Identificazione del meccanismo di azione del NAMI-A

F O N D A Z I O N E
C A L L E R I O
O N L U S
RICHIESTA DI FINANZIAMENTO
PER IL TRIENNIO:
2001-2003
1. Identificazione
1.1. Titolo completo della proposta:
IDENTIFICAZIONE DEL
MECCANISMO D’AZIONE
DEL NAMI-A (IL FARMACO
ANTITUMORALE IDEATO A TRIESTE)
1.2. Acronimo:
I M A N
1.3. Organizzazione:
Fondazione Callerio Onlus, Istituti di Ricerche Biologiche, via A. Fleming 22-31, 34127
- Trieste, Italia.
1.4. Direttore della ricerca:
prof. Gianni Sava, Direttore Scientifico Fondazione Callerio Onlus, Professore
Associato di Farmacologia, Facoltà di Farmacia, Università di Trieste.
2. Area di intervento
Ricerca precompetitiva: ricerca sulle biotecnologie farmacologiche.
Tema della ricerca: “Identificazione del target cellulare e molecolare responsabile
dell’azione selettiva del farmaco NAMI-A, basato sul rutenio, sulle metastasi dei tumori
solidi”.
3. Modalità di svolgimento
Studio degli effetti del NAMI-A e di una serie di composti ad esso collegati, del ruolo
dell’induzione di differenziazione cellulare, di inibizione della capacità invasiva, delle
alterazioni e dei meccanismi fini di regolazione del ciclo cellulare, utilizzando linee
cellulari murine ed umane, caratterizzate da diverso potenziale metastatico, mediante
tecniche di citometria a flusso e di biologia molecolare.
Data
Nome
Firma del responsabile
MECCANISMO D’AZIONE DEL FARMACO ANTIMETASTASI NAMI-A
F O N D A Z I O N E
C A L L E R I O
O N L U S
RIASSUNTO DELLA PROPOSTA
Titolo:
Acronimo:
IDENTIFICAZIONE DEL MECCANISMO D’AZIONE
NAMI-A (IL FARMACO ANTITUMORALE IDEATO A TRIESTE)
DEL
IMAN
Il NAMI-A è un nuovo composto antitumorale ideato e sviluppato interamente a Trieste
grazie allo sforzo sinergico di ricercatori dell’Università, della Fondazione Callerio Onlus e di
POLYtech all’Area Science Park. Il NAMI-A è un composto basato sul rutenio ed è capace di
inibire la formazione e la crescita delle metastasi polmonari nei modelli di carcinomi
metastatici di laboratorio.
Le proprietà farmacologiche più importanti, acquisite nell’ambito di un finanziamento del
Fondo Trieste (anni 1998-2000; titolo del progetto: Progettazione e Sviluppo per Applicazioni
Cliniche di Farmaci Antitumorali Innovativi Basati sul Rutenio; acronimo: PSAIR), hanno
permesso di caratterizzare le attività antitumorali del NAMI-A e di far uscire il composto dal
laboratorio permettendo l’inizio della sperimentazione clinica di Fase I, al momento in corso
di completamento presso il Netherlands Cancer Institute di Amsterdam con la responsabilità
diretta di POLYtech e con il patrocinio della Fondazione Callerio Onlus.
Il NAMI-A non si pone come obiettivo l’interazione letale con componenti cellulari, tipica dei
composti attualmente in uso clinico e responsabile di una scarsa selettività d’azione ed una
pronunciata serie di effetti collaterali che limitano l’impiego terapeutico. Al contrario, il NAMIA sembra interagire con i meccanismi che sostengono la crescita delle cellule tumorali
metastatiche, riducendone la malignità. Tenuto conto che la prognosi infausta, nel caso dei
tumori solidi, è spesso data dalla presenza di metastasi che non possono essere facilmente
sradicate, l’effetto del NAMI-A è molto importante in terapia.
Il NAMI-A può quindi diventare il capostipite di una nuova generazione di farmaci
antitumorali innovativi le cui caratteristiche principali sono la selettività d’azione e la bassa
tossicità. A tale scopo è necessario comprendere a fondo il meccanismo fine della sua
azione antimetastatica, la cui conoscenza può permettere di indirizzare la sintesi di altri
analoghi potenzialmente più selettivi e più potenti. Lo studio proposto vuole provare l’ipotesi
che la selettività d’azione del NAMI-A è imputabile alla sua capacità di riconoscere una via
metabolica delle cellule metastatiche dei carcinomi sensibili non condivisa dalle altre cellule
tumorali o dalle cellule sane dell’organismo. In particolare, l’ipotesi da testare è che il
NAMI-A sia in grado di modificare l’espressione genica delle cellule tumorali
metastatiche, silenziando i geni che sostengono la malignità e l’immortalità
neoplastica e attivando i geni che regolano la normale crescita e morte cellulare.
Un ulteriore scopo della ricerca è quello di mettere a punto un sistema di valutazione in
laboratorio dell’attività antimetastatica di complessi del rutenio o di altri composti attraverso
una serie mirata di test in vitro. La realizzazione di questo modello di studio permette di
accelerare la realizzazione di nuovi composti e di ridurre drasticamente l’uso di animali per la
selezione pre-clinica di nuovi farmaci antitumorali.
La realizzazione della ricerca è garantita dalle numerose collaborazioni scientifiche
finalizzate allo studio dei complessi del rutenio che la Fondazione Callerio Onlus ha attivato
con Istituti e Dipartimenti di Università Italiane, Europee e Americane.
La ricaduta dello studio è quella di creare nei laboratori della Fondazione Callerio Onlus un
centro di eccellenza, riferimento per laboratori italiani e stranieri, per lo studio di farmaci
antimetastatici selettivi ed in particolare dei complessi del rutenio. Una ulteriore ricaduta
della ricerca è quella di mantenere a Trieste il primato di conoscenze acquisite negli ultimi
anni sui complessi di rutenio, garantendo quindi alla struttura che all’Area Science Park ha
ora il ruolo di sviluppare in clinica il NAMI-A (POLYtech), la possibilità di mantenere la
leadership nel settore e di sviluppare altri composti che possono derivare da questo studio.
Parole chiave:
meccanismo d’azione - farmacologia - tumori - terapia - sperimentale - applicazioni cliniche
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OBIETTIVI
L’obiettivo della ricerca è quello di identificare il meccanismo fine dell’azione selettiva di
inibizione delle metastasi dei tumori solidi del complesso di rutenio NAMI-A.
Cl
Cl
SOMe 2 Cl
Ru
Cl
+
NH
NH
N
NH
NAMI-A
Imidazolio trans-dimetilsolfossidoimidazolotetraclororutenato
Il NAMI-A è un farmaco antitumorale innovativo, basato sul rutenio, scoperto e sviluppato
interamente a Trieste utilizzando le sinergie dell’Università (Dipartimenti di Scienze Chimiche
e di Scienze Biomediche), della Fondazione Callerio Onlus e dell’Area Science Park
(POLYtech). Il NAMI-A è riuscito nell’impresa non comune di uscire dalla sperimentazione di
laboratorio e di entrare nelle fasi della sperimentazione clinica. Ora è quasi completata una
prima sperimentazione di fase I (determinazione della massima dose tollerata, MTD) presso
il Netherlands Cancer Institute di Amsterdam ed è in procinto di partire una seconda fase I,
con un altro schema di trattamento, a Edinburgo presso il Western General Hospital NHS
Trust in Scozia.
Le ricerche che la Fondazione Callerio Onlus si prefigge di condurre riguardano gli aspetti
biomedici ed in particolare farmacologici dei complessi del rutenio, sui quali c’è una
esperienza pluriennale, e possono essere suddivise in due parti. La prima parte è dedicata
allo studio del meccanismo di interazione del NAMI-A con i processi che regolano la
malignità dei tumori. La seconda è focalizzata allo studio di altri composti del rutenio, simili al
NAMI-A, ma dotati di caratteristiche di interazione chimica che permettano la validazione
delle ipotesi sul meccanismo d’azione antimetastatica del NAMI-A.
Lo studio proposto ha come obiettivo di provare l’ipotesi che la selettività d’azione del
NAMI-A è imputabile alla sua capacità di riconoscere una via metabolica delle cellule
metastatiche dei carcinomi sensibili non condivisa dalle altre cellule tumorali o dalle cellule
sane dell’organismo. In particolare, l’ipotesi da testare è che il NAMI-A sia in grado di
modificare l’espressione genica delle cellule tumorali metastatiche, silenziando i geni che
sostengono la malignità e l’immortalità neoplastica e attivando i geni che regolano la
normale crescita e morte cellulare.
La comprensione del meccanismo d’azione fine del composto riveste una importanza
determinante per permettere di indirizzare le fasi cliniche nell’uomo (fasi II e III) sulle
neoplasie più appropriate, finalizzando sia la riuscita della dimostrazione di attività sia, e
molto più importante, una significativa efficacia per i pazienti.
Un altro obiettivo della ricerca è quello di mettere a punto un sistema di valutazione in
laboratorio della potenzialità di complessi del rutenio o di altri composti nei confronti delle
metastasi tumorali attraverso una serie mirata di test in vitro. La realizzazione di questo
modello di studio permette di accelerare la realizzazione di nuovi composti e di ridurre
drasticamente l’uso di animali per la selezione pre-clinica di nuovi farmaci antitumorali.
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IMPOSTAZIONE DEL PROBLEMA SCIENTIFICO
% Surviving
Alcuni nuovi composti basati sul rutenio hanno dimostrato di interagire con i tumori solidi
metastatizzanti, riducendo la crescita delle metastasi e prolungando il tempo di
sopravvivenza degli animali portatori di neoplasia (1).
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
DAY S FROM SURGICAL REMOVAL OF PRIMARY TUMOR
Controls
Treatment group
Cisplatin-pre Ruthenium-pre
Effetti del NAMI (Ruthenium) e del cisplatino (Cisplatin) sulla sopravvivenza
postchirurgica in animali portatori del carcinoma mammario MCa e trattati a dosi
equitossiche prima della rimozione chirurgica del tumore primario.
Diversi studi, utilizzando i composti più attivi in vivo sulle metastasi, hanno inoltre dimostrato
l’assenza di citotossicità diretta per le cellule tumorali, in modelli in vitro con linee cellulari
stabilizzate di tumori sia murini sia umani (2-4).
NAMI-A
160
Cisplatin
% of Controls
*
120
*
80
*
**
40
0
C
1
10
100
1
10
M c o n c e n t r a t i o n
24 h
48 h
100
72 h
Effetti di 1 hr di trattamento con NAMI-A, in confronto al cisplatino, sulla crescita
di cellule KB in coltura. La figura indica la sopravvivenza cellulare dopo trattamento
in confronto ai controlli (100%).
Questo comportamento è in netto contrasto con quello dei farmaci citotossici antitumorali ed
in particolare con quello del cisplatino, composto di riferimento per i farmaci basati sui metalli
di transizione. Al contrario del cisplatino, ma anche dell’adriamicina, i complessi di rutenio
NAMI (sodio trans-tetraclorodimetilsolfossidoimidazolo rutenato) e NAMI-A (imidazolio transtetraclorodimetilsolfossidoimidazolo rutenato) sono privi di effetti antiproliferativi su cellule
del linfoma TLX5, della linea cellulare umana KB e dell’adenocarcinoma murino TS/A, e
modificano il ciclo cellulare solo in piccola misura, determinando l’accumulo transitorio delle
cellule nella fase pre-mitotica (4). L’accumulo di cellule in fase G2-M, determinato dal NAMIA, è correlato all’accumulo (dati in corso di studio) di due proteine chiave nella transizione
delle cellule dalla fase G2 alla fase di mitosi: le cicline B (5,6) e la ciclina A (7). Il NAMI-A
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interviene quindi nella regolazione e nel coordinamento dei processi essenziali che
sovrintendono alla duplicazione ed alla divisione cellulare. Tale azione si esplica in uno dei
punti principali di controllo del ciclo cellulare, in fase G 2 all’ingresso nella mitosi, come
avviene per la maggior parte dei segnali provenienti dall’esterno.
CONTROLS
NAMI-A 0.1 mM
Cisplatin 0.1 mM
24 h
48 h
72 h
Cicli cellulari di cellule KB trattate con NAMI-A o con Cisplatin per 1 hr. Nel caso di
NAMI-A c’è un blocco transitorio del ciclo nella fase G 2-M a 24 hr dal trattamento; nel
caso di Cisplatin il ciclo mostra una progressiva degenerazione, a partire da 48 ore del
trattamento.
Il NAMI-A, similmente al NAMI, causa un marcato ispessimento della matrice connettivale
del tumore primario, in particolare attorno ai vasi sanguigni intra-tumorali, suggerendo che
l’azione antimetastatica, almeno in parte, possa dipendere da un effetto del composto sui
meccanismi che regolano questo processo, ed in particolare sulle proteinasi della matrice
extracellulare (MMPs) (8,9).
Esempio di matrice tumorale di animale di controllo (sinistra) o trattato con NAMI-A
(destra). Il colorante blu mette in risalto il tessuto connettivo (C). L: linfociti, T: cellule
tumorali, V: vaso sanguigno.
Una prima prova del coinvolgimento delle MMPs, nell’attività antimetastatica del NAMI, è
stata ottenuta sul carcinoma mammario MCa, tumore che, dopo un ciclo di trattamento in
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vivo a dosi efficaci sulle metastasi, mostra un netto calo del bilancio tra MMP2 e TIMP2
(l’inibitore fisiologico di questa proteinasi), almeno per quanto concerne gli mRNA di questi
attori (8).
MMP2/TIMP2 (unità arbitrarie)
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
10
20
30
40
50
Dose (mg/kg/day)
Riduzione del bilancio tra MMP-2 e TIMP-2 nel tumore primario di topi portatori del
carcinoma mammario MCa e trattati con NAMI.
Questa osservazione, assieme a quelle che indicano il NAMI capace di prevenire la
formazione delle metastasi anche quando l’ospite viene trattato prima dell’impianto del
tumore (10,11), o di ridurre la capacità del tumore di dare metastasi senza alterare la sua
capacità di crescere (2), e quelle che indicano il NAMI-A capace di ridurre l’invasione
spontanea del matrigel da parte di cellule tumorali e di inibire la risposta di cellule endoteliali
a stimoli chemiotattici (manoscritto in preparazione), sembrano indicare per questi composti
un possibile target tissutale oltre che cellulare.
70
% cellule migrate
60
50
40
30
*
*
20
10
0
0
20
40
80
120
NAMI-A M
Effetti del NAMI-A sulla capacità delle cellule dell’adenocarcinoma TS/A di migrare
spontaneamente attraverso uno strato di matrigel in una camera di Boyden modificata.
Percentuale riferita ai controlli non trattati (=100).
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Questa ipotesi apre un possibile grande interesse farmacologico per questi composti in
quanto potrebbero risultare privi della capacità di indurre resistenza, fenomeno tipico per i
composti che hanno bersagli cellulari.
Inoltre, nei tumori trattati con NAMI-A i linfociti appaiono più numerosi e, nelle sospensioni
unicellulari dei tumori ottenute da campioni ex vivo, tendono ad attaccarsi alle cellule
tumorali in forma di rosette. Questo dato preliminare sostiene l’ipotesi che il NAMI-A moduli
le interazioni tra cellule e che questa sua attività non sia di nocumento alle cellule del
sistema immunitario.
Cellule tumorali del carcinoma mammario MCa circondate da linfociti.
L’effetto del NAMI-A sui TIL (linfociti associati al tumore) potrebbe avere un valore
terapeutico molto importante, in particolare per quei tumori sensibili alle terapie immunitarie
quali i melanomi.
La proliferazione incontrollata dei tumori, dipendente dall'abrogazione di almeno uno delle
vie di controllo che modulano il bilancio tra mitogenicità ed antimitogenicità (12-14), e
sostenuta da stimoli extracellulari verso specifici bersagli intracellulari, è basata su di una
sequenza di fosforilazioni citoplasmatiche comunemente nota come cascata MAPK (da
mitogen-activated protein kinase) (15,16). Questa cascata, anche modulando la capacità
delle cellule di andare incontro ad apoptosi, è responsabile dell'iniziazione e del controllo di
numerosi processi quali la trasformazione neoplastica, la differenziazione, la progressione
tumorale e le metastasi (17-21).
E' possibile pertanto che composti come il NAMI-A debbano la capacità di controllare la
crescita metastatica al blocco di queste interazioni, con ciò indicando un meccanismo
d'azione nuovo che plausibilmente dovrebbe portare ad identificare composti selettivi e privi
di effetti collaterali.
A
Esempio della riduzione della massa di una metastasi polmonare in un animale
portatore del carcinoma mammario MCa. A sinistra una tipica metastasi nel controllo
e a destra una metastasi nell’animale trattato con NAMI-A.
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B
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Il NAMI-A può quindi diventare il capostipite di una nuova generazione di farmaci
antitumorali innovativi le cui caratteristiche principali sono la selettività d’azione e la bassa
tossicità. A tale scopo è necessario comprendere a fondo il meccanismo fine della sua
azione antimetastatica, la cui conoscenza può permettere di indirizzare la sintesi di altri
analoghi potenzialmente più selettivi e più potenti.
Riferimenti bibliografici
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FASI E PRODOTTI DEL PROGETTO
Gestione del progetto. La Fondazione Callerio Onlus si assume la responsabilità della
gestione del progetto. Per la gestione scientifica, la pianificazione tecnica ed il controllo del
progetto la Fondazione Callerio Onlus si avvarrà del Comitato Tecnico di LINFA, il
laboratorio prodotto grazie anche allo studio PSAIR finanziato dal Fondo Trieste. Il comitato
di gestione si incontrerà in funzione delle esigenze di lavoro.
Il progetto prevede 2 brevi relazioni semestrali riguardanti i progressi tecnici (6° mese e 18°
mese), una relazione sulla valutazione a medio-termine (12° mese) ed una relazione finale
(24° mese). Le relazioni speciali che seguono indicheranno chiaramente i raggiungimenti a:
6 mesi: Messa a punto del test per la valutazione delle interazioni del NAMI-A con le vie di
trasduzione del segnale MAPK/ERK.
12 mesi: Risultati delle conseguenze della inibizione delle vie di trasduzione MAPK/ERK
sulla vitalità cellulare, sulla invasività e sulla capacità di adattamento ai substrati della
matrice extracellulare.
18 mesi: Risultati sulla variabilità di risposta cellulare al NAMI-A e ad altri analoghi strutturali
come conseguenza delle differenze di espressione delle vie di trasduzione del segnale
MAPK/ERK e della malignita cellulare.
24 mesi: Indicazione del meccanismo d’azione del NAMI-A, indicazioni di bersagli
terapeutici e ipotesi sui composti di seconda generazione.
Revisione a medio termine. Una relazione di valutazione dei progressi ottenuti nella ricerca
deve essere effettuata 12 mesi dopo l’inizio della sperimentazione. La relazione a mediotermine dovrà inoltre prevedere la pianificazione delle strategie future.
La Fondazione Callerio organizzerà dopo 13 mesi un incontro con tutti i possibili utenti del
prodotto a livello locale, allo scopo di discutere i raggiungimenti a medio-termine e definire il
programma di ricerca per la seconda fase di lavoro.
La valutazione a medio-termine deve soddisfare completamente il seguente programma
prima del 12° mese:
1. Risultati completi sulla interazione del NAMI-A con le vie MAPK/ERK in una linea
cellulare che permetta la translazione del dato sulla modulazione della malignità
metastatica.
2. Risultati completi delle prove di laboratorio riguardanti il diverso comportamento di
tre complessi di rutenio diversi dal NAMI-A, uno attivo sulle metastasi in vivo e due
inattivi. In base ai risultati ottenuti, verranno identificate le strutture chimiche da
proporre per la sintesi di nuovi composti da saggiare.
Risultati finali. I risultati attesi dal progetto consistono in:
a) una indicazione per il trattamento di tumori che esprimano il target sul quale si lega il
NAMI-A per esercitare l’attività antimetastatica;
b) una indicazione per strutture chimiche, basate sul rutenio, dotate di rapporto tra tossicità
ed attività antimetastatica più favorevole del NAMI-A;
c) un protocollo di studio da applicare in laboratorio per selezionare composti attivi sulle
metastasi dei tumori solidi.
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PRINCIPALI METODI DI STUDIO
Studi su cellule in coltura. Il modello di studio in vitro consiste nella valutazione degli effetti
dell’esposizione a dosi crescenti dei composti in esame di cellule MCF7, LoVo, T24, B1 e
TS/A coltivate su substrati della matrice extracellulare, quali laminina, fibronectina, collagene
tipoIV e matrigel. Le linee cellulari LoVo, MCF7, B16 e T-24 vengono ottenute dalla ATCC.
La linea cellulare TS/A è stata ottenuta dal laboratorio del prof. G. Forni (CNR Centro di
Immunogenetica ed Oncologia Sperimentale, Torino, Italy). La linea cellulare di cellule
endoteliali umane (HEC) viene isolata dal cordone ombelicale umano e coltivata secondo
Jaffe et al.,J.Clin.Invest. 52, 245-2756, 1973.
Dopo esposizione al composto in esame per tempi brevi (da 15 minuti a 4 ore) e lunghi (24,
48 o 72 ore), le cellule, a parte gli studi diretti sulla vitalità cellulare mediante i test della
solforodamina B e dell’MTT,
a) vengono seminate su una membrana di matrigel in una camera di Boyden per
valutare la capacità invasiva,
b) vengono colorate con propidio ioduro e con marcatori fluorescenti per la
valutazione in citometria a flusso rispettivamente del ciclo cellulare e della
variazione di espressione di antigeni specifici quali le beta-integrine, e
c) vengono sottoposte a spettroscopia di assorbimento atomico per determinare il
quantitativo di rutenio entrato nella cellula.
Su un’aliquota delle stesse cellule, vengono inoltre studiati i livelli della proteina cdc2,
mediante “western blot”, della frammentazione del DNA mediante elettroforesi su gel di
agarosio, dell'attività caspasica, delle kinasi MAP e del c-myc, c-fos e dell'ornitina
carbossilasi dopo estrazione dell'RNA ed amplificazione mediante RT-PCR; i mezzi
condizionati vengono invece utilizzati per valutare, mediante “western blot”, la variazione di
rilascio di MMPs.
Separatamente i composti vengono anche studiati direttamente sui mezzi condizionati
ottenuti da colture di HT-1080 fibrosarcoma umano per valutare, mediante zimografia, la
capacità di inibire le MMPs rilasciate dalle stesse.
Studi sui composti metallici in modelli animali. I modelli animali impiegati, costituiti da
tumori solidi trapiantabili dei roditori, capaci di dare metastasi spontanee, vengono impiegati
allo scopo di determinare gli effetti differenziali dei complessi metallici esaminati sulla
crescita del tumore primario e sulla formazione delle metastasi spontanee. Le linee di tumori
impiegate in vivo, Lewis lung carcinoma e B16 melanoma, provengono dal Tumour
Repository Bank dell'NIH di Bethesda, MD, USA. Il carcinoma mammario MCa proviene dal
laboratorio di biologia del Rudjer Boskovich Institut di Zagabria (Croazia) che l'ha isolato,
caratterizzato come riportato in Poljak-Blazi M et al., Vet. Arh. 51: 99-103, 1981.
Un obiettivo degli studi, oltre all’effetto di riduzione delle masse tumorali, è quello di valutare
la corrispondenza tra questi effetti e il prolungamento dell’aspettativa di vita dell’ospite
portatore di tumore. Questo effetto potrà essere valutato separando l’influenza degli effetti
sul tumore primario da quelli sulle metastasi, con opportuni esperimenti nei quali il
trattamento farmacologico con i composti in esame viene associato alla rimozione chirurgica
del tumore primario effettuata a tempi diversi dall’impianto tumorale.
Il modello di studio in vivo consiste nella valutazione degli effetti del trattamento sulla
crescita del tumore esaminato, e la scelta dei tumori proposti permette la valutazione di
risposte antitumorali su istotipi diversi, su un tumore polmonare (Lewis lung carcinoma), su
un melanoma (melanoma B16)me su un carcinoma mammario (MCa mammary carcinoma).
Il modello in vivo permetterà inoltre di valutare l’attività farmacologica in confronto alla
tossicità sistemica o d’organo. Infatti, oltre al parametro classico di variazione di guadagno di
peso corporeo, potranno essere valutate tossicità specifiche a livello epatico e renale (due
bersagli abbastanza ovvi per complessi di metalli pesanti) sia attraverso l’uso di kit che
misurano i livelli plasmatici di indicatori specifici, quali GPT e creatinina, sia attraverso l’uso
di metodiche istologiche con test biochimici effettuati su fettine ottenute al criostato, quali la
6-fosfato deidrogenasi, indicatore di necrosi, o le fosfatasi alkaline o ancora le attività
nitrossido sintasiche.
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Queste tecniche istologiche saranno applicate anche a fettine di tumore primario per capire
a quale livello attribuire l’effetto citotossico misurato. Inoltre, considerando che esperimenti
preliminari hanno dato indicazioni positive, l’uso di sonde fluorescenti che misurano le attività
mitocondriali potranno essere usate per monitorare la durata nel tempo degli effetti tossici,
sia per quanto attiene alle tossicità renali sia alle attività antitumorali dipendenti da effetti
citotossici.
Mediante studi di immunoistochimica con microscopia a luce trasmessa verranno
visualizzate le aree del microambiente tumorale maggiormente interessate dagli effetti
farmacologici, in particolare per associare l’effetto sulla regolazione delle proteinasi e sul
conseguente aumento di materiale connettivale extracellulare.
Lo studio delle zimografie e delle modificazioni delle cicline e delle MAPK verranno effettuate
anche da campioni ex vivo di tumore primario e di metastasi polmonari ottenute da animali
trattati con dosi farmacologicamente attive sulle metastasi spontanee di tumori quali il Lewis
lung carcinoma, il MCa mammary carcinoma e il melanoma B16.
L'uso dei modelli in vivo è mirato ad ottenere informazioni sulle attività differenziali dei
composti esaminati sulla crescita del tumore primario e sulla formazione di metastasi
sistemiche (polmonari nel caso dei tumori sopramenzionati). Inoltre, le attività
farmacologiche verranno pesate in confronto alla tossicità sistemica o specifica d'organo che
i composti esaminati potranno evidenziare. Lo scopo dello studio è quello di valutare la
trasferibilità del risultato in vitro in un modello complesso di ospite in toto. Inoltre, in aggiunta
a questi dati, il modello in vivo servirà anche per capire le relazioni tra attività farmacologica
e proprietà farmacocinetiche (t1/2 e distribuzione d'organo) dei composti esaminati.
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RICADUTE DELLA RICERCA
Le ricadute prevedibili abbracciano molteplici aspetti e riguardano principalmente la ricerca
scientifica ad alto contenuto innovativo. Si ritiene che lo sviluppo di questi studi possa
determinare:
a) la nascita di un centro di riferimento internazionale per gli studi di farmacologia di base dei
composti di rutenio attivi sulle metastasi dei tumori solidi;
b) un impulso allo sviluppo clinico del NAMI-A e la possibilità di identificare strutture da
affiancare ad esso e dotate di effetti più selettivi per le neoplasie più comuni.
Ricadute occupazionali
IM AN costituisce un riferimento per lo svolgimento di ricerche di base di alto contenuto
innovativo. Le ricerche previste tenderanno a riguardare tutti i settori delle discipline
biomediche. E’ quindi facile ipotizzare che, se da un lato IM AN valorizza i ricercatori della
Fondazione Callerio Onlus, con cui nasce, dall’altro impone l’obbligo di allargare lo staff di
ricerca per includere nuove competenze. L’inclusione di unità di ricerca ad alta
specializzazione tecnologica permette la preparazione di ricercatori che vanno a collocarsi
negli ambiti di ricerca appropriati, sia dell’industria di settore, sia delle istituzioni della ricerca
scientifica.
Ricadute didattiche
Lo svolgimento di IM AN nella Fondazione Callerio Onlus, in stretto contatto con le strutture
biomediche dell’Università degli Studi di Trieste, permette di trasferire le conoscenze al
mondo accademico e quindi agli studenti dei corsi di laurea e di diploma delle Facoltà
biomediche, quali la Facoltà di Scienze, quella di Farmacia e quella di Medicina e Chirurgia.
La realizzazione delle ricerche previste da IM AN può, in tale modo, aumentare il servizio
didattico che la Fondazione Callerio Onlus già svolge, permettendo l’allargamento del
numero di studenti universitari che frequenteranno i laboratori per lo svolgimento della tesi di
laurea, per la frequenza ai seminari scientifici e per la frequenza postlauream per tirocini di
specializzazione.
Ricadute scientifiche
La ricaduta scientifica principale dell’attivazione del progetto IM AN è la sua organizzazione
scientifica che consente una ricerca completamente integrata del problema del trattamento
farmacologico delle metastasi dei tumori solidi. Questa ricerca è infatti molto spesso
frammentata nelle diverse aree di interesse specifico (la sintesi dei composti, la valutazione
del potenziale citotossico in vitro, gli studi meccanicistici di attività, lo studio in vivo) in diversi
laboratori. L’obiettivo di IM AN, di contenere queste competenze all’interno di un gruppo
omogeneo di valutazione comparata dei diversi aspetti della farmacologia delle metastasi,
permette quindi di accorciare i tempi per la comprensione del potenziale farmacologico
offerto dagli approcci proposti alla valutazione di IM AN.
Ricadute economiche
Tutte le risorse che si rendono disponibili alla Fondazione Callerio Onlus dall’attivazione di
IM AN sono interamente investite in capitale umano ed attrezzature per permettere alla
Fondazione Callerio Onlus di crescere e di dare affidabilità alle attività svolte.
Va comunque sottolineato che una ricaduta economica riguarderà direttamente il NAMI-A,
questo farmaco “triestino” che ha in corso le prime fasi della sperimentazione clinica e che
potrà trarre notevoli benefici dalle informazioni che deriveranno dagli studi di IM AN. In
questo contesto è importante considerare che la Fondazione Callerio Onlus ha attivato una
convenzione con POLYtech, la società con sede in Area Science Park che detiene i brevetti
e sostiene gli oneri della sperimentazione clinica del NAMI-A, che facilita gli scambi di
informazioni a tutto beneficio della realizzazione finale di questo farmaco antitumorale
innovativo.
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IMPLICAZIONI ETICHE
DICHIARAZIONE
“Dichiaro di attenermi alla dichiarazione di Helsinki nella sua ultima versione e
specificamente, prima di iniziare la presente ricerca e in caso di coinvolgimento di soggetti
umani nella ricerca, dichiaro di ottenere il permesso del competente comitato etico.
Devo inoltre essere subordinato ad un comitato etico competente in caso di ricerca che non
coinvolga gli esseri umani ma che abbia comunque implicazione etiche (es. uso di tessuti
fetali1).
Nell’attuare la ricerca proposta, dichiaro di aderire fedelmente a tutte le norme etiche e di
sicurezza applicate nei paesi nei quali viene svolta la ricerca.
Infine, dichiaro di applicare la futura Convenzione Bioetica del Consiglio d’Europa qualora
essa venga modificata nei paesi in cui la ricerca viene svolta”.
Data:
Ricercatore responsabile: prof. Gianni Sava
Firma:
1
Ogni utilizzo di tessuti fetali sarà condotto sotto strette condizioni etiche che escludono ogni
pressione finanziaria, psicologica o di ogni altra natura sulla donna incinta.
2 “Quando possibile, la sperimentazione ed i test sugli animali devono essere sostituiti da metodiche in
vitro o di altro tipo. Non si modificherà o cercherà di modificare la costituzione genetica dell’uomo né
mediante alterazione delle cellule germinali, né di nessuno stato di sviluppo dell’embrione che possa
rendere questi cambiamenti ereditari, né la ricerca cercherà di sostituire il nucleo di una cellula di
qualunque persona, embrione o embrione sviluppato, tramite clonazione” [Decisione del Parlamento
Europeo e del Consiglio del 26 aprile 1994, OJL126, 18.594,p.18]
In questo progetto è richiesto l’uso di topi di allevamento per test in vivo e per l’ottenimento
di cellule del sistema immunitario. Il topo rappresenta il modello di minore sviluppo
neurologico, tra i mammiferi, compatibile con lo studio. Inoltre sarà usato il minore numero di
animali compatibile con il significato statistico dei risultati e che corrisponde
approssimativamente a circa 100 topi singenici del ceppi CBA, per anno.
Gli animali sono necessari in quanto permettono lo studio delle proprietà biologiche dei
composti selezionati, della farmacocinetica di distribuzione negli organi, della biodisponibilità
e delle vie e della velocità di eliminazione e dell’impatto farmacodinamico dei composti
stessi. Occorre qui sottolineare che questi studi sono indispensabili se si considera che
molto spesso composti efficaci in vitro su colture cellulari sono virtualmente inattivi in vivo a
causa di proprietà farmacocinetiche sfavorevoli.
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FATTIBILITÀ DEL PROGETTO
Il gruppo proponente ha competenze avanzate sulla ricerca proposta e sulla possibilità di
sviluppo della stessa. Inoltre, il gruppo di ricerca della Fondazione Callerio Onlus può
contare su una fitta rete di collaborazioni con laboratori, prevalentemente di chimica. Dalla
collaborazione scientifica iniziale con il Prof. G. Mestroni (Dipartimento di Scienze Chimiche
dell'Università di Trieste), nell'ambito dello studio delle proprietà antitumorali di complessi
organometallici di Rodio, Iridio e Rutenio, che ha portato alla sintesi ed alla caratterizzazione
delle proprietà antimetastasi del NAMI-A, sono stati perfezionati ulteriori rapporti di
collaborazione scientifica con i laboratori che si occupano di complessi di rutenio (B. Keppler
Università di Vienna, J. Redijk Università di Leiden, P. Sadler Università di Edinburgo, K.
Nolan Università di Dublino, M.J. Clarke Università di Boston, F. Gonzales-Vilchez Università
di Siviglia). Più recentemente sono stati inoltre avviati rapporti di collaborazione con le
Università di Padova (L. Cima), Novara (I. Viano), Firenze (L. Messori – E. Mini), Bari (M.
Coluccia – D. Giordano), Verona (L. Leone) e di Sassari (B. Tadolini) sempre finalizzati allo
studio di farmaci antitumorali basati sui metalli.
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