ETANOLO (ALCOOL ETILICO) SIERICO E/O PLASMATICO in UV

ETANOLO (ALCOOL ETILICO) SIERICO E/O PLASMATICO in UV – Codice Z05810
BIOCHIMICA E METABOLISMO
L’alcol etilico è un alcool alifatico di PM=46,07.
Di solito viene assunto per via orale ed assorbito rapidamente da stomaco, piccolo intestino e colon. Il tempo
necessario per completare il processo di assorbimento varia da 2 a 6 ore, in funzione di fattori quali la
presenza di cibo e di altri liquidi, il tempo impiegato per l’ingestione della bevanda, la variabilità biologica fra
individui.
L’alcol, vista la solubilità in acqua ed il basso peso molecolare, appena assorbito si distribuisce rapidamente
in tutti i tessuti e fluidi dell’organismo, superando anche la barriera encefalica e quella placentare.
L’andamento della concentrazione di alcol in alcuni liquidi biologici è stato determinato sperimentalmente da
vari autori, anche recentemente (Fig. 1). I risultati mostrano che la massima concentrazione plasmatica
viene raggiunta dopo circa 20 minuti dall’assunzione e che saliva ed espirato seguono da vicino le variazioni
dell’alcolemia, mentre nelle urine si raggiunge la massima concentrazione dopo circa due ore
dall’assunzione.
Fig. 1. Alcol etilico: concentrazione nei liquidi biologici
Dopo l’assorbimento, l’Etanolo viene prevalentemente metabolizzato (90-98 %) per via ossidativa, ad una
velocità direttamente proporzionale al peso corporeo e costante nel tempo. La prima reazione di ossidazione
avviene nel fegato, per azione dell’enzima Alcol Deidrogenasi con NAD come coenzima ed accettore di
Idrogeno con produzione di Acetaldeide; questa viene successivamente ossidata ad Acido acetico, per
azione dell’enzima Aldeide Deidrogenasi. La cinetica di eliminazione non ha un andamento esponenziale,
come la maggior parte delle sostanze esogene, ma pseudolineare; dopo il completamento della fase di
assorbimento e distribuzione, quando la concentrazione raggiunge il valore massimo C0, la relazione fra
concentrazione ematica Ct e tempo t, è data dall’equazione: Ct = C0 - kt, con k compresa fra 10 e 25 mg/dL/h
(Fig.2).
Fig.2. Urine ed aria espirata rappresentano anche le principali vie di eliminazione dell’alcol e dei suoi prodotti di ossidazione. La cinetica
d’eliminazione, complessivamente regolata dall’equazione di Michaelis Menten, assume tuttavia un andamento pseudolineare dopo il
completamento della fase di assorbimento e distribuzione.
1
L’escrezione di alcol non modificato, di solito, interessa il 2% della quantità assunta ed avviene
prevalentemente attraverso reni e polmoni, anche se piccole quantità si ritrovano anche nella saliva ed in
altri liquidi organici; può salire fino al 10 % in caso di ingestione massiva.
La concentrazione urinaria è di poco superiore a quella ematica; quella alveolare è circa lo 0,05%.
La concentrazione nel plasma è superiore a quella del sangue intero di circa il 10%.
INTOSSICAZIONE ACUTA
L’assunzione eccessiva di alcol provoca, in tempi rapidi, situazioni cliniche di varia gravità che possono
richiedere l’intervento del medico del Pronto Soccorso, sia per gli effetti diretti dell’ebbrezza sia per quelli
indiretti (incidenti stradali).
In tali casi il medico si può rivolgere al Laboratorio con vari obiettivi:
- accertare una possibile causa di coma, in paziente senza trauma cranico;
- accertare la causa di coma in paziente con trauma cranico (per es. a seguito di incidente stradale);
- diagnosticare uno stato di ebbrezza in paziente con sintomatologia dubbia.
Esiste, ed ormai è largamente accettata, una relazione tra l’alcolemia (Blood Alcool Concentration - BAC) e
l’ebbrezza di una persona.
Ricordiamo soltanto che la Legislazione Italiana non considera reato il consumo di alcol, a meno che il
bevitore non debba porsi alla guida di un autoveicolo (Legge 1 Agosto 2003, n. 214 - Art. 186). Il sospetto di
tale reato autorizza gli organi di polizia stradale ad effettuare l’accertamento di “alterazione psico-fisica”
dovuta all’alcol; accertamento che deve essere effettuato con strumenti e procedure determinati dal
regolamento (DPR 16 Dicembre 1992, n. 495 - Art. 379).
Le procedure degli esami dell’alcolemia sono dettate dall’articolo n°186 del Codice della Strada.
Il livello di concentrazione ematica di etanolo a partire dal quale viene dichiarato lo stato di ebbrezza è stato
fissato, in Italia, a 0,5 g/l.
CHIMICA E DOSAGGIO MEDIANTE TECNICA HPLC
Il presente metodo determina le concentrazioni sieriche e/o plasmatiche dell’Etanolo derivatizzandolo e
leggendolo in HPLC a λ=385 nm .
EUREKA srl – LAB DIVISION
VAT N° 01547310423
E-mail:[email protected]
www.eurekaone.com
Release N° 005
Head Quarter:
Via Enrico Fermi 25
60033 Chiaravalle (AN) ITALY
Tel. +39 071 7450790
Fax + 39 071 7496579
Etanolo sierico in UV
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Febbraio 2010
CARATTERISTICHE DEL METODO
Principio del Metodo:
Il campione viene diluito e trattato a 40 °C per 30 minuti. Dopo raffreddamento, viene aggiunto il deproteinizzante e al
surnatante viene aggiunto il derivatizzante. La soluzione viene posta a 70 °C per 15 minuti. Dopo raffreddamento la
soluzione viene diluita e iniettata direttamente in HPLC.
Recupero del Metodo :
100%
Sensibilità del Metodo :
< 0,02 g/l
Range dinamico del metodo :
0,02 - 3,16 g/l
Valori di riferimento del tasso alcolemico:
Valore eccedente gli 0,5 g/l e non superiore agli 0,8
g/l:
ammenda da 500,00 a 2.000,00 euro e arresto fino a un
mese - sanzione amministrativa accessoria della
sospensione della patente da 3 a 6 mesi;
Rif. Articolo n° 186 del Codice della Strada:
Guida in stato di ebrezza
valore eccedente gli 0,8 g/l e non superiore a 1,5 g/l:
ammenda da 800,00 a 3.200,00 euro e arresto fino a tre
mesi - sanzione amministrativa accessoria della
sospensione della patente da 6 mesi ad 1 anno;
Valore superiore a 1,5 g/l:
ammenda da 1.500,00 a 6.000,00 euro e arresto fino a 6
mesi - sanzione amministrativa accessoria della
sospensione della patente da 1 a 2 anni.
Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a 2 – 8
°C.
Contenuto della confezione :
Reagente A - Soluzione Tampone 1, 1 x 20 ml
Reagente B – Reagente B, 1 x 5 ml
Reagente C - Soluzione Tampone 2, 1 x 10 ml
Reagente D - Soluzione Deproteinizzante, 1 x 10 ml
Reagente E - Soluzione Derivatizzante, 1 x 10 ml
Reagente F - Soluzione Test/Std Chimico, 1 x 10 ml
Vedi Avvertenze
Reagente G - Soluzione Diluente, 1 x 100 ml
Reagente M - Fase mobile, 3 x 500 ml
Dotazione strumentale minima richiesta :
Strumento HPLC isocratico con loop da 50 o 100 µl.
Detector spettrofotometrico UV/VIS λ=385 nm
Registratore di cromatogrammi
Dotazione opzionale :
Autocampionatore
Computer e software gestionale
Modalità per il prelievo ematico :
Non devono essere usati disinfettanti alcolici. Prelevare 3
ml di sangue venoso in una provetta con K3EDTA+NaF
come anticoagulante. Centrifugare a 4000 rpm per 5
minuti. Separare il plasma e stoccarlo a –20 °C.
Stabile 4 settimane. La provetta deve essere conservata
ben tappata.
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PROCEDURA PREANALITICA
Diluizione della Soluzione Test 3,16 g/l
In una provetta da 1,5 ml con tappo pipettare :
• 800 µl di H2O di grado HPLC
• 200 µl di Reagente F – Soluzione Test
In una provetta da 1,5 ml con tappo pipettare nell’ordine:
•
200 µl di Reagente A - Sol. Tampone 1
•
50 µl di Reagente B
•
50 µl di Sol. Test precedentemente diluita
Al vortex per 10 secondi
•
Incubare a 40 °C per 30 minuti
Raffreddare
Aggiungere nell’ordine:
• 100 µl di Reagente C – Sol. Tampone 2
• 100 µl di Reagente D – Sol. Deproteinizzante
• 100 µl di Reagente E – Sol. Derivatizzante
Al vortex per 10 secondi
•
Incubare a 70 °C per 15 minuti
Raffreddare e agitare al vortex per 10 secondi
Trasferire 100 µl del derivatizzato in una provetta e aggiungere 900 µl del Reagente G - Soluzione Diluente.
Al vortex per 10 secondi
INIEZIONE :
• Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma.
Verificare che la Sol. Test abbia un tempo di ritenzione simile a quello riportato in fig. 3. Se il Test ha dato
esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema
analitico.
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PROCEDURA ANALITICA
FASE 1 : Diluizione dei Campioni, del Calibratore e degli eventuali Controlli
Campione
Standard di
calibrazione
800 µl
800 µl
200 µl
Acqua di grado HPLC
Campione
Reagente F – Std di Calibrazione
Controllo
Controllo
800 µl
200 µl
200 µl
IMPORTANTE : La soluzione standard di calibrazione va preparata di volta in volta
FASE 2 : Preparazione dei Campioni, del Calibratore e dei Controlli
Dispensare in provette da 1,5 ml con tappo:
Reagente A – Sol. Tampone 1
Reagente B
Acqua di grado HPLC
Campione
Standard chimico
Controllo
Bianco
Campione
Standard
Controllo
200 µl
50 µl
50 µl
200 µl
50 µl
200 µl
50 µl
200 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
Al vortex per 10 secondi
FASE 3 : Porre la serie di provette a 40 °C per 30 minuti
Lasciar raffreddare a temperatura ambiente
e
agitare al vortex per 10 secondi
FASE 4 : Procedura di deproteinizzazione
Aggiungere in ciascuna provetta nell’ordine:
•
•
100 µl di Reagente C – Sol. Tampone 2
100 µl di Reagente D – Sol. Deproteinizzante
Agitare vortex per 10 secondi e centrifugare a 5000 rpm per 5 minuti
FASE 5 : Trasferire 400 µl di surnatante in provette da 1,5 ml con tappo e aggiungere:
•
100 µl di Reagente E – Sol. Derivatizzante
FASE 6 : Porre la serie di provette in stufa a 70 °C per 15 minuti
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Lasciar raffreddare a temperatura ambiente e agitare al vortex per 10 secondi
FASE 7 : Procedura di diluizione
In una provetta idonea pipettare nell’ordine:
•
•
900 µl di Reagente G – Sol. Diluente
100 µl di campione precedentemente derivatizzato.
N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 °C
INIEZIONE :
•
Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma.
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ETANOLO SIERICO E/O PLASMATICO - Avvertenze
REAGENTE F : STANDARD CHIMICO / SOLUZIONE TEST
Etanolo
3,16 g/l
PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO
λ
GAIN
TEMPO DI INTEGRAZIONE
385 nm
0,001 AUFS
10 secondi
PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA
Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS C 18 (4,6 x 150 mm, 4 µ), è
tassativo l’uso del Metaguard Guard Column, cod. ZA600MG (1 x 3 pz) e del Metasaver
Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005..
CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA
Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS C 18 (4,6 x 150 mm, 4 µ).
Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H2O : Metanolo o Acetonitrile
( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H2O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non
riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2
ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di
fase.
E’ possibile effettuare analisi a ricircolo di fase.
Se la T Amb del Laboratorio è > 20 °C si consiglia di conservare a 2-8 °C la Fase Mobile fra
una seduta analitica e l’altra.
PULIZIA DELLA COLONNA
Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H2O e scaricare. Flussare una soluzione di H2O :
Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà
usata di nuovo far passare 30 ml di H2O prima di condizionarla con la Fase Mobile.
PARAMETRI HPLC
LOOP
Flusso di lavoro consigliato
Pressione corrispondente
50 µl o 100 µl
1,2 ml/minuto
Circa 80 bar
PARAMETRI INTEGRATORE HP – 3394 / 3395 / 3396
ATTENUAZIONE
7 o 8
PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE
SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE
ACCESSORI E CONSUMABILI
CODICE
DESCRIZIONE
CONFEZIONE
Z05820
Standard chimico per Etanolo sierico e/o plasmatico
ZFM15960E
Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um)
ZA600MG
Metaguard – Guard Column
1 x 3 PZ
ZA6005
Metasaver Precolumn Filter 0.5 um
1 x 10 PZ
S394983500
Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite
1 x 144 PZ
7
2 x 5 ml
1 PZ
ETANOLO SIERICO E/O PLASMATICO IN UV
(Cromatogrammi di Riferimento)
Fig. 3 : Soluzione Test
R.T. 10.330 Etanolo 3,16 g/l
Fig. 4 :
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Campione di plasma di soggetto sobrio
ETANOLO SIERICO E/O PLASMATICO IN UV
(Cromatogrammi di Riferimento)
Fig. 5 :
Fig. 6 :
Campione di plasma di medio bevitore
R.T. 10.135 Etanolo 0,79 g/l
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Campione di plasma di forte bevitore
R.T. 10.143 Etanolo 3,16 g/l