patologie neonatali in agnelli e capretti associate ad

Large Animals Review, Anno 10, n. 6, Dicembre 2004
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PATOLOGIE NEONATALI IN AGNELLI E CAPRETTI
ASSOCIATE AD INFEZIONE DA CLOSTRIDI
GRAZIA GRECO, DOMENICO BUONAVOGLIA, ANNA MADIO,
MARTA TOTARO, MARIALAURA CORRENTE, BARBARA CONSENTI*,
ELVIRA TARSITANO, CANIO BUONAVOGLIA
Dipartimento di Sanità e Benessere degli Animali
Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Bari, 70010 Valenzano (Bari)
*Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Puglia e Basilicata - Foggia
In 25 allevamenti di ovicaprini dell’Italia Meridionale sono state analizzate le cause di mortalità neonatale, con particolare riferimento alle infezioni sostenute da germi appartenenti al genere Clostridium. In totale sono stati esaminati 102 agnelli e capretti. Il microrganismo più frequentemente isolato è stato C. perfringens. Per definire il tossinotipo prevalente, è stata impiegata una multiplex-PCR in grado di identificare i geni cpa, cpb, cpb2, etx, iap e cpe. Nell’84% degli allevamenti è stato identificato C. perfringens tossinotipo A, mentre nel restante 16% degli allevamenti è stato isolato C. perfringens tipo D. Non sono
stati mai identificati i tipi B e C. Il 24% degli stipiti isolati è risultato positivo per il gene cpb2, che codifica per la tossina denominata beta2.
Summary
A study was carried out in the South of Italy to assess the presence of clostridia in neonatal gastro-enteritis of young lambs
and kids. A total of 102 animals belonging to 25 herds were examined. C. perfringens was the microorganism of most common identification. C. perfringens isolates were analysed by polymerase chain reaction (PCR), to determine the prevalence of
the cpa, cpb, cpb2, etx, iap and cpe. The most prevalent toxin-type of C. perfringens was the type A representing 84%. No c.
perfringens type B, C, and E were detected. C. perfringens type D was isolated in 16% of the herds. About 24% of the isolates
were cpb2 positive.
INTRODUZIONE
Le patologie neonatali degli ovicaprini sono sostenute
da diversi agenti virali, tra cui spiccano i rotavirus, e batterici quali Escherichia coli, Salmonella spp. e Clostridium
spp. In particolare, C. perfringens, un germe anaerobio
capace di produrre spore resistenti al calore, è responsabile di diverse forme di enterotossiemia diversificate per
gravità e sintomatologia in funzione del corredo di tossine
prodotte dal batterio stesso20.
Nell’ambito della specie C. perfringens, infatti, si distinguono 5 differenti tossinotipi, definiti rispettivamente A,
B, C, D ed E sulla base della capacità di produrre 4 tossine letali maggiori, denominate alpha, beta, epsilon e iota
(α, β, ε, ι)7,19,20. C. perfringens tipo A produce la tossina
alpha, una fosfolipasi C codificata dal gene cpa, prodotta
anche da tutti gli altri tipi di C. perfringens (A-E)16; i tossinotipi B e C, oltre alla tossina alpha, producono la tossina
beta, codificata dal gene plasmidico cpb, capace di indurre necrosi a livello cutaneo nella cavia ed effetti letali nel
topo13. I tossinotipi B e D posseggono il gene plasmidico
etx codificante la tossina epsilon13, mentre C. perfringens
tipo E produce la tossina iota. Ciascuno dei tossinotipi,
oltre alle tossine maggiori tipo specifiche, è in grado di
produrre almeno 9 tossine minori (delta, theta, kappa,
lambda, mu, nu, gamma, eta ed una neuraminidasi). I tossinotipi A, D ed E sono capaci di produrre un’ulteriore
tossina attiva a livello enterico, l’enterotossina, responsabile di tossinfezioni alimentari nell’uomo.
C. perfringens β2-tossigenico è un altro particolare
gruppo di C. perfringens non ancora assegnato ad un
tossinotipo specifico9. La tossina, ben distinta dalla beta
e definita beta2 (β2), è capace di formare pori nelle cellule tissutali ed è stata trovata in diversi stipiti in associazione con la sola tossina α (tipo A), con le tossine α e
β (tipo C) o con le tossine α e β ed ε (tipo B). Stipiti di
C. perfringens β2 tossigenici sono stati isolati da suini
con gravi forme di enterocolite necrotico-emorragica,
da equini con tiflocolite e da bovini, asini, agnelli, elefanti, cani, orsi e leopardi affetti da gravi forme di enterite necrotico-emorragica4,8,9,10;11,12,15. Stipiti di C. perfringens tipo A β2 tossigenici sono stati isolati anche dal
contenuto intestinale di renne sane e di merluzzi (Gadus
morhua L.)2,3.
ALTRE SPECIE
Riassunto
32
Patologie neonatali in agnelli e capretti associate ad infezione da clostridi
Tra le patologie degli ovicaprini causate da clostridi si
riconoscono: l’enterotossiemia degli agnelli o yellow lamb
disease, che ha come agente eziologico C. perfringens tipo
A; la dissenteria degli agnelli e l’enterotossiemia emorragica delle pecore adulte, entrambe sostenute da C. perfringens tossinotipo B; l’enterotossiemia emorragica o necrotica degli agnelli e dei capretti e l’enterotossiemia acuta
(struck) delle pecore adulte sostenute da C. perfringens
tossinotipo C; la malattia del rene molle dei giovani e la
malattia da grano o da sovralimentazione degli adulti sostenute entrambe da C. perfringens tossinotipo D17,20. È
noto che si tratta di patologie condizionate in quanto le
spore di C. perfringens, normalmente presenti nel suolo e
nel contenuto intestinale di animali sani6, per l’azione di
fattori predisponenti quali bruschi cambiamenti di temperatura o errori alimentari, vanno incontro a rapida moltiplicazione nell’intestino con conseguente produzione di
grandi quantità di potenti tossine.
Scopo del lavoro è stato quello di analizzare le cause di
mortalità neonatale di agnelli e capretti valutando, in particolare, la prevalenza dei diversi tossinotipi di C. perfringens negli allevamenti del Sud Italia.
MATERIALI E METODI
Animali. Sono stati esaminati 87 agnelli e 15 capretti, di
età compresa tra 2 e 6 settimane (Tab. 1). Gli animali appartenevano a 25 differenti allevamenti, ciascuno compo-
sto da un numero di animali variabile tra 150 e 1000, distribuiti in aree geografiche diverse del Sud Italia (Puglia,
Basilicata e Calabria). Nella maggior parte degli allevamenti era stata effettuata la vaccinazione nei confronti delle clostridiosi, anche se, in molti casi lo schema vaccinale
non era stato corretto. Gli animali esaminati avevano mostrato segni clinici variabili: dolorabilità addominale, meteorismo, diarrea e decubito laterale. Negli animali di alcuni allevamenti (23/03, 56/03, 112/03 e 151/03) erano stati
osservati anche sintomi neurologici (ottundimento del sensorio, tremori muscolari, opistotono e convulsioni). Molti
soggetti erano morti senza segni clinici evidenti e, la mortalità, che generalmente si era attestata tra il 10% ed il
20%, in 2 allevamenti (112/03 e 151/03) ha raggiunto
punte del 40%. Gli animali sono stati sottoposti ad autopsia entro 6 ore dalla morte.
Indagini virologiche. Dal contenuto dell’ampolla rettale
di ogni animale è stata ricercata la presenza di rotavirus
mediante un test immunocromatografico (Rotascreen Dipstick, Microgen Bioproducts, Camberley, UK) e mediante
inoculazione del filtrato su colture cellulari di rene di
scimmia (MA-104) e di rene ovino coltivate in Dulbecco’s
Minimal Essential Medium (DMEM) (Gibco, Invitrogen
Corporation, Grand Island, NY). La replicazione virale è
stata monitorata con l’osservazione dell’effetto citopatico
e mediante il test di immunofluorescenza indiretta impiegando un siero iperimmune di coniglio verso rotavirus di
gruppo A.
Tabella 1
Quadro sinottico del segnalamento, dei segni clinici e necroscopici, e dei risultati dei test colturali e di genotipizzazione molecolare
Identificazione
23/02
26/02
38/02
39/02
42/02
54/02
129/02
133/02
143/02
21/03
22/03
23/03
26/03
43/03
44/03
46/03
54/03
56/03
66/03
69/03
92/03
112/03
151/03
10/04
14/04
Numero di
animali
Specie
Età
in giorni
Sintomi
clinici
Quadri necroscopici
10
3
1
1
1
1
2
1
6
2
2
2
1
1
4
1
3
3
1
2
6
40
6
1
1
ovina
ovina
ovina
ovina
caprina
ovina
caprina
caprina
caprina
ovina
caprina
ovina
ovina
ovina
ovina
caprina
ovina
ovina
ovina
ovina
ovina
ovina
ovina
caprina
ovina
20
2/20
20
20
2-3
120
20
20
20
21
3
3
20
2
20
20
30
30
120
30
3
30
3
20
30
SD
SD
SD
SD
SD
SD
D
D
SD
SD
SD
N, SD
SD
D
SD
SD
SD
N, SD
SD
SD
SD
N, SD
D, N, SD,
N, SD,
SD
En, PPE
HE, PPE
HE, PPE
En, PPE
En, PPE
HE, PPE
En, P
HE, PPE
HE, PPE
HE, PPE
En
En
En, PPE
En, PPE
En
En
BCU, HK, NHE
HE, PPE
En, PPE
BCU, NHE, PPE, HK
En
BCU, HK, NHE, PPE
BCU, HK, NHE, PPE
BCU, HK, NHE, PPE
BCU, HK NHE, PPE
rotavirus
negativo
Salmonella spp.
negativo
Corredo di tossine
dei ceppi di C. perfringens
(multiplex PCR)
α
α
α
α
α
α
α
α
α
α
α
α, ε
α
α
α
α
α, β2
α, ε, Ε
α
α, β2
α
α, β2, ε
α,β2, ε, Ε
α, β2
α, β2
Legenda: D, Diarrea; En, enterite; HE enterite emorragica; NHE enterite necrotico-emorragica; N, sintomi neurologici; PPE, Versamenti emorragici pleurici e
peritoneali; SD, morte improvvisa; HK, emorragie sulla corticale del surrene; BCU, coaguli negli ureteri; P, polmonite.
Analisi batteriologica. Per ciascun animale, sono stati eseguiti gli esami batterioscopici sulla mucosa intestinale, mediante
colorazione di Gram. Campioni di fegato, polmoni, reni,
cuore, duodeno e colon di tutti gli animali sono stati sottoposti ad arricchimento in brodo tetrationato, seguito da subcultura in agar verde brillante, per l’isolamento di Salmonella
spp. Le coltivazioni in anaerobiosi sono state eseguite su
“egg yolk agar” addizionato con cicloserina (400 mg/l)
[Tryptose Sulphite Cycloserine (TSC)] e agar sangue di pecora al 5%. Dopo incubazione a 37°C per 2 giorni, le colonie sospette sono state esaminate al microscopio, mediante
colorazione di Gram, ed inoculate in brodo tioglicolato
(FTG) (Difco) a 37°C per una notte. Un millilitro delle colture in FTG con D-cicloserina (400 mg/l) è stato utilizzato
per l’estrazione del DNA totale di C. perfringens impiegando
il kit commerciale QIAamp Tissues kit (QIAGEN Gmbh,
Germany) secondo le istruzioni del produttore.
Multiplex PCR. Il DNA estratto è stato sottoposto a screening diagnostico mediante multiplex-PCR per la ricerca
delle sequenze geniche codificanti le tossine α, β, β2, ε, ι, e
dell’enterotossina. La PCR è stata effettuata utilizzando il
DNA Thermal Cycler Gene AMP 9600 (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA). Le reazioni sono state eseguite in
volumi finali di 50 µl contenenti 7.5 µl di DNA campione e
42.5 µl costituiti dalla miscela di reazione (10 mM Tris HCl
pH 8.3, 8 mM MgCl2, 50 mM KCl, 200 µM di ciascun
dNTP, 2.5 U di Taq DNA polimerasi, 50 pM di ciascun primers7,12,14). La reazione è stata sottoposta ad una fase preliminare di denaturazione della durata di 5 minuti, seguita da
35 cicli di amplificazione consistenti in 1 minuto di denaturazione a 94°C, 1 minuto per l’annealing dei primers a 50°C
e 1 minuto per l’estensione della catena a 72°C.
Per l’analisi dei risultati della PCR, 8 µl del DNA amplificato sono stati esaminati tramite elettroforesi su gel di
agarosio all’1.5% in tampone tris borato (89 mM Tris, 89
mM Boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0), condotta a 80 V
per 45 minuti. Il gel è poi stato colorato con etidio bromuro (0.5 µg/ml) e visualizzato su transilluminatore (Fig. 1).
FIGURA 1 - Tossinotipizzazione mediante multiplex-PCR degli stipiti di
C. perfringens. I profili di amplificazione sono stati ottenuti usando coppie di primers specifici per i geni delle 4 tossine maggiori e per i geni
cpb2 e cpe. Le dimensioni (espresse in paia di basi, bp) dei prodotti di
amplificazione sono indicate sulla destra della figura. Linea 1: DNA Ladder 100 bp (Fermentas); linea 2: ATCC 12917 (positivo per i geni cpa e
cpe, tipo A enterotossigenico); linea 3: ATCC 3626, (positivo per i geni
cpa, cpb ed etx) tipo B; linea 4: ATCC 51880 (positivo per i geni cpa e
cpb), tipo C; linea 5: ATCC 3629 (positivo per i geni cpa ed etx), tipo D;
lane 6: ATCC 13124 (positivo per il gene cpa), tipo A; lane 7: stipite
GG17/02 di C. perfringens (positivo per i geni cpa e cpb2).
RISULTATI
In sede autoptica gli animali presentavano versamento
emorragico in cavità pleurica e peritoneale (Fig. 2). L’ileo e il
digiuno e buona parte del colon erano interessati da enterite
emorragica (Fig. 3). Il quadro necroscopico degli animali appartenenti a 6 allevamenti (54/03, 69/03, 112/03, 151/03,
10/04 e 14/03) era caratterizzato da grave enterite necroticoemorragica e dalla presenza di coaguli di sangue in entrambi
gli ureteri, fino all’ingresso in vescica. Il miocardio e la corticale renale presentavano ecchimosi diffuse (Tab. 1).
Tutti gli animali sono risultati negativi per rotavirus, sia
al test immunocromatografico che alle prove di isolamento. Anche la ricerca di Salmonella spp. ha dato esito costantemente negativo.
L’esame batterioscopico, eseguito sulla mucosa intestinale, ha evidenziato più di 10 bacilli Gram positivi per campo
microscopico. Da fegato, reni, polmoni, cuore, digiuno e
colon di tutti gli animali sono stati isolati numerosi batteri
anaerobi. Le colonie sono state identificate come C. perfringens sulla base dell’evidenza del colore nero e dell’attività lecitinasica della tossina α su TSC agar (Fig. 4), del
33
FIGURA 2 - Versamento emorragico in cavità pleurica.
FIGURA 3 - Meteorismo associato a enterite emorragica.
ALTRE SPECIE
Large Animals Review, Anno 10, n. 6, Dicembre 2004
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Patologie neonatali in agnelli e capretti associate ad infezione da clostridi
GRAFICO 1 - Prevalenza dei diversi tossinotipi di C. perfringens negli
allevamenti ovicaprini di Puglia, Basilicata e Calabria.
FIGURA 4 - Colonie di C. perfringens, lecitinasi positive su TSC agar.
doppio alone di emolisi su agar sangue (Fig. 5) e dell’aspetto dei microrganismi all’esame microscopico dopo colorazione di Gram (Fig. 6).
Genotipizzazione mediante multiplex-PCR degli stipiti isolati. Nell’ 84% degli allevamenti esaminati è stato isolato
C. perfringes tipo A. I tossinotipi B, C ed E non sono mai
stati ritrovati. Nel 16% degli allevamenti (23/03, 56/03,
112/03 e 151/03) sono stati isolati ceppi appartenenti al
tossinotipo D di cui 2 sono risultati produttori dell’enterotossina. Il 24% di tutti gli isolati è risultato positivo per la
tossina β2, con una diversa prevalenza fra i tossinotipi: 4
dei 21 isolati di tipo A (19%), 1 dei 2 isolati di tipo D e,
infine, 1 dei 2 isolati di tipo DE (tossinotipo D enterotossigenico) (Grafico 1).
DISCUSSIONE
FIGURA 5 - Fenomeno della doppia emolisi prodotto dalle colonie di C.
perfringens su agar sangue di pecora al 5%.
FIGURA 6 - C. perfringens dopo colorazione di Gram.
Nella presente indagine non sono mai stati isolati né C.
perfringens tipo E, e ciò in accordo con precedenti esperienze20, né tipo B, agente della dissenteria degli agnelli.
Quest’ultimo dato discorda con quanto descritto in altre
aree geografiche come Gran Bretagna, Sud Africa e
Grecia5,10 dove il tossinotipo B ha un’ampia diffusione.
In effetti i risultati della presente indagine hanno permesso di evidenziare una elevata circolazione di C. perfringens tipo A negli allevamenti in cui venivano segnalate forme di enterotossiemia negli agnelli e capretti di 2-5 settimane di età. C. perfringens tipo A, uno dei microrganismi più
diffusi nell’ambiente, è responsabile di numerose patologie
fra cui le diarree conseguenti a tossinfezioni alimentari, le
gangrene gassose dell’uomo e degli animali e le enterotossiemie che colpiscono gli animali tanto domestici che selvatici20. Il ruolo che C. perfringens tipo A svolge nelle gastrotossiemie non è completamente chiarito. Detto patogeno è
in grado di produrre come tossina maggiore solo la α, una
fosfolipasi C che danneggia le membrane cellulari dell’ospite attraverso l’idrolisi dei fosfolipidi di membrana conferendo al batterio attività citolitica, emolitica e dermonecrotica. Si ritiene però che l’attività fosfolipasica da sola, non
sia sufficiente a causare malattia anche se alcuni stipiti inducono malattia probabilmente perché sono in grado di
produrre la tossina in elevate quantità. La produzione della
Large Animals Review, Anno 10, n. 6, Dicembre 2004
Parole chiave
Clostridium perfringens, enterotossiemia, tossina β2.
Key words
Clostridium perfringens, enterotoxemia, β2-toxin.
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ALTRE SPECIE
tossina è regolata dall’espressione del gene cpa modulata, a
sua volta, da un meccanismo a sensore attivato da vari segnali ambientali20. Tutti gli stipiti isolati nella presente indagine sono risultati produttori attivi di tossina α, come
evidenziato dall’attività lecitinasica delle colonie su TSC
agar e dall’attività emolitica su agar sangue.
Negli allevamenti 54/03, 69/03, 10/04 e 14/04 sono stati
isolati stipiti di C. perfringens tipo A produttori di tossina β2.
Le lesioni osservate in sede necroscopica, con particolare riferimento alla enterite necrotico-emorragica, alle emorragie
miocardiche e renali e alla conseguente presenza di coaguli a
livello degli ureteri, erano di gravità maggiore rispetto a quelle osservate nei casi sostenuti da stipiti non produttori di tossina β2. Lesioni simili sono state riscontrate anche negli animali degli allevamenti 112/03 e 151/03, dove il grado di mortalità ha raggiunto il 40% e sono stati isolati due stipiti di tipo
D β2 positivi. Poiché né la tossina α né la tossina ε sono ritenute direttamente responsabili di tipiche lesioni necrotiche
sulla mucosa intestinale degli ovicaprini18, si potrebbe ipotizzare che la particolare gravità delle lesioni osservate derivi da
un sinergismo tra la tossina β2 e le tossine α (tipo A) o ε (tipo
D). Anche se il ruolo della tossina β2 nella patogenesi delle
malattie clostridio-associate non è ancora ben chiaro, sembra,
tuttavia, esistere una correlazione tra la presenza di tale tossina ed una maggiore gravità delle lesioni.
C. perfringens tipo D è stato isolato raramente negli allevamenti esaminati, e questo dato è in accordo con quanto
riportato in altre aree geografiche5,10. Da notare che 2 dei 4
stipiti di tipo D isolati sono risultati positivi per l’enterotossina. Le infezioni umane da stipiti enterotossigenici esitano in diarree profuse incoercibili e sono spesso associate
all’assunzione di alimenti poco cotti e/o impropriamente
conservati18. I dati del presente studio sono di un certo interesse in quanto in alcune aree del Sud Italia c’è la consuetudine di consumare dei piatti tipici preparati con pezzi di fegato di agnelli e capretti avvolti con l’intestino degli
stessi (“torcinelli”). Esiste pertanto il rischio di contaminazione di alimenti con germi tossigenici in grado di causare
episodi di tossinfezione umana, peraltro già documentati1.
La caratterizzazione degli stipiti isolati è stata realizzata
mediante una multiplex-PCR che evidenziando i geni codificanti per le diverse tossine, semplifica e abbrevia i tempi necessari per la definizione del tossinotipo. In passato,
la caratterizzazione veniva eseguita mediante prove di neutralizzazione su animali di laboratorio che, inevitabilmente, venivano sacrificati. Al contrario, l’impiego della PCR
permette di tipizzare il tossinotipo in modo rapido e preciso, fornendo informazioni indispensabili per calibrare la
profilassi vaccinale rispetto alla realtà epidemiologica.
Occorre, infine, sottolineare che molti ceppi isolati da
animali di allevamenti in cui era stata praticata la vaccinazione sono risultati positivi per la tossina β2. Questo dato
suggerisce che, per aumentarne l’efficacia, ai vaccini per le
clostridiosi attualmente in uso dovrebbe essere aggiunto il
tossoide β2. È lecito ipotizzare che molti dei casi di clostridiosi osservati possano essere stati causati da tossinotipi
resi più virulenti dalla presenza dei geni di tossine di nuova individuazione; tuttavia, molto spesso, i focolai di clostridiosi hanno alla base la mancata o non corretta applicazione dei piani di profilassi vaccinale che dovrebbero essere pianificati in funzione dei periodi critici in cui gli agnelli
e i capretti sono più sensibili all’azione di questi patogeni.
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