ETANOLO (ALCOOL ETILICO) URINARIO in UV

ETANOLO (ALCOOL ETILICO) URINARIO in UV – Codice Z05710
BIOCHIMICA E METABOLISMO
L’alcol etilico è un alcool alifatico di PM=46,07.
Di solito viene assunto per via orale ed assorbito rapidamente da stomaco, piccolo intestino e colon. Il tempo
necessario per completare il processo di assorbimento varia da 2 a 6 ore, in funzione di fattori quali la
presenza di cibo e di altri liquidi, il tempo impiegato per l’ingestione della bevanda, la variabilità biologica fra
individui.
L’alcol, vista la solubilità in acqua ed il basso peso molecolare, appena assorbito si distribuisce rapidamente
in tutti i tessuti e fluidi del corpo, superando anche la barriera encefalica e quella placentare. L’andamento
della concentrazione di alcol in alcuni liquidi biologici è stato determinato sperimentalmente da vari autori,
anche recentemente (Fig. 1). I risultati mostrano che la massima concentrazione plasmatica viene raggiunta
dopo circa 20 minuti dall’assunzione e che saliva ed espirato seguono da vicino le variazioni dell’alcolemia,
mentre nelle urine si raggiunge la massima concentrazione dopo circa due ore dall’assunzione.
Fig. 1. Alcol etilico: concentrazione nei liquidi biologici
Dopo l’assorbimento, l’Etanolo viene prevalentemente metabolizzato (90-98 %) per via ossidativa, ad una
velocità direttamente proporzionale al peso corporeo e costante nel tempo. La prima reazione di ossidazione
avviene nel fegato, per azione dell’enzima Alcol Deidrogenasi con NAD come coenzima ed accettore di
Idrogeno con produzione di Acetaldeide; questa viene successivamente ossidata ad Acido acetico, per
azione dell’enzima Aldeide Deidrogenasi. La cinetica di eliminazione non ha un andamento esponenziale,
come la maggior parte delle sostanze esogene, ma pseudolineare; dopo il completamento della fase di
assorbimento e distribuzione, quando la concentrazione raggiunge il valore massimo C0, la relazione fra
concentrazione ematica Ct e tempo t, è data dall’equazione: Ct = C0 - kt, con k compresa fra 10 e 25 mg/dL/h
(Fig.2).
Fig.2. Urine ed aria espirata rappresentano anche le principali vie di eliminazione dell’alcol e dei suoi prodotti di ossidazione. La cinetica
d’eliminazione, complessivamente regolata dall’equazione di Michaelis Menten, assume tuttavia un andamento pseudolineare dopo il
completamento della fase di assorbimento e distribuzione.
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L’escrezione di alcol non modificato, di solito, interessa il 2% della quantità assunta ed avviene
prevalentemente attraverso reni e polmoni, anche se piccole quantità si ritrovano anche nella saliva ed in
altri liquidi organici; può salire fino al 10 % in caso di ingestione massiva.
La concentrazione urinaria è di poco superiore a quella ematica; quella alveolare è circa lo 0,05%.
La concentrazione in plasma è superiore a quella su sangue intero di circa il 10%.
ABUSO CRONICO
L’assunzione eccessiva di alcol provoca, in tempi rapidi, situazioni cliniche di varia gravità che possono
richiedere l’intervento del medico del Pronto Soccorso, sia per gli effetti diretti dell’ebbrezza che per quelli
indiretti (incidenti stradali).
Il Laboratorio mette oggi a disposizione del clinico vari esami che, se opportunamente valutati, lo aiuteranno
a prendere le decisioni più giuste in relazione a problemi diagnostici e prognostici, quali :
1 - individuare con certezza i forti bevitori;
2 - controllare se un alcolista in terapia si mantiene astemio;
3 - riconoscere le epatopatie di origine alcolica (ALD) dalle altre (NALD);
4 - in corso di epatopatia alcolica, valutare lo stadio della malattia.
ALCOLURIA
L’Etanolo urinario non è un buon indicatore quantitativo per valutare lo stato di ebrezza, data l’estrema
variabilità della concentrazione, a parità di assunzione. Tuttavia, la maggiore permanenza dell’Etanolo nelle
urine, rispetto al sangue, lo rende utile per monitorare l’astinenza: a questo scopo occorre che l’esame
venga richiesto quasi giornalmente, a causa del basso tempo di emivita dell’etanolo.
Rispetto al sangue, le urine hanno il grosso vantaggio di non richiedere prelievi invasivi.
La presenza di Etanolo nelle urine va valutata caso per caso.
La positività a bassi valori di concentrazione (0,3-0,5 g/l) in urine prelevate dopo pranzo è poco significativa
mentre è preoccupante se il prelievo è fatto di mattina. Un solo valore positivo non significa nulla mentre più
valori positivi indicano evidentemente l’assunzione cronica di alcol. Valori positivi in persone che dovrebbero
essere astinenti sono ovviamente indice di interruzione dello stato di sobrietà. L’Etanolo, come visto, persiste
in circolo per circa 6 ore e si ritrova nelle urine fino a 12 ore dopo l’assunzione. Per assunzioni precedenti
tale intervallo, in letteratura sono riportati altri marcatori che persistono nelle urine fino a 24 ore.
CHIMICA E DOSAGGIO MEDIANTE TECNICA HPLC
Il presente metodo determina le concentrazioni urinarie dell’Etanolo derivatizzandolo e leggendolo in HPLC
a λ=385 nm .
E’ necessario congelare il campione urinario appena prelevato a -20 °C
EUREKA srl – LAB DIVISION
VAT N° 01547310423
E-mail:[email protected]
www.eurekaone.com
Release N° 005
Head Quarter:
Via Enrico Fermi 25
60033 Chiaravalle (AN) ITALY
Tel. +39 071 7450790
Fax + 39 071 7496579
Etanolo urinario in UV
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CARATTERISTICHE DEL METODO
Principio del Metodo:
L’Etanolo viene trattato a 40 °C per 30 minuti. Dopo raffreddamento, viene aggiunto il derivatizzante e la
soluzione viene posta a 70 °C per 15 minuti. Dopo raffreddamento la soluzione viene iniettata direttamente
in HPLC.
Recupero del Metodo :
100%
Sensibilità del Metodo :
< 0,02 g/l
Range dinamico del metodo :
0,02 - 3,16 g/l
Valori di riferimento:
n.d.
(Rif.Il laboratorio nell’intossicazione acuta e nell’abuso cronico di
alcol. Badii, Corezzi, Tavanti)
Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a 2
– 8 °C.
Contenuto della confezione :
Reagente A - Soluzione Tampone 1, 1 x 20 ml
Reagente B – Reagente B, 1 x 5 ml
Reagente C - Soluzione Tampone 2, 1 x 10 ml
Reagente D - Soluzione Derivatizzante, 1 x 10 ml
Reagente E - Soluzione Stabilizzante, 1 x 10 ml
Reagente F - Soluzione Test/Std Chimico, 1 x 10 ml
Vedi Avvertenze
Reagente G - Soluzione Diluente, 1 x 100 ml
Reagente M - Fase mobile, 3 x 500 ml
Dotazione strumentale minima richiesta :
Strumento HPLC isocratico con loop da 50 o 100 µl.
Detector spettrofotometrico UV/VIS λ=385 nm
Registratore di cromatogrammi
Dotazione opzionale :
Autocampionatore
Computer e software gestionale
Modalità per il prelievo urinario :
Raccogliere 10 ml di urine in una provetta idonea e
congelare a - 20 °C.
Stabile 4 mesi a -20 °C.
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PROCEDURA PREANALITICA
Diluizione 1:20 della Soluzione Test 3,16 g/l
In una provetta di vetro con tappo in teflon pipettare :
• 950 µl di H2O di grado HPLC
•
50 µl di Reagente F – Soluzione Test
In una provetta di vetro con tappo in teflon pipettare nell’ordine:
•
200 µl di Reagente A - Sol. Tampone 1
•
50 µl di Reagente B
•
50 µl di Sol. Test diluita
Al vortex per 10 secondi
•
Incubare a 40 °C per 30 minuti
Raffreddare
Aggiungere nell’ordine:
• 100 µl di Reagente C – Sol. Tampone 2
• 100 µl di Reagente E – Sol. Stabilizzante
• 100 µl di Reagente D – Sol. Derivatizzante
Al vortex per 10 secondi
•
Incubare a 70 °C per 15 minuti
Raffreddare e agitare al vortex per 10 secondi
INIEZIONE :
• Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma.
Verificare che la Sol. Test abbia un tempo di ritenzione simile a quello riportato in fig. 1. Se il Test ha dato
esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema
analitico.
PROCEDURA ANALITICA
FASE 1 : Diluizione dei Campioni, dello standard chimico di calibrazione e degli eventuali Controlli
Verificare e portare il pH del campione urinario a 7,5.
Campione
Reagente G- Sol. Diluente
Campione
Reagente F – Std chimico di
calibrazione
Controllo
950 µl
50 µl
Standard chimico di
calibrazione
950 µl
Controllo
950 µl
50 µl
50 µl
IMPORTANTE : La soluzione standard chimico di calibrazione va preparata di volta in volta
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FASE 2 : Preparazione dei Campioni, dello standard chimico di calibrazione e dei Controlli
Dispensare in provette di vetro con tappo a vite in teflon:
Reagente A - Sol. Tampone 1
Reagente B
Acqua di grado HPLC
Campione
Standard chimico di calibrazione
Controllo
Bianco
Campione
200 µl
50 µl
50 µl
200 µl
50 µl
Standard
chimico di
calibrazione
200 µl
50 µl
Controllo
200 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
Al vortex per 10 secondi
FASE 3 : Porre la serie di provette a 40 °C per 30 minuti
Lasciar raffreddare a temperatura ambiente
e
agitare al vortex per 10 secondi
FASE 4 : Procedura di derivatizzazione
Aggiungere nell’ordine:
•
•
•
100 µl di Reagente C – Sol. Tampone 2
100 µl di Reagente E – Sol. Stabilizzante
100 µl di Reagente D – Sol. Derivatizzante
Al vortex per 10 secondi
FASE 5 : Porre la serie di provette in stufa a 70 °C per 15 minuti
Lasciar raffreddare a temperatura ambiente e agitare al vortex per 10 secondi
N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 °C
INIEZIONE :
•
Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma.
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ETANOLO URINARIO - Avvertenze
REAGENTE F : STANDARD CHIMICO / SOLUZIONE TEST
Etanolo
3,16 g/l
PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO
λ
GAIN
TEMPO DI INTEGRAZIONE
385 nm
0,001 AUFS
10 secondi
PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA
Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS C 18 (4,6 x 150 mm, 4 µ), è
tassativo l’uso del Metaguard Guard Column, cod. ZA600MG (1 x 3 pz) e del Metasaver
Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005.
CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA
Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS C 18 (4,6 x 150 mm, 4 µ).
Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H2O : Metanolo o Acetonitrile
( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H2O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non
riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2
ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di
fase.
E’ possibile effettuare analisi a ricircolo di fase.
Se la T Amb del Laboratorio è > 20 °C si consiglia di conservare a 2-8 °C la Fase Mobile fra
una seduta analitica e l’altra.
PULIZIA DELLA COLONNA
Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H2O e scaricare. Flussare una soluzione di H2O :
Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà
usata di nuovo far passare 30 ml di H2O prima di condizionarla con la Fase Mobile.
PARAMETRI HPLC
LOOP
Flusso di lavoro consigliato
Pressione corrispondente
50 µl o 100 µl
1,2 ml/minuto
Circa 80 bar
PARAMETRI INTEGRATORE HP – 3394 / 3395 / 3396
ATTENUAZIONE
7 o 8
PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE
SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE
ACCESSORI E CONSUMABILI
CODICE
DESCRIZIONE
Z05720
Standard chimico per Etanolo urinario
CONFEZIONE
ZFM15960E
Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um)
ZA600MG
Metaguard – Guard Column
1 x 3 PZ
ZA6005
Metasaver Precolumn Filter 0.5 um
1 x 10 PZ
S394983500
Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite
1 x 144 PZ
6
2 x 5 ml
1 PZ
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ETANOLO URINARIO IN UV
(Cromatogrammi di Riferimento)
Fig. 3 : Soluzione Test
R.T. 9.232 Etanolo 3,16 g/l
Fig. 4 : Campione di urina di soggetto sobrio
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ETANOLO URINARIO IN UV
(Cromatogrammi di Riferimento)
Fig. 5 : Campione di urina di medio bevitore
R.T. 9.170
Etanolo 0,79 g/l
Fig. 6 : Campione di urina di forte bevitore
R.T. 9.243
Etanolo 3,16 g/l
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