Dipartimento di Farmacia

Farmacologia e Tossicologia, 2015
TOSSICOLOGIA-5
CITOTOSSICITA’
JeanJean-Franç
François DESAPHY
citotossicità
Citotossici sono gli effetti dei composti chimici che portano ad un’alterazione
delle funzioni cellulari che non rientra nei limiti fisiologici.
CELLULA NORMALE
(equilibrio-omeostasi)
Aumentata richiesta
Stress
CELLULA
ADATTATA
Stimolo dannoso
Incapacità di
adattamento
DANNO
MORTE
2008© J.F. DESAPHY
Citotossicità
Il danno citotossico può essere
locale o sistemico
effetti gastroenterici di sostanze caustiche
effetti cutanei da materiale corrosivo
effetti respiratori da gas e vapori irritanti
effetti sistemici della sostanza assorbita e distribuita dai flussi
liquidi corporei (linfa, sangue)
immediato / ritardato
effetto immediato in tempi brevi da singola esposizione
effetto ritardato dopo latenza da esposizione singola o ripetuta
reversibile / irreversibile
2008© J.F. DESAPHY
Citotossicità
Il danno citotossico può condurre alla morte cellulare
apoptosi
morte cellulare programmata (suicidio cellulare)
necrosi
morte cellulare non programmata
L’entità del danno cellulare dipende
dalla funzione e dall’importanza del componente cellulare colpito
dall’entità e reversibilità del danno
dalla capacità di riparazione del danno da parte della cellula
dalla capacità di rigenerazione di un tessuto
2008© J.F. DESAPHY
La cellula
Cellula totipotente
Cellule pluripotenti
Cellule differenziati (200 tipi)
2008© J.F. DESAPHY
Membrana cellulare
doppio strato di lipidi polari semi-permeabile ...
molecole apolari e piccole molecole polari
molecole neutre e polari, molecole cariche
... in cui sono inserite delle proteine
Concentrazioni (mmol·L-1)
di alcuni ioni inorganici
glicoproteine
glicolipidi
oligosaccaridi
Ione
Fuori
Dentro
Na+
145
5-15
K+
5
140
Mg2+
1-2
30
Ca2+
1-2
<10-3
Cl-
120
5-15
colesterolo
proteine periferiche
proteine integrali
fibre del
citoscheletro
2008© J.F. DESAPHY
Componenti Intracellulari
•Citosol (frazione solubile del citoplasma)
enzimi del metabolismo (sintesi degli acidi grassi, glicolisi …)
sintesi delle proteine solubili
•Reticolo endoplasmatico (rete di canali)
sintesi di lipidi, di proteine di membrana e secretorie
origine degli organuli cellulari
•Apparato di Golgi (sacchetti sovrapposti)
maturazione delle proteine di membrana e secretorie
•Lisosomi (vescicole)
catabolismo enzimatico, neutralizzazione di ROS
•Mitocondri (circondati da due membrane, genoma proprio)
ciclo dell’acido citrico, dell’urea
degradazione degli acidi grassi, gluconeogenesi
fosforilazione ossidativa (sintesi di ATP)
•Nucleo (circondato da due membrane con numerosi pori, genoma)
trascrizione del DNA in mRNA
2008© J.F. DESAPHY
Siti cellulari bersagli delle sostanze tossiche
In linea di principio, tutte le funzioni e le strutture cellulari possono
costituire siti d’attacco per gli agenti tossici.
•Membrane cellulari
•Perossidazione lipidica
•Sistemi Redox
•Funzione delle proteine
•Sintesi di ATP
•Omeostasi cellulare dello ione calcio
•DNA (alterazione della replicazione e trascrizione, mutazioni,
distruzione, ecc...)
genotossicità
2008© J.F. DESAPHY
Membrane cellulari
Interazioni con la struttura lipidica della membrana
Accumulo nelle membrane di
sostanze lipofile e amfipatiche
Solventi
Saponi
Farmaci
Ecc...
concentrazioni elevate
Alterazione della fluidità di membrana
Alterazione funzionale
di proteine di membrana
(enzimi, trasporti)
Disgregazione della membrana
Morte cellulare
per necrosi
2008© J.F. DESAPHY
Membrane cellulari
Interazioni dirette con le proteine di membrana
Sostanze endogeni
glutammato
neurotrasmettitore Recettore-canale
per il calcio
morte cellulare
Tossine animali e vegetali
Tetrodotossina
Saxitossina
tossina algale
tossina algale
canali al sodio
(blocco)
ineccitabilità neuronale, paralisi
muscolare
batracotossina
tossina animale
canali al sodio
(attivazione)
ipereccitabilità, convulsioni, aritmie
picrotossina
tossina vegetale
Rc GABAA
ipereccitabilità, convulsioni
Digitossina
tossina vegetale
Na+/K+ ATPasi
aritmia cardiaca e neuronale
Composti chimici
DDT
pesticida
canali al sodio
Ca2+-ATPasi
Na+/K+ ATPasi
ipereccitabilità, convulsioni, aritmie
piretroidi
pesticida
canali al sodio
Ca2+-ATPasi
Rc GABAA
ipereccitabilità, convulsioni, aritmie
tributilstagno
pesticida
Ca2+-ATPasi
morte cellulare
2008© J.F. DESAPHY
Stress Ossidativo
Lo stress ossidativo descrive una condizione nella quale le difese cellulari non
riescono a detossificare la cellula dai ROS prodotti durante le normale reazioni
fisiologiche, in condizioni patologiche (ischemia), o dopo esposizione ad agenti
tossici.
(Esistono anche i RNS: specie reattive del nitrogeno)
ROS: specie reattive dell’ossigeno
anione superossido: •O2perossido di idrogeno: H2O2
radicale idrossilico: •OH
più tossico
Rimozione dei radicali liberi
enzimi
anti-ossidanti
• superossido dismutasi
• catalasi
• glutatione perossidasi
• β-carotene (vit A)
• α-tocoferolo (vit E)
• acidi grassi insaturi
Conseguenze dello stress ossidativo
• Perossidazione lipidica
• Alterazione dei sistemi redox
• Perdita dell’attività di alcune proteine
• Idrossilazione delle basi e rottura della catena del DNA
2013© J.F. DESAPHY
Stress Ossidativo: formazione di radicali liberi
LOO·: radicale lipoperossido
O2-·: radicale superossido
NO·: radicale nitrossido
2007© J.F. DESAPHY
Stress Ossidativo: formazione di radicali liberi
Lo ione superossido non è solo un prodotto di scarto ma può svolgere funzioni
fisiologiche; per esempio è coinvolto nella difesa contro i patogeni
patogeno
fagocitosi
destruzione
Produzione
di •O2Burst respiratorio
•O2
-
del patogeno
fagocita
2O2 + NADPH
NADPH-ossidasi
2•O2- + NADP+ + H+
La malattia granulomatosa cronica (CGD) è una malattia genetica dovuta a mutazioni
nell’enzima NADPH-ossidasi. L’enzima non funziona in questi pazienti, esponendoli a
infezioni ricorrenti
2011© J.F. DESAPHY
Stress Ossidativo: formazione di radicali liberi
Materiali solidi: silice cristallina (amianto), biomateriali polimerici (protesi)
Reazioni ossidative in superficie
Accumulo di ferro o rame nei lisosomi epatici, processi infiammatori
Perossido di ossigeno
reazione di Fenton
Fe2+ + H2O2
Radicale idrossilico
Fe3+ + •OH + OH-
riduzione da superossido
Fe3+ + •O2-
Fe2+ + O2
reazione di Haber Weiss
•O2- + H2O2
O2 + •OH + OHIone superossido
Materiali gassosi a livello polmonare
(fumo di tabacco, ozono O3, biossido d’azoto NO2)
2008© J.F. DESAPHY
Stress Ossidativo: formazione di radicali liberi
ciclo redox di composti chimici (catecolo, chinone, nitrocomposti aromatici)
reduttasi
O2
R-NO2-•
e-
O2
R-NO2
amianti
radicale libero organico
ossidazione di molecola organica
X + H-:-R
XH + •R
acido grasso insaturo
CCl4 negli epatociti
(solvente)
H2O2
1O
2
•OH
-•
CCl4
P450
NADPH2
Cl- + •CCl3
NADP+
CHCl3
radicale pentadienilico dell’acido grasso
2008© J.F. DESAPHY
SO: Perossidazione lipidica
acido grasso insaturo
COOH
Attacco ossidativo
sui lipidi di membrana insaturi
da parte dei radicali liberi
•X
HX
radicale pentadienilico dell’acido grasso
COOH
Incremento fluidità e
permeabilità di membrana
+ O2
•OO perossiradicale dell’acido grasso
COOH
Distruzione della membrana
a.g. insaturo
endoperossido ciclico
Necrosi cellulare
dialdeide malonica
Indicatori dello SO
Alcuni dei quali
anche misurabili
nell’aria espirato
diagnosi
HOO
Reazione a catena
radicale dell’a.g.
idroperossido dell’acido grasso
COOH
Fe2+
a.g. idrossilati
Fe3+
alcano, alchene
alcossiradicale
2008© J.F. DESAPHY
SO: Sistemi redox
• coenzimi trasportatori di idrogeno: NAD, NADP, riboflavina
• coppie substrato-prodotto:
lattato/piruvato
acetaldeide/acido acetico
acido ascorbico/acido deidroascorbico
• sistema glutatione e gruppi tiolici di proteine
idroperossido
ROOH
detossificazione
alcol
ROH + H2O
H2O2
2H20
glutatione perossidasi
2 GSH
GSSG
per sovraccarico della
glutatione reduttasi,
si riduce il rapporto
GSH/GSSG
glutatione reduttasi
NADP+
maggior
efflusso di Ca2+
dai mitocondri
NADPH + H+
se aumenta la frazione di
GSSG e NADP+
Inibizione
sintesi proteica
e
divisione cellulare
2008© J.F. DESAPHY
SO: effetti sulle proteine
specie ossigenate reattive
ROS
Gruppo tiolico
proteina-SH + proteina-SH
o
proteina-SH + GSH
proteina-S-S-proteina
o
proteina-S-SG
composto chimico elettrofilo
Inibizione della
funzione della proteine
e
riduzione
dei livelli di GSH
R-X+
proteina-SH
o
GSH
proteina-S-R
o
GS-R
O
X
HN
proteina-SH
O
glucuronide
HN
OH
paracetamolo
SP
O
N
CH3
OH
GSH
cytP450
solfato
tossicità
O
CH3
CH3
HN
SG
O
N-acetil-p-benzochinone imina
CH3
OH
Tioetere coniugati
Eliminazione
renale
2008© J.F. DESAPHY
Sintesi di ATP
•Glicolisi nel citosol
Glucosio + 2 Pi + 2 ADP + 2 NAD+
2 piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2H2O
•Fosforilazione ossidativa mitocondriale
Ciclo di Krebs
+
++
---
+++
----
+
+ --
+
+
+ --
ADP + Pi
+
++ ---
+
+++
----
2eH2O ½ O2
ATP
++
+
---
H+
+
H+ H+ H
Inibizione totale
Riduzione parziale dell’ATP
necrosi
ridotta capacità protettiva e riparatrice
2008© J.F. DESAPHY
Inibitori della sintesi di ATP
Tossine
antimicina A
(Streptomyces griseus)
inibizione trasporto elettroni mitocondriali al citocromo b/c1
(batterio)
atrattiloside
(Atractylis gummifera)
inibizione scambio ADP/ATP nella membrana mitocondriale
interna
(vegetale)
Composti chimici
acido cianidrico
inibizione trasporto elettroni
fluoroacetato
Il fuoroacetil-CoA entra nel ciclo di Krebs dove è convertito in
fluorocitrato che blocca l’aconitasi
iodoacetato
inibizione della glicolisi per carbossilazione del gruppo SH
della gliceraldeide fosfato deidrogenasi
Disaccoppianti
pentaclorofenolo
bifenile policlorurato
(in vitro)
riduzione del potenziale elettrochimico mitocondriale per i
protoni
con conseguente inibizione della ATP-sintetasi
.
2008© J.F. DESAPHY
Danno cellulare indotto da ATP riduzione
ATP
Pompa Na/K
Trasporti attivi
Ingresso
Ca2+, Na+, H2O
Fuoriuscita K+
Rigonfiamento cellulare
e subcellulare
Perdita microvilli
Glicolisi anaerobica
glicogeno
pH
Addensamento
cromatina nucleare
Alterazione
attività enzimatica
Acidosi lattica
altri
Distacco ribosomi
ecc...
Sintesi proteica
Accumulo
di lipidi
2008© J.F. DESAPHY
Lo ione calcio: Secondo messaggero universale
1882, Ringer: gli ioni Ca2+ sono necessari nel perfusato per fare contrarre
un cuore di rana
1940, Heilbrunn: l'iniezione di Ca2+ nella fibra muscolare provoca
la contrazione
1960, Ebashi: il reticolo sarcoplasmatico, un vacuolo arricchito di Ca2+
la troponina, il Ca2+-sensore per la contrazione
mitocondri
reticolo
endoplasmatico
proteine sequestranti
calbindina
solubili parvalbumina
[Ca2+] = 10-7 mol/L
Contaction
TnC
CAM
MLCK
CAMKs
calcineurin
transcription factors
Adenylate cyclase
cyclic AMP-PDE
NOS
PKC, IP3-kinase
[Ca2+] = 10-3 mol/L
membrane
excitability
synaptogamin
secretion
phosphorylase
kinase
metabolism
vesicle traffiking
legami con
la membrana
Ca2+-ATPasi
scambiatore Na+/Ca2+
crosstalk with
other signaling
pathways
Ion channels
annexin family
cell proliferation
S100 family
canali ionici
proliferation
fertilization
learning and
memory
cancer and metastasis
mito enzymes
ATP synthesis
Steroid synthesis
caspases
apoptosis
Berridge et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2000
2008© J.F. DESAPHY
controllo dell’omeostasi del calcio
Estrusione dalla cellula:
Ca2+-ATPasi e scambiatore Na+/Ca2+ del sarcolemma
Assorbimento dai compartimenti intracellulari:
Ca2+-ATPasi e calsequestrina del RE
uniporto e scambiatore Ca2+/H+-Na+ dei mitocondri
Buffering dalle calcium-binding proteine citosoliche:
parvalbumina, calretinina, calbindina
Alterazione dell’omeostasi del calcio
Ridotta estrusione:
•ossidazione, arilazione, alchilazione dei gruppi –SH delle proteine di trasporto
•ridotta produzione di ATP
Aumentato influsso:
•apertura dei pori di transizione di permeabilità in seguito a
ossidazione dei nucleotidi pirimidinici e gruppi tiolici,
elevata [Ca2+] mitocondriale, stress ossidativo
•danneggiamento della membrana cellulare
•eccessiva eccitazione nei neuroni
•attivazione canali del calcio (mercurio sui VOC)
2008@ J.F. DESAPHY
Lo ione calcio: messaggero di morte
-produzione di ROS
e lisofosfatidi
-danneggiamento
delle membrane
fosfolipasi
(PLA2)
-disorganizzazione
citoscheletro
α-actinina
gelsolina
fosfatasi/chinasi
(calcineurin)
-alterazione della
trascrizione genica
-attivazione delle
endonucleasi
-produzione di •NO,
•O2- e ONOO-
-proteolisi
NO-sintetasi
proteasi
(caspasi, calpaina)
[Ca2+]
endonucleasi
-frammentazione
del DNA
MORTE
CELLULARE
2008© J.F. DESAPHY
bersagli cellulari delle sostanze tossiche
Ca2+
intracellulare
Stress
Ossidativo
Membrane
plasmalema
Distruzione delle proteine
Danno al DNA
lisosomi
ATP
mitocondri
Perdita del Digestione
Morte
contenuto
enzimatica
cellulare
cellulare
del contenuto
cellulare
Perdita di
funzioni
cellulari
ATP-dipendenti
2008© J.F. DESAPHY
FINE