classi Ig nella difesa dell'ospite
IgM : ca 5% caratteristici della risposta primaria; nel siero sono sotto forma
pentamerica; fissano efficacemente le proteine del complemento, agglutinazione
di batteri, opsonine.
IgD : <1% espresse come immunoglobuline di membrana
IgG : 85% indicano (anche) riesposizione all’antigene; nel siero sono in forma
monomerica; antitossine, opsonine, fissano efficacemente il complemento;
neutralizzazione dei virus nel sangue; possono attraversare la barriera
placentare (protezione del feto e del neonato); sono suddivise in sottotipi.
IgE : mediano le risposte allergiche (ipersensibilità di tipo I) e asmatiche,
antiparassitarie (induzione della degranulazione dei mastociti e opsonizzante per
gli eosinofili).
IgA: 10-15% dimeriche; si trovano in elevata concentrazione nelle secrezioni
mucose, prevengono l'adesione batterica alle membrane mucose, antivirali,
antitossine.
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CINETICA DELLA RISPOSTA
ANTICORPALE
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CINETICA DELLA RISPOSTA ANTICORPALE VERSO
ANTIGENI TD
Risposta immunitaria primaria
In seguito a una prima immunizzazione con un antigene, si osserva una
lag fase, durante la quale non si riscontrano, nel siero di un soggetto,
anticorpi specifici per quell’antigene. Dopo questa fase, l’antigene viene
riconosciuto, processato e presentato alle cellule T appropriate, che a
loro volta, sono state attivate, hanno proliferato e si sono differenziate
in linfociti TH maturi e attivati. Tali linfociti TH possono allora aiutare la
completa attivazione dei linfociti B in plasmacellule producenti anticorpi.
Solitamente dopo 7-10 giorni nel siero è possibile riscontrare anticorpi
specifici per l’antigene.
Nella prima fase della risposta primaria compaiono nel siero le IgM,
successivamente le IgG. La produzione di Ig decresce in seguito alla
scomparsa dell’antigene.
Risposta immunitaria secondaria
Quando un soggetto incontra nuovamente lo stesso antigene, la
sua risposta immunitaria risulta più efficace e più veloce.
I livelli anticorpali nel siero incrementano rapidamente e la
quantità di anticorpi totali prodotti è maggiore.
Inoltre, gli anticorpi presentano:
una maggiore affinità per l’antigene;
i vari isotipi (IgG, IgA, IgE) in quanto si è
verificato lo switch isotipico;
un’ampia gamma di funzioni effettrici.
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FUNZIONI EFFETTRICI DEGLI ANTICORPI
Neutralizzazione di microbi e tossine bloccando il loro legame alle
cellule.
Attivazione della via classica del complemento da parte delle IgM e
delle IgG.
Opsonizzazione dei microbi come stimolo per la fagocitosi.
Citotossicità cellulare anticorpo-dipendente mediata da cellule NK
Immunità a livello delle mucose mediata da IgA.
Immunità neonatale mediata da IgG materne che attraversano la
placenta e l’epitelio intestinale nel circolo del feto e del neonato
Ipersensibilità mediata da IgE.
Immunità delle mucose mediata dalla secrezione di IgA
Dosaggio Radioimmunologico
E.L.I.S.A.
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
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Principi del dosaggio radioimmunologico
• Principi: reazione immunologica [reazione Antigene –
Anticorpo] per dosare qualsiasi composto immunogenico
Ag + Ag* + Ab  AgAb + Ag*Ab + Ag + Ab*
– Ag* non legato e Ag libero
– Radioattività rilevata del residuo legato
– Concentrazione ligando è inversamente propozionale
alla radioattività
Vantaggi e Svantaggi del RIA
• Vantaggi
– Alta specificità: le reazioni immunologiche sono
specifiche
– Alta sensibilità: le reazioni immunologiche sono sensibili
• Svantaggi
– Pericoli radiologici: collegati all’uso dei reagenti radioattivi
– Richiesta di personale qualificato
– Laboratori con specifiche licenze in campo radiologico
– Richieste speciali per lo smaltimento e la conservazione
del materiale radioattivo
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Requisiti per il RIA
1. Preparazione e Caratterizzazione
dell’Antigene
2. Radiomarcatura dell’Antigene
3. Preparazione dell’Anticorpo Specifico
4. Sviluppo dei Sistemi di Rilevazione
Preparazione e Radiomarcatura dell’Antigene
• Antigeni preparati da…
– Sintesi delle molecole
– Isolazione da sorgenti naturali
• Radiomarcatura [Procedura di marcatura]
– 3 H 14 C 125 I sono utilizzati come tag
– Gli antigeni sono marcati 3 H 14 C 125 I
– La marcatura non disturba la Specificità Antigenica
e L’Attività Antigenica!
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Preparazione dell’Anticorpo specifico
• L’Antigene iniettato in maniera intradermica in
conigli o maialini di Guinea  produzione
anticorpi
• Anticorpi recuperati dal siero
• Non sono Antigeni:
– Ormoni, Steroidi, Farmaci  APTENI
– Es: Gastrina, Morfina,
– Gli Apteni coniugati all’albumina  antigeni
Sviluppo del Sistema di Rilevazione
• Un punto cruciale è la separazione degli antigeni
non legati
• Questo è dipendente dal legame degli anticorpi
alla fase solida
• Gli Antigeni legati agli anticorpi fissati restano
fortemente adesi
• Rimuovere lavando o decantando gli antigeni non
legati
• Altre tecniche di separazione: Centrifugazione
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Procedura
• Aggiungere campioni noti + antigene marcato nei pozzetti
• Incubare  attendere la formazione del complesso
• Decantare e lavare il contenuto dei pozzetti  rimuovere
tutti gli antigeni non legati
• Radioattivtà emessa è misurata con un Contatore [GM
Contatore, Scintillatore etc]
• L’INTESITA’ della radioattività è inversamente
proporzionale alla concentrazione degli antigeni nel
campione noto
• Sensibile anche a concentrazioni basse di Antigeni
E.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay)
• Principi:
– Usa una reazione immunologica come RIA
– Differisce dal RIA per il metodo di rilevazione
– La rilevazione è basata su
• Reazione catalizzata da un enzima
• Sonda Fluorescente
• No Radioattività [grande vantaggio!]
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E.
L.
I.
S.
A.
Vantaggi dell’ ELISA
•
•
•
•
Sensibile: nell’ordine di nanogrammi o ancora meno
Riproducibilità
Reagenti minimi
Qualitativa e Quantitativa
– Qualitativa Es Test HIV
– Quantitativa  Es Rilevazione concentrazioni Farmaci
• Lo scopo: I pozzetti possono essere ricoperti con Antigeni
o Anticorpi
• Automatica alta velocità
• NO Pericoli radiazioni
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Tipi di ELISA
1. Metodo Noncompetitivo o a Sandwich
1. Sistema per misurare l’antigene [Pozzetti coperti
con Anticorpi; Anticorpi marcati con enzima]
2. Sistema per misurare gli anticorpi [Pozzetti coperti
con antigeni; AntiAnticorpi marcati con Enzima]
2. Metodo Competitivo [Pozzetti coperti con anticorpi;
Antigeni marcati con enzima]
Metodo Noncompetitivo o Sandwich
• Sistema misurazione Antigene
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Pozzetti coperti con anticorpi
Aggiunta di campioni
Incubare: attendere l’interazione antigene-anticorpo
Lavare rimuovere l’antigene non legato
Aggiungere l’Anticorpo marcato con l’enzima
Incubare e attendere che l’anticorpo marcato sia legato
Lavare  rimuovere l’Anticorpo marcato non legato
Aggiungere il substrato; incubare
Enzima + Substrato  Prodotto  Misurazione
fluorescenza
– Fluorescenza proporzionale all’Anticorpo nel campione
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Metodo Noncompetitivo o Sandwich
• Sistema per la misurazione dell’Anticorpo
– Pozzetti coperti con l’antigene
– Aggiunta campione da analizzare contenente l’anticorpo
– Incubare: attendere la formazione del complesso antigene
anticorpo
– Lavare rimuovere l’Anticorpo non legato
– Aggiungere Antianticorpo marcato con l’Enzima
– Incubare con antianticorpi marcati complesso anticorpoantigene
– Lavare rimuovere antianticorpo marcato non legato
– Aggiungere il substrato; incubare
– Enzima + Substrato  Prodotto  fluorescenza
– Fluorescenza proporzionale all’anticorpo presente nel
campione
Sistema Competitivo
• Pozzetti coperti con anticorpi
• Quantità note di campione contente antigene +
antigene marcato con l’enzima
• Incubare: reazione antigene e anticorpo
• Lavare  rimuovere l’antigene non legato
• Aggiungere il substrato; incubare
• Enzima + Substrato  Prodotto  fluorescenza
• Fluorescenza inversamente proporzionale all’antigene
presente nel campione
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Marcatori Enzimatici
Marcatori enzimatici:
• un’alta specificità
• Facilmente complessati ai ligandi e al complesso
marcato
• La reattività deve avvenire dopo che si è legato l’enzima
antigene/anticorpo
• Gli enzimi scelti devono essere presenti normalmente
nel campione
• Esempi di enzimi marcati
– Perossidasi, Fosfatasi Alcalina, Glucosio ossidasi
Applicazioni dei dosaggi Immunologici
[RIA e ELISA]
• Analisi di ormoni, vitamine, metaboliti, diagnosi di
marcatori
– Es. ACTH, FSH, T3, T4, Glucagone, Insulina, Testosterone,
vitamin B12, prostaglandine, glucocorticoidi,
• Monitoraggio Farmaci ad uso terapeutico:
– Barbiturici, morfina,
• Diagnosi per malattie infettive
– HIV, Epatite A, B etc
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Multiplex- Cytokine array
Le determinazioni vengono effettuate su sieri
opportunamente criopreservati a -20°C.
I sieri sono processati per la valutazione di
diverse proteine circolanti dotate di attività
biologica impiegando come sistema di detezione
il sistema Multiplex (Bio-Plex suspension array)
della Bio-Rad.
Esso permette di determinare quantitativamente
i livelli sierici circolanti fino a 18 citochine sullo
stesso campione di siero (50-100 microlitri di
siero).
Determinazione di diverse citochine allo stesso
tempo: ad ogni citochina è assegnato una beads di
dimensione diversa
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Il secondo anticorpo fluorescente si lega alla citochina e
l’intensità di fluorescenza viene assegnata attraverso il
colore delle beads alle diverse citochine.
A cavallo della citofluorimetria e dell’ELISA: le beads
vengono lette una alla volta attraverso un sistema
fluidico
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Studio Biologico: determinazioni su siero (2)
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