Diapositiva 1 - Zanichelli online per la scuola

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Biotecnologie:
tecniche e
applicazioni
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Il clonaggio e il DNA ricombinante
Il clonaggio è una tecnologia usata per ottenere molte copie
di un frammento di DNA, introducendolo in organismi ospiti
con l’uso di vettori.
Il DNA ricombinante indica una molecola di DNA in cui sia
presente l’informazione genetica proveniente da due o più
organismi differenti.
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Il cDNA
Il primo passo del clonaggio è l’isolamento di una sequenza
di DNA. È possibile clonare un filamento di DNA o la copia a
DNA di un mRNA; quest’ultimo approccio è il più comune
nelle biotecnologie.
Le copie a DNA di un mRNA sono chiamate cDNA (DNA
complementare) e possono essere raccolte in librerie di
cDNA.
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La trascrittasi inversa /1
L’enzima trascrittasi inversa genera cDNA da uno stampo di
mRNA.
5’
AUAAC
3’
5’
TATTG
L’enzima inizialmente copia il
singolo filamento di mRNA,
producendo un ibrido
DNA/RNA a doppio filamento.
……..AUAAC
ibrido DNA/RNA
3’
……..TATTG
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La trascrittasi inversa /2
3’
……..TATTG
5’
……..ATAAC
3’
……..TATTG
La trascrittasi inversa può
degradare il filamento di RNA,
lasciando un singolo filamento
di DNA.
In seguito sintetizza il filamento
di DNA complementare,
generando un cDNA a doppio
filamento.
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I vettori di clonaggio
I vettori plasmidici sono molecole di DNA circolare che
possono essere usati per introdurre cDNA nelle cellule ospiti.
I plasmidi sono elementi genetici che si trovano nei batteri e
che possono essere modificati in laboratorio.
gene
reporter
sito di
restrizione
origine di
replicazione
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I vettori plasmidici hanno un
origine di replicazione (ori), un
gene reporter (per esempio, la
resistenza a un antibiotico) e siti
di restrizione, che possono
essere riconosciuti da enzimi di
restrizione.
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Gli enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione riconoscono specifiche sequenze
di DNA (sequenza di riconoscimento o sito di restrizione),
a livello delle quali tagliano la doppia elica.
sito di
taglio
sito di
taglio
……..GGTGAATTCAGC…ATGCAGCTGTAGC……
…….CCACTTAAGTCG…ATCGTCGACATCG……
sequenza di
riconoscimento
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Le DNA ligasi
Per inserire un cDNA in un vettore, è necessaria l’azione
dell’enzima DNA ligasi.
Le DNA ligasi sono enzimi che catalizzano la formazione di un
legame fosfodiesterico tra due nucleotidi, legando insieme
due filamenti di DNA.
5’
……..ATAAC
……..TATTG
3’
3’
5’
5’
3’
……..CGGAT
……..GCCTA
3’
5’
DNA ligasi
5’
3’
……..ATAAC
……..TATTG
3’
5’
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Il clonaggio e la selezione /1
Le sequenze di cDNA e il vettore di clonaggio sono trattati
con lo stesso enzima di restrizione, in modo che le estremità
tagliate delle molecole siano complementari.
enzima di restrizione
i frammenti di cDNA si mescolano ai
frammenti di DNA plasmidico
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Il clonaggio e la selezione /2
DNA ligasi
La DNA ligasi unisce il cDNA
all’interno dei vettori
plasmidici.
Il DNA ricombinante (vettori
che contengono cDNA) è
inserito nelle cellule
batteriche, in un processo
chiamato trasformazione.
Solo alcune cellule ricevono
il plasmide.
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Il clonaggio e la selezione /3
Le cellule che contengono il vettore hanno acquisito la
resistenza a un antibiotico; in questo modo è possibile
selezionarle mettendo le cellule in un mezzo di coltura
che contiene l’antibiotico.
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La PCR: amplificare una sequenza genica
La reazione a catena della
polimerasi (PCR) è una
tecnologia usata per
ottenere molte copie di una
sequenza di DNA.
Consiste in una serie di cicli
di denaturazione,
appaiamento dei primer e
allungamento. Alla fine la
sequenza originaria è
amplificata per ogni ciclo n di
un fattore 2n (32 cicli =
= 232 copie = > 109 copie).
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Il sequenziamento del DNA /1
Per “leggere” il tipo e l’ordine dei nucleotidi in una molecola di
DNA è necessario avere:
• un filamento di DNA stampo – la sequenza che vogliamo
conoscere;
• un primer complementare a una regione del DNA stampo;
• l’enzima DNA polimerasi;
• un mix di 4 dNTP (desossiribonucleosidi trifosfati);
• ddNTP (didesossiribonucleosidi trifosfati) marcati con
fluorescenza.
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Il sequenziamento del DNA /2
La DNA polimerasi è messa in incubazione insieme al DNA
stampo, 4 dNTP e uno specifico ddNTP, che ferma
l’allungamento della catena.
Con 4 reazioni separate, una per
ciascun ddNTP, è possibile
identificare ogni base nel DNA
stampo.
La PCR permette l’uso di una piccola
quantità di DNA per ottenere un
sequenziamento.
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Il Progetto Genoma Umano
Nel 2003 il Progetto Genoma Umano ha annunciato il
sequenziamento completo del genoma umano. È stato un
progetto di ricerca internazionale, finanziato con fondi
pubblici e iniziato nel 1990.
I risultati del progetto possono essere utili per:
• identificare mutazioni associate a diverse malattie;
• progettare farmaci e trattamenti più efficaci;
• studiare l’evoluzione umana;
• migliorare le scienze forensi.
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Le biotecnologie forensi
Le biotecnologie hanno cambiato la ricerca scientifica nelle
investigazioni criminali:
• con la PCR è possibile amplificare anche piccole quantità
di DNA da campioni biologici;
• è possibile fornire un profilo genetico unico a un campione
di DNA.
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L’impronta genetica
Ciascun individuo possiede una propria impronta genetica
(DNA fingerprint) che lo caratterizza in modo unico.
La tecnica per ottenere l’impronta
genetica utilizza brevi sequenze
ripetitive che sono molto variabili (SRT,
short tandem repeats), costituite dalla
ripetizione di 3-5 nucleotidi.
Dopo l’amplificazione con PCR, i
prodotti sono mostrati su gel di
agarosio.
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Organismi geneticamente modificati
Le biotecnologie possono essere utilizzate per modificare il
genoma di alcuni organismi (OGM, organismi
geneticamente modificati), per generare nuove varietà o per
cancellare, introdurre o modificare una caratteristica
dell’organismo.
È possibile modificare geneticamente batteri, animali o piante.
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Le biotecnologie e l’agricoltura
In agricoltura sono state utilizzate alcune specie
geneticamente modificate per ottenere:
• migliori processi di maturazione;
• resistenza ai diserbanti (o ad altri trattamenti chimici);
• resistenza agli stress (freddo, salinità, siccità);
• resistenza ai parassiti (virus, batteri, insetti, funghi);
• miglior valore nutrizionale;
• produzione di proteine ricombinanti esogene (enzimi,
anticorpi, antigeni per vaccini).
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Esempi di piante geneticamente
modificate
Resistenza ai diserbanti: mais, cotone, soia, in cui è stato
inserito un gene che permette alle piante di sopravvivere
all’uso di diserbanti.
Resistenza allo stress: mais con il gene MAP chinasi della
pianta Arabidopsis, che conferisce resistenza al freddo, al
caldo e alla salinità.
Resistenza ai parassiti: tabacco e zucchine con un gene del
virus del mosaico del tabacco; cotone e mais con la tossina
Bt del Bacillus thuringiensis.
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Il Golden Rice
Il Golden Rice è una varietà di riso geneticamente modificata
che esprime 4 geni batterici per la sintesi di beta-carotene, un
precursore della vitamina A.
Questa varietà di riso può
essere utile in aree povere
del mondo, dove la carenza
di vitamina A causa 800 000
morti ogni anno tra i bambini
e le donne incinte.
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Possibili problemi associati con le
coltivazioni OGM
• Possibili rischi di impollinazione incrociata con varietà
naturali.
• Possibili reazioni allergiche a proteine esogene nei
consumatori.
• Rischio di monopolio di pochi grandi produttori di semi GM.
• Legislazione eterogenea in diversi Paesi riguardo ai brevetti
sulle tecniche, sui semi e sulle varietà GM.
Al momento, dagli studi scientifici non sono emersi rischi per la
salute, ma è necessario tenere alta l’attenzione.
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Le cellule staminali
Le cellule staminali sono cellule indifferenziate, che si
possono differenziare in diversi tipi di cellule specializzate.
Nelle biotecnologie, è possibile utilizzare:
• cellule staminali embrionali;
• cellule staminali adulte;
• cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC).
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Le cellule staminali embrionali
Le cellule staminali embrionali (ESC) derivano dalla
massa cellulare interna degli embrioni nelle prime fasi di
sviluppo.
Le ESC sono pluripotenti: possono differenziarsi in molti
tipi di cellula presente nell’organismo adulto.
Il differenziamento può essere indotto con specifici fattori
di crescita.
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Le cellule staminali adulte
Le cellule staminali adulte sono precursori presenti in
diversi tessuti nell’organismo adulto, utilizzati per
rimpiazzare le cellule vecchie.
Sono multipotenti: si possono differenziare in alcuni tipi
di cellule.
Le cellule staminali emopoietiche, del midollo osseo,
possono differenziarsi in cellule mieloidi o linfoidi.
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Le cellule staminali pluripotenti indotte
Le cellule staminali pluripotenti indotte possono essere
generate a partire da cellule adulte.
La tecnica consiste nell’invertire il programma di
differenziamento, introducendo nelle cellule adulte geni che
codificano per fattori di trascrizione.
Una volta riprogrammate, possono differenziarsi in diversi tipi
di cellule.
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Le applicazioni delle cellule staminali
Le cellule staminali possono essere utilizzate:
• nei trapianti per rimpiazzare cellule malate (per
esempio, le cellule staminali emopoietiche sono usate
per rigenerare il midollo osseo nei pazienti affetti da
leucemia);
• per generare tessuti sani che possano rimpiazzare
tessuti malati nei pazienti (per esempio, nel caso del
diabete);
• per riparare tessuti danneggiati (per esempio, nel caso
di ustioni).
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