Terapia Genica

Terapia Genica
• E’ un approccio moderno per trattare, curare
o in ultima analisi prevenire una malattia
cambiando l’espressione di uno o più geni.
Può essere applicata a cellule somatiche o a
cellule germinali.
• La terapia genica allo stato attuale è
largamente sperimentale. La terapia genica
germinale non è ad animali di grossa taglia e
all’uomo.
Gene therapy in medicina
interna
• Definizione: modificazione di un
fenotipo mediante trasferimento di (un)
gene.
• Notevolmente sviluppata dal punto di
vista sperimentale in modelli cellulari ed
animali.
• Relativamente avanzata dal punto di
vista clinico.
Cosa è realmente la terapia
genica?
• Per inserire un gene in un sistema
complesso bisogna innanzitutto avere
un gene.
• La terapia genica fornisce quindi uno
strumento per conoscere meglio le
funzioni dei geni e delle proteine da essi
codificati.
A cosa serve la terapia
genica?
• Cancro: cellule tumorali, progenitori ematopoietici,Tcells, fibroblasti, cellule muscolari.
• Disordini ereditari monogenici: cellule epiteliali
polmonari, macrofagi, progenitori ematopoietici,
epatociti, cellule muscolari.
• Malattie infettive: cellule T, progenitori ematopoietici,
cellule muscolari.
• Malattie cardiovascolari: cellule endoteliali, cellule
muscolari.
• Artrite Reumatoide: cellule epiteliali sinoviali.
• Sindrome del tunnel Carpale: cellule nervose.
Sistemi di gene transfer
•
•
•
•
•
DNA nudo
Lipidi cationici
Particelle di DNA condensato
Gene guns
Virus
Dna nudo
• Funziona meglio in vivo che in vitro.
• Uso: vaccini.
• Pro: economico e facilmente
maneggiabile.
• Contro: poco efficiente, breve
espressione, non si presta a selettività
tissutale, crea infiammazione (CpG non
metilate).
Lipidi Cationici
• Legano il DNA mediante interazioni
elettrostatiche (non covalenti)
• Transitorio
• Uso: Fibrosi Cistica (entra bene
nell’epitelio polmonare)
• Pro: come il DNA nudo.
• Contro: bassa efficienza, breve
espressione.
DNA condensato
• I polimeri usati sono: polilisine,
oligopeptidi,imine polietileniche.
• Pro: si presta a future manipolazioni
può prababilmente favorire la selettività
se usato insieme ad altre tecnologie.
• Contro: come si fa a far andare il dna
nel nucleo (dove deve replicarsi).
Gene Guns
• Cannoncini che sparano il DNA nudo o
nelle cellule (difficile in vivo) o
nell’interstizio. E’ un alternativa
all’iniezione.
• Pro: bassa immunogenicità. Sostituirà
l’ago nell’iniezione di DNA nudo.
• Contro: Si può sparare sulla pelle, ma
quali altri organi?
Elettroporazione
• Mediante delle differenze di potenziale
(scariche elettriche) si fanno dei buchi
sulla membrana citoplasmatica e il DNA
entra nelle cellule.
• Poco applicabile in vivo, in vitro “uccide”
molte cellule.
Vettori virali
• Adenovirus.
• Retrovirus.
• Virus Adeno associati (AAV): Parvo
virus.
Adenovirus
• I più efficaci sistemi di gene transfer a disposizione.
• Oltre 50 sierotipi di AV umani.
• In G.T: si usano quasi esclusivamente il sierotipo 2 e
5, in più comuni.
• 36 Kb DS-DNA.
• >50 polipeptidi divisi in:
-E1 fattori di trascrizione.
-E2 replicatori genoma virale
-E3 Fattori prottetivi immunogeni
-E4 replicatore genoma virale
First generation: E3 def. Circa 7.5 KB
Newer generations: E1,E2/E4.
• Promotore CMV.
• Fegato sito di maggiore uptake.
• Pro: molto efficaci, elevata e rapida
espressione, relativa specificità.
• Contro: tossici, rapida eliminazione,
molti umani sono già sensibilizzati,
spesso contaminati.
Retrovirus
• SS-RNA avviluppato in lipidi, 7-11 KB, si
inseriscono nel genoma dopo essere stato
retrotrascritto.
• Si divide in: Onco Retrovirus, Lenti virus,
Spuma virus.
• Infezioni croniche. Ben tollerati dall’ ospite in
cui si slatentizzano di tanto in tanto.
• GAG: proteine strutturali; POL: polimerasi;
ENV: proteine di superficie.
• 83 KB di Dna eterologo che si può inserire
nel genoma.
• Prolonged transgene expression.
• Ridotti livelli di espressione.
• Le proteine di superficie hanno recettori
specifici sulle membrane cellulari, per
cui entrano più facilmente in alcuni
tessuti che in altri.
• Vengono rapidamente eliminati dal
circolo.
• Molto usati ex vivo, poco usati in vivo.
Virus Adeno Associati (AAV)
•
•
•
•
•
Parvovirus.
Necessitano di un helper.
6 sierotipi, si usa il 2.
Non ci sono malattie associati agli AAV.
Nel genoma ci sono 2 geni che producono
multipli polipeptidi:
- REP
produce prodotti per la
replicazione.
- CAP
produce proteine strutturali.
• REP permette l’ integrazione nel
cromosoma 19.
• Espressione lenta ma duratura
• 5.0 KB di spazio.
• Pro: espressione stabile e duratura.
• Contro: poco spazio, difficile da
produrre su larga scala.
Studi clinici
• Malattia: Ischemia (Miocardio,Claudicatio
intermittens).
• Gene: VEGF.
• Transfer: in vivo.
• Vettore: Dna nudo.
• Risultati: VEGF è un fattore solubile. L’iniezione di
DNA nudo IM conduce all’aumento dei livelli circolanti
del fattore
induzione della neoangiogenesi.
Rivascolarizzazione eterotropa del vaso.
• Obiezioni: Studio in fase 1, mancano i controlli. Per il
miocardio, mancano evidenze angiografiche di
rivascolarizzazione, solo evidenze “morfologiche e
funzionali” ottenute alla scintigrafia.
Studi di fase I/II per valutare la
tossicità
•
•
•
•
•
•
1° studio: Malattia SCID.
Gene: ADA.
Transfer: ex vivo in T Cell.
Vettore: LASN (Retrovirus).
Risultato: miglioramento del quadro clinico
Obiezioni: scarso numero di pazienti (n=2)
assenza di controlli. La terapia tradizionale
non fu discontinuata.
• NIH trial.
• Telethon study.
Caso Gelsinger
• Malattia: Iperammonemia.
• Gete: OTC (Ornithyne
Transcarbamylase).
• Transfer: in vivo, target: il Fegato.
• Vettore : Adenovirus, replicatio deficient.
• Risultato: morte per ARDS nell’ ambito
di SIDS.
Gene therapy in Hypertension
• L’ ipertensione è una sindrome (malattia) a
trasmissione familiare, ma multifattoriale.
Probabilmente più di un gene vi è coinvolto e
alcuni geni in certi tipi di ipertensione sono
più colpevoli di altri.
• Si definisce iperteso:
Sistolica >140 mmHg.
Diastolica > 90 mmHg
Condizioni cliniche che
derivano dall’ipertensione
•
•
•
•
•
Stroke
Cardiopatia ipertrofica e poi dilatativa.
Cardiopatia ischemica.
Arterosclerosi.
Insufficienza renale.